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【中图分类号】R378.9 【文献标识码】A 【文章编号】1672-3783（2013）12-0186-01
【摘要】耐药结核病是全世界结核病疫情第三次回升的重要原因，结核病耐多药菌株的出现增加了结核病治疗的难度，目前，用于结核病治疗的一线要主要是利福平和异烟肼。异烟肼耐药机制非常复杂，与之耐药相关的基因较多，如：katG，inhA，aphC，kasA，ndh等。其中最主要的耐药基因为katG 、inhA 基因。利福平相关耐药基因研究较为明确，目前认为rpoB基因的突变是MDR-MTB菌株的标志。迄今为止，对利福平和异烟肼抗结核分支杆菌耐药性的检测方法有多种，实际工作中需要将多种检测方法同时运用，以使检测结果真实可信，及时为临床治疗提供有效的依据。
【关键词】耐药结核病；利福平，异烟肼；耐药基因；检测方法
肺结核是世界上主要的公共卫生问题，是严重危害人类身体健康的传染性疾病之一。二十世纪五、六十年代人们便期望找到一种有效的方法来控制肺结核的传染，最后达到治愈结核病的目的，但目前肺结核仍是一个全球性的流行病，成为全球性的公共卫生问题，每年大概有2-3百万的人死于这种疾病。近年来，肺结核在艾滋病患者中的广泛传播再一次引起了公众的关注1，耐药结核杆菌尤其是耐多药结核杆菌的出现和传播是导致结核病发病率升高的重要原因。本文就结核杆菌对利福平和异烟肼产生耐药性的相关基因，以及耐药性检测的方法做一综述2。
1 异烟肼
异烟肼（isoniazid，INH），是抗结核病的常用一线药物，在结核病的治疗中一直起着重要的作用。但大多数结核病患者如果长期用药易产生耐药性，这主要是由于长期使用INH可诱导细菌产生基因突变，从而使细菌对INH的耐药性增强。有研究表明 。
1.1 katG 基因是过氧化氢酶‐过氧化物酶的编码基因，katG基因全长2223个核苷酸，上游与相隔44个碱基的furA基因（一种结核杆菌铁调控蛋白编码基因，可能为katG基因的启动子，并调控其表达）相连，下游与相隔2794个碱基的embC基因相连。katG 基因最常见的点突变位点是第315位氨基酸和第463 位氨基酸。其常见的点突变是315位AGC→ACC和463位CGG→CTG。katG基因315位突变通常会造成过氧化氢一氧化物酶活性的降低，造成中等水平到高水平的耐药。在C. Yao1， T. Zhu2， Y. Li1， L. Zhang1， B. Zhang1， J. Huang1 and W. Fu 的研究中选取了41个样本，其中32个分离株的突变是AGC→ACC，9个分离株的突变是AGC→AAC。此外还有研究发现katG基因104、108、138、148位等突变。因而katG基因序列改变的具体位点与katG酶的活性的改变还有待进一步的研究。
1.2 inhA 基因是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）依赖的enoyl‐ACP 还原酶的编码基因。当活化的INH（异烟碱酰基）与inhA酶（enoyl-ACP还原酶）活性部位的辅因子NAD结合后，生成高亲和力的共价化合物，而削弱了NADH和enoyl-ACP还原酶的亲和力，进而干扰了脂酸的合成，从而发挥抗菌作用。inhA 基因突变约占异烟肼临床耐药株的8% ～ 20% ，耐药的发生可由于inhA结构基因突变造成INH与NADH的亲和力下降，或是inhA启动子-15的C→T的点突变，引起对INH耐药。与katG基因突变相比较，inhA基因的突变伴随低水平INH耐药性，InhA的突变不仅引起INH耐药，还会引起结构相近的二线抗结核药物乙硫异烟（ETH）的耐药性，而katG突变后耐药水平的高低取决于基因突变对过氧化氢—过氧化物酶活性的影响，突变导致酶活性完全丧失可引起高度INH耐药。
1.3 kasA 基因，ahpC基因和ndh基因
kasA 基因编码β‐酮酰基载体蛋白合成酶，与分枝菌酸生物合成相关，是异烟肼耐药的另一个相关基因，最常见的突变是第312位点。ahpC 基因是烯酰基还原酶的编码基因，参与氧化-应激应答的表达，它能控制解毒酶基因的如katG 基因的表达。Dhandayuthapani[9]等发现部分katG突变的耐异烟肼分离株存在ahpC启动子（存在于oxyR-ahpC区）突变，增强ahpC表达来补偿过氧化氢酶一过氧化物酶的缺乏，从而抵抗宿主巨噬细胞的氧化。ndh 基因能编码NADH 脱氢酶，ndh 基因的突变使NADH 脱氢酶活性受到抑制，使NADH/NAD 比率升高，抑制异烟肼的过氧化，也阻止异烟酰乙酸NADH 与inhA 酶的结合，从而使结核杆菌产生耐药性。katG、inhA、kasA 、ahpC和ndh基因突变并不能解释所有的异烟肼耐药问题，相关的机制还有待进一步研究。
