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【摘要】目的：建立榴莲壳药材中多糖的含量测定方法。方法：采用苯酚-硫酸显色法测定榴莲壳药材中多糖的含量。结果：样品经苯酚-硫酸显色后于490 nm 处测定吸收度，在此波长处溶液的吸收度与葡萄糖浓度呈良好的线性关系；线性范围40.48-141.68μg/mL，加样回收率98.78%, RSD=1.32%；榴莲壳中多糖含量15.84%。结论: 该方法简便、快速，测定结果客观、准确。
【关键词】榴莲壳 多糖 苯酚-硫酸法
榴莲(Durio zibethinus Murr)又名韶子，麝香猫果，是木棉科榴莲属长绿乔木榴莲的果实，有“热带果王”之美誉[1]。原产于印度和马来西亚，中国海南地区有栽培，始载于《新华本草纲要》。近年来，国内外对榴莲的研究除了农学和食品加工等方面外，在对榴莲不同部位的研究中发现其具有很多特有的营养和化学成分[2-3]。榴莲壳是指榴莲去除果实和外层木质硬刺后剩下的部分，因其特殊的气味常被人们当作废物废弃。现代药理研究发现榴莲壳具有止咳、镇痛、抗菌、改善微循环等多种活性[4]。本课题组前期研究发现榴莲壳多糖有良好的抗氧化、免疫调节作用，本文以榴莲壳为材料，采用苯酚-硫酸法测定榴莲壳中多糖的含量，为更好地开发利用榴莲壳提供一定的理论基础。
1仪器与试药
UV3501S型紫外分光光度计（天津拓普仪器有限公司）；JA2003型电子天平（上海良平仪器仪表有限公司）；榴莲壳收集于合肥大润发、永辉超市；葡萄糖对照品（中国药品生物制品检定所）；其余试剂均为分析纯。
2方法与结果
2.1榴莲壳多糖的提取与精制称取用70%乙醇渗漉的榴莲壳干燥粉末200 g，分别加1600mL蒸馏水煎煮2次，每次2h，滤过，合并滤液，减压浓缩至160 mL，趁热加入乙醇，使含醇量达到80%，静置过夜，减压抽滤，70℃减压干燥得榴莲壳粗多糖。
榴莲壳粗多糖热水溶解依法进行醇沉，重复2次，所得滤渣加700 mL水加热使溶解，放置，加3-4g的活性炭，再加热至沸，保温30min，滤过，滤液用正丁醇-三氯甲烷(1∶4)振摇提取3次，每次300mL，分取正丁醇-三氯甲烷层，Sevage法去除蛋白质，水溶液滤过，滤液浓缩至稠膏状，70℃减压干燥，得榴莲壳多糖。
2.2对照品溶液的制备精密称取105℃下干燥至恒重的葡萄糖标准品10.12mg，置于100mL容量瓶中定，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，摇匀即得，浓度为101.2μg /mL。
2.35%苯酚溶液的制备称取苯酚50g,加铝片0.1g和NaHCO3 0.05g,蒸馏， 收集180℃左右的馏分10g,加蒸馏水200mL溶解，放入棕色瓶中，置于冰箱中保存备用[5]。
2.4供试品溶液的制备精密称取20mg榴莲壳粗多糖置于100mL容量瓶中加蒸馏水溶解, 定容至刻度, 制成的供试品溶液。
2.5最大吸收波长的选择精密移取1mL标准品葡萄糖溶液置10mL具塞试管中，加水至2mL，再加5%苯酚1.0mL，摇匀，迅速滴加5.0mL浓硫酸，振荡摇匀后，水浴80℃加热30min，在冰水混合物迅速冷却至室温。精密吸取“2.4”项下榴莲壳多糖供试品1mL置10mL具塞试管中，按同样操作，同法用蒸馏水为空白对照。在400～700 nm进行扫描，结果供试品溶液与对照品溶液在490nm处有最大吸收峰，空白无干扰，故确定490nm为测定波长。
2.6标准曲线的制备精密吸取葡萄糖对照品溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4mL于10 mL具塞刻度试管中，用蒸馏水补至2mL，分别加入5%苯酚溶液1.0mL，摇匀，迅速滴加浓硫酸 5.0mL，盖好塞子，迅速摇匀，放入沸水浴中加热 10min ，取出，在冷水中迅速冷却至室温。另取1mL蒸馏水同法平行操作作为空白对照，在490nm波长处测定吸光度，以吸光度A为纵坐标、葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线，结果见图1。所得标准曲线回归方程为：y=0.0035x-0.1015，r=0.9992，表明无水葡萄糖浓度在40.48～141.68μg/mL范围内与吸光度呈良好的线性关系。
