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目的间充质干细胞在皮肤及附属器创伤后的修复再生过程中发挥重要作用。然而,其作用机制尚未完全阐明。因此,深入探究创面对募集间充质干细胞并诱导其初步分化的影响,归巢间充质干细胞的旁分泌效应对创面愈合的作用,以及间充质干细胞重编程为汗腺样细胞的途径和机制,有利于引导皮肤创伤部位多组织同时有序的修复再生。为实现结构和功能兼具的完美修复提供实验依据。方法1.对空白组和创面组小鼠分别回输以红色荧光探针标记间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)后,免疫荧光及流式细胞术分别检测MSCs的归巢情况。同时,不同周龄小鼠在形成全层皮肤缺失创面后2天,分别分离骨髓及外周血来源的MSCs,流式细胞术检测CD29,CD44,CD90和CD105的表达以评估其干性,检测OPN,Nestin,Myosin和CK19的表达以明确其分化方向。2.微珠法检测MSCs培养上清中的主要活性分子,流式细胞术检测MSCs 培养上清对人表皮细胞(Human immortalized keratinocyte,HaCaT)的活性,细胞周期,凋亡的影响。划痕实验,RT-qPCR,Western blot,免疫荧光检测MSCs培养上清对HaCaT细胞EMT样改变的影响。建立小鼠全层皮肤缺失创面模型,检测MSCs培养上清在体内对愈合速度的影响。3.利用CRISPR/dCas9技术,预测人外胚层发育不良蛋白(ectodysplasin,EDA)启动子序列,包装含有sgRNA的慢病毒并感染MSCs细胞,RT-qPCR,Western blot,免疫荧光检测汗腺细胞相关标志物的表达情况,透射电镜检测细胞超微结构。Western blot及免疫荧光检测相关信号分子活性及细胞内定位。制备小鼠脚掌烫伤模型,检测移植dCas9-E-MSC后小鼠脚掌的发汗能力。结果1.创面组织切片免疫荧光可见红色荧光信号,流式细胞术检测结果也证实创面组织中标记的MSCs数量升高。同时,在不同周龄小鼠的创面模型中,骨髓及外周血中MSCs表面标志物与空白组相比表达CD29,CD44,CD90,CD105变化不大,分化标志物中,OPN,Myosin表达趋势与空白组基本一致,而Nestin和CK19较空白对照组升高明显。2.微珠实验证实TGF-β是MSCs培养上清中的主要活性分子。MSCs培养上清能促进HaCaT细胞增殖和迁移,RT-qPCR,Western blot和免疫荧光结果显示MSCs培养上清能诱导HaCaT细胞发生EMT样改变,而TGF-β特异性抑制剂SB-431542能够逆转此种变化。动物实验结果显示注射MSCs培养上清能够加速皮肤创面愈合。3.成功预测EDA基因启动子序列并构建含有sgRNA序列的慢病毒,筛选得到的阳性细胞株经RT-qPCR,Western blot和免疫荧光实验检测证实CEA,CK19等汗腺标志物阳性,透射电镜显示其具有绒毛结构。小鼠脚掌烫伤模型证实该细胞株具备发汗能力。RT-qPCR,Western blot和免疫荧光显示EDA表达可激活NF-κB,进而促进Shh及CyclinD1在细胞中的表达。结论皮肤创伤发生后,创面组织能募集MSCs经外周循环发生归巢,并能够诱导MSCs向成神经和成皮肤方向初步分化。归巢至创面组织的MSCs可通过旁分泌效应调节局部微环境,其分泌的主要活性分子TGF-β通过激活TGF-β/Smad信号通路加速表皮细胞的EMT过程,从而促进创面愈合。同时,利用CRISPR/dCas9技术能够直接重编程MSCs为汗腺样细胞,解决创面愈合后局部汗腺再生的难题,为探索创伤后多组织同步再生,实现完美修复提供理论依据。