随着异烟肼耐药相关基因和耐药机制的深入研究，其敏感性必定会得到较大提高。
2 利福平
利福平是抗结核病多药联合方案中的主要成分之一，其主要作用对象是结核分枝杆菌DNA 依赖的RNA 聚合酶的β 亚基，通过抑制mRNA 的转录，发挥抗菌作用，与之相关的耐药基因主要是其编码基因rpoB。rpoB基因是结核杆菌DNA依赖RNA聚合酶β亚单位的编码基因，全长3543个碱基，95%左右的RFP耐药菌株的基因突变都集中在rpoB基因507～533位的27个氨基酸（81bp）组成的区域，这一突变区被称为利福平耐药决定区（RRDR）。当RRDR发生突变时，包括点突变或短的插入、缺失突变等，使DNA依赖性RNA聚合酶B亚单位酶结构改变，利福平不能与细菌RNA聚合酶β亚单位结合而表现为耐药。已知RFP耐药菌的rpoB基因有14种突变，其中9种突变对利福布丁和利福喷丁交叉耐药。531、526位点突变株对所有利福霉素类药物均高度耐药。到目前为止，利福平相关耐药基因研究已较明确，其中以编码531位氨基酸的碱基TCG→TTG的和编码526位氨基酸的碱基CAC→TAC的突变最常见，因此这个区域的突变可作为一种检测结核杆菌耐RFP简易、快速的方法。在临床分离的MDR-MTB中，86%的耐药株有rpoB基因的突变，因此认为rpoB基因的突变是MDR-MTB菌株的标志。 3耐药性的检测方法
迄今为止，对利福平和异烟肼抗结核分支杆菌耐药性的检测方法有多种。变色液体培养基法3利用选择性培养基颜色的改变以检测结核分枝杆菌的耐药性。MTT检测法4 5也被用于结核分枝杆菌耐药性的检测，MTT是黄色四唑盐燃料能在有代谢活性的细胞内被脱氢酶降解产生紫色的甲月替，进而通过分光光度计（570nm）检测吸收光的变化。SYBR Green I-based real-time定量PCR检测法6也被用于结核分枝杆菌耐药性的检测。随着分子生物学的进一步发展，The GenoType MTBDRplus assay7是目前在结核分枝杆菌耐药性的检测中应用最为广泛的一种方法，与传统的检测方法相比较，该方法更能快速的检测出耐药的突变基因，但Jin8 等的研究表明，虽然The GenoType MTBDRplus assay具有较强的优越性，但在其研究中发现一个较罕见的katG S315N突变却不在这一检测方法内。
随着结核分支杆菌耐药性的不断增强以及新型耐药菌株的不断出现，目前如果只单纯的运用某一方法来进行检测是不能得到准确可信的结果，因而我们要将多种检测方法同时运用，以使检测结果真实可信为结核分枝杆菌耐药的检测提供优效的证据。
4 展望
结核病耐多药菌株的出现增加了结核病治疗的难度，而耐药机制是治疗的关键，随着分子生物学技术的发展，耐药机制的研究得到了有效的提高。结核病耐多药菌株主要是由于基因的突变引起，及时对患者的突变菌株进行检测为临床的治疗将提供有效的治疗依据，从而减轻患者的病情，为进一步治疗和控制耐多药结核病提供了有效的手段。
参考文献
[1].
[2]Visalakshi， P.， Meharwal， S. K.， Myneedu， V. P. & Behera， D. Evaluation of direct method of drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis to rifampicin and isoniazid by nitrate reductase assay in a national reference laboratory. Diagnostic microbiology and infectious disease 66， 148-152， doi：10.1016/j.diagmicrobio.2009.09.008 （2010）.
[3]Toit， K. et al. The Colour Test for drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis strains. The international journal of tuberculosis and lung disease ： the official journal of the International Union against Tuberculosis and Lung Disease 16， 1113-1118， doi：10.5588/ijtld.11.0609 （2012）.
[4].
[5].