图1 葡萄糖标准曲线
2.7精密度实验精密吸取对照品溶液，连续测定6次其吸光度，结果RSD为0.58%，说明精密度较好。
2.8重复性实验取同一批供试品6份，分别测定吸光度，计算含量，结果RSD为1.47%，表明该方法重现性良好。
2.9稳定性试验取同一供试品溶液，分别在0、30、60、90、120、150、180min测定吸收度，考察供试品的稳定性。结果RSD为0.66%，说明稳定性良好。
2.10加样回收率实验精密称取6份含量已知的榴莲壳粗多糖20mg, 分别加入精制多糖20mg，照2.4项下方法制备供试溶液，并于490nm处测定吸光度, 计算回收率, 结果平均加样回收率为98.78%, RSD=1.32% (n=6)。
2.11换算因子的测定精密称取榴莲壳精制多糖10mg，定容于100mL容量瓶中，精密移取精制多糖的待測溶液1.0 mL，按照测定标准曲线的方法测定其吸光度，根据标准曲线计算其中的多糖浓度。按f =W/CD计算换算因子，其中W为样品质量(mg)，C为多糖浓度(mg·L-1)，D为稀释倍数，测得f=1.73(n=5)。
2.12样品含量测定精密称取榴莲壳药材粉末约10g，按2.1项下方法提取榴莲壳多糖，精密称取榴莲壳多糖20mg，按2.4项下操作配制供试品溶液，于490nm处测定其吸光度，根据标准曲线计算其中的多糖浓度，按多糖含量（%）=（C×D×f/W）×100%计算供试品中多糖的含量，测得榴莲壳多糖的质量分数为15.84%（n=5）
3结果与讨论
3.1苯酚-硫酸法为多糖含量测定的经典方法之一。苯酚的纯度、硫酸用量, 显色温度、时间等因素均会影响测定效果, 由于苯酚易氧化，应现配现用，本实验前期对各影响因子进行了单因素考察, 确定了最佳显色条件为: 1mL供试品溶液中, 加入5%苯酚溶液1.0 mL, 加入浓硫酸5.0mL，水浴80℃加热30min，在冰水混合物中迅速冷却至室温，测定吸收度。
3.2本文对该方法测定榴莲壳中多糖含量进行了系统的方法学研究，结果表明样品浓度与吸收度线性关系良好，加样回收率高，方法专属强，精密度高，稳定性好。苯酚-硫酸法测定榴莲壳多糖含量结果可靠，多糖含量为15.84%。
3.3植物多糖成分复杂、种类多，水解生成不同种类的单糖，用葡萄糖作对照不能完全反应其线性关系，计算含量时需先测定换算因子，由于榴莲壳中含有一定量的蛋白质，需对其进行脱蛋白纯化，制得精制多糖再测定换算因子，本实验测定换算因子f=1.73。
参考文献
[1] Subhadradhu S，Ketsa S. Durian，King of Tropical fruit[M].New Zealand Publishing Company，2001：178．
[2] Amin AM，Ahmad AS，YinYY，et a1. Extraction，purification and characterization of durian (Durio zibethinus) seed gum[J]．Food Hydrocolloids， 2007， 21(2)：273．
[3] Weenen H，Koolhaas WE，Apriyantono A．Sulfur-Containing Volatiles of Durian Fruits(Durio zibethinus Murr．)[J]．Joumal ofAgricuhure and Food Chemistry，1996，44(10)：329．
[4] 吴敏芝，谢果，李泳贤，等.榴莲壳提取物止咳、镇痛及抗菌作用研究[J].2010，30(4) ：793-796.