[6]Hsueh， C.-W. et al. Quantitative diagnosis and analysis of mutations affecting drug resistance to rifampicin and isoniazid of clinical Mycobacterium tuberculosis isolates in Taiwan. Annals of Microbiology 60， 391-397， doi：10.1007/s13213-010-0054-z （2010）.
[7]Chryssanthou， E. & Angeby， K. The GenoType（R） MTBDRplus assay for detection of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis in Sweden. APMIS ： acta pathologica， microbiologica， et immunologica Scandinavica 120， 405-409， doi：10.1111/j.1600-0463.2011.02845.x （2012）.
[8]Jin， J. et al. Evaluation of the GenoType（R） MTBDRplus assay and identification of a rare mutation for improving MDR-TB detection. The international journal of tuberculosis and lung disease ： the official journal of the International Union against Tuberculosis and Lung Disease 16， 521-526， doi：10.5588/ijtld.11.0269 （2012）.
【摘要】耐药结核病是全世界结核病疫情第三次回升的重要原因，结核病耐多药菌株的出现增加了结核病治疗的难度，目前，用于结核病治疗的一线要主要是利福平和异烟肼。异烟肼耐药机制非常复杂，与之耐药相关的基因较多，如：katG，inhA，aphC，kasA，ndh等。其中最主要的耐药基因为katG 、inhA 基因。利福平相关耐药基因研究较为明确，目前认为rpoB基因的突变是MDR-MTB菌株的标志。迄今为止，对利福平和异烟肼抗结核分支杆菌耐药性的检测方法有多种，实际工作中需要将多种检测方法同时运用，以使检测结果真实可信，及时为临床治疗提供有效的依据。
【关键词】耐药结核病；利福平，异烟肼；耐药基因；检测方法
肺结核是世界上主要的公共卫生问题，是严重危害人类身体健康的传染性疾病之一。二十世纪五、六十年代人们便期望找到一种有效的方法来控制肺结核的传染，最后达到治愈结核病的目的，但目前肺结核仍是一个全球性的流行病，成为全球性的公共卫生问题，每年大概有2-3百万的人死于这种疾病。近年来，肺结核在艾滋病患者中的广泛传播再一次引起了公众的关注1，耐药结核杆菌尤其是耐多药结核杆菌的出现和传播是导致结核病发病率升高的重要原因。本文就结核杆菌对利福平和异烟肼产生耐药性的相关基因，以及耐药性检测的方法做一综述2。
1 异烟肼
异烟肼（isoniazid，INH），是抗结核病的常用一线药物，在结核病的治疗中一直起着重要的作用。但大多数结核病患者如果长期用药易产生耐药性，这主要是由于长期使用INH可诱导细菌产生基因突变，从而使细菌对INH的耐药性增强。有研究表明 。
1.1 katG 基因是过氧化氢酶‐过氧化物酶的编码基因，katG基因全长2223个核苷酸，上游与相隔44个碱基的furA基因（一种结核杆菌铁调控蛋白编码基因，可能为katG基因的启动子，并调控其表达）相连，下游与相隔2794个碱基的embC基因相连。katG 基因最常见的点突变位点是第315位氨基酸和第463 位氨基酸。其常见的点突变是315位AGC→ACC和463位CGG→CTG。katG基因315位突变通常会造成过氧化氢一氧化物酶活性的降低，造成中等水平到高水平的耐药。在C. Yao1， T. Zhu2， Y. Li1， L. Zhang1， B. Zhang1， J. Huang1 and W. Fu 的研究中选取了41个样本，其中32个分离株的突变是AGC→ACC，9个分离株的突变是AGC→AAC。此外还有研究发现katG基因104、108、138、148位等突变。因而katG基因序列改变的具体位点与katG酶的活性的改变还有待进一步的研究。
1.2 inhA 基因是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）依赖的enoyl‐ACP 还原酶的编码基因。当活化的INH（异烟碱酰基）与inhA酶（enoyl-ACP还原酶）活性部位的辅因子NAD结合后，生成高亲和力的共价化合物，而削弱了NADH和enoyl-ACP还原酶的亲和力，进而干扰了脂酸的合成，从而发挥抗菌作用。inhA 基因突变约占异烟肼临床耐药株的8% ～ 20% ，耐药的发生可由于inhA结构基因突变造成INH与NADH的亲和力下降，或是inhA启动子-15的C→T的点突变，引起对INH耐药。与katG基因突变相比较，inhA基因的突变伴随低水平INH耐药性，InhA的突变不仅引起INH耐药，还会引起结构相近的二线抗结核药物乙硫异烟（ETH）的耐药性，而katG突变后耐药水平的高低取决于基因突变对过氧化氢—过氧化