[5] 张文，周延升.黄芩多糖的提取及含量分析[J].微量元素与健康研究，2004,2（21）：21-22
基金项目：安徽省教育厅自然科学研究项目（编号：KJ2010B073）
【关键词】榴莲壳 多糖 苯酚-硫酸法
榴莲(Durio zibethinus Murr)又名韶子，麝香猫果，是木棉科榴莲属长绿乔木榴莲的果实，有“热带果王”之美誉[1]。原产于印度和马来西亚，中国海南地区有栽培，始载于《新华本草纲要》。近年来，国内外对榴莲的研究除了农学和食品加工等方面外，在对榴莲不同部位的研究中发现其具有很多特有的营养和化学成分[2-3]。榴莲壳是指榴莲去除果实和外层木质硬刺后剩下的部分，因其特殊的气味常被人们当作废物废弃。现代药理研究发现榴莲壳具有止咳、镇痛、抗菌、改善微循环等多种活性[4]。本课题组前期研究发现榴莲壳多糖有良好的抗氧化、免疫调节作用，本文以榴莲壳为材料，采用苯酚-硫酸法测定榴莲壳中多糖的含量，为更好地开发利用榴莲壳提供一定的理论基础。
1仪器与试药
UV3501S型紫外分光光度计（天津拓普仪器有限公司）；JA2003型电子天平（上海良平仪器仪表有限公司）；榴莲壳收集于合肥大润发、永辉超市；葡萄糖对照品（中国药品生物制品检定所）；其余试剂均为分析纯。
2方法与结果
2.1榴莲壳多糖的提取与精制称取用70%乙醇渗漉的榴莲壳干燥粉末200 g，分别加1600mL蒸馏水煎煮2次，每次2h，滤过，合并滤液，减压浓缩至160 mL，趁热加入乙醇，使含醇量达到80%，静置过夜，减压抽滤，70℃减压干燥得榴莲壳粗多糖。
榴莲壳粗多糖热水溶解依法进行醇沉，重复2次，所得滤渣加700 mL水加热使溶解，放置，加3-4g的活性炭，再加热至沸，保温30min，滤过，滤液用正丁醇-三氯甲烷(1∶4)振摇提取3次，每次300mL，分取正丁醇-三氯甲烷层，Sevage法去除蛋白质，水溶液滤过，滤液浓缩至稠膏状，70℃减压干燥，得榴莲壳多糖。
2.2对照品溶液的制备精密称取105℃下干燥至恒重的葡萄糖标准品10.12mg，置于100mL容量瓶中定，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，摇匀即得，浓度为101.2μg /mL。
2.35%苯酚溶液的制备称取苯酚50g,加铝片0.1g和NaHCO3 0.05g,蒸馏， 收集180℃左右的馏分10g,加蒸馏水200mL溶解，放入棕色瓶中，置于冰箱中保存备用[5]。
2.4供试品溶液的制备精密称取20mg榴莲壳粗多糖置于100mL容量瓶中加蒸馏水溶解, 定容至刻度, 制成的供试品溶液。
2.5最大吸收波长的选择精密移取1mL标准品葡萄糖溶液置10mL具塞试管中，加水至2mL，再加5%苯酚1.0mL，摇匀，迅速滴加5.0mL浓硫酸，振荡摇匀后，水浴80℃加热30min，在冰水混合物迅速冷却至室温。精密吸取“2.4”项下榴莲壳多糖供试品1mL置10mL具塞试管中，按同样操作，同法用蒸馏水为空白对照。在400～700 nm进行扫描，结果供试品溶液与对照品溶液在490nm处有最大吸收峰，空白无干扰，故确定490nm为测定波长。
2.6标准曲线的制备精密吸取葡萄糖对照品溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4mL于10 mL具塞刻度试管中，用蒸馏水补至2mL，分别加入5%苯酚溶液1.0mL，摇匀，迅速滴加浓硫酸 5.0mL，盖好塞子，迅速摇匀，放入沸水浴中加热 10min ，取出，在冷水中迅速冷却至室温。另取1mL蒸馏水同法平行操作作为空白对照，在490nm波长处测定吸光度，以吸光度A为纵坐标、葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线，结果见图1。所得标准曲线回归方程为：y=0.0035x-0.1015，r=0.9992，表明无水葡萄糖浓度在40.48～141.68μg/mL范围内与吸光度呈良好的线性关系。
图1 葡萄糖标准曲线
2.7精密度实验精密吸取对照品溶液，连续测定6次其吸光度，结果RSD为0.58%，说明精密度较好。
2.8重复性实验取同一批供试品6份，分别测定吸光度，计算含量，结果RSD为1.47%，表明该方法重现性良好。
2.9稳定性试验取同一供试品溶液，分别在0、30、60、90、120、150、180min测定吸收度，考察供试品的稳定性。结果RSD为0.66%，说明稳定性良好。
2.10加样回收率实验精密称取6份含量已知的榴莲壳粗多糖20mg, 分别加入精制多糖20mg，照2.4项下方法制备供试溶液，并于490nm处测定吸光度, 计算回收率, 结果平均加样回收率为98.78%, RSD=1.32% (n=6)。
2.11换算因子的测定精密称取榴莲壳精制多糖10mg，定容于100mL容量瓶中，精密移取精制多糖的待測溶液1.0 mL，按照测定标准曲线的方法测定其吸光度，根据标准曲线计算其中的多糖浓度。按f =W/CD计算换算因子，其中W为样品质量(mg)，C为多糖浓度(mg·L-1)，D为稀释倍数，测得f=1.73(n=5)。
2.12样品含量测定精密称取榴莲壳药材粉末约10g，按2.1项下方法提取榴莲壳多糖，精密称取榴莲壳多糖20mg，按2.4项下操作配制供试品溶液，于490nm处测定其吸光度，根据标准曲线计算其中的多糖浓度，按多糖含量（%）=（C×D×f/W）×100%计算供试品中多糖的含量，测得榴莲壳多糖的质量分数为15.84%（n=5）
3结果与讨论
3.1苯酚-硫酸法为多糖含量测定的经典方法之一。苯酚的纯度、硫酸用量, 显色温度、时间等因素均会影响测定效果, 由于苯酚易氧化，应现配现用，本实验前期对各影响因子进行了单因素考察, 确定了最佳显色条件为: 1mL供试品溶液中, 加入5%苯酚溶液1.0 mL, 加入浓硫酸5.0mL，水浴80℃加热30min，在冰水混合物中迅速冷却至室温，测定吸收度。
3.2本文对该方法测定榴莲壳中多糖含量进行了系统的方法学研究，结果表明样品浓度与吸收度线性关系良好，加样回收率高，方法专属强，精密度高，稳定性好。苯酚-硫酸法测定榴莲壳多糖含量结果可靠，多糖含量为15.84%。
3.3植物多糖成分复杂、种类多，水解生成不同种类的单糖，用葡萄糖作对照不能完全反应其线性关系，计算含量时需先测定换算因子，由于榴莲壳中含有一定量的蛋白质，需对其进行脱蛋白纯化，制得精制多糖再测定换算因子，本实验测定换算因子f=1.73。
参考文献
[1] Subhadradhu S，Ketsa S. Durian，King of Tropical fruit[M].New Zealand Publishing Company，2001：178．
[2] Amin AM，Ahmad AS，YinYY，et a1. Extraction，purification and characterization of durian (Durio zibethinus) seed gum[J]．Food Hydrocolloids， 2007， 21(2)：273．
[3] Weenen H，Koolhaas WE，Apriyantono A．Sulfur-Containing Volatiles of Durian Fruits(Durio zibethinus Murr．)[J]．Joumal ofAgricuhure and Food Chemistry，1996，44(10)：329．
[4] 吴敏芝，谢果，李泳贤，等.榴莲壳提取物止咳、镇痛及抗菌作用研究[J].2010，30(4) ：793-796.
[5] 张文，周延升.黄芩多糖的提取及含量分析[J].微量元素与健康研究，2004,2（21）：21-22
基金项目：安徽省教育厅自然科学研究项目（编号：KJ2010B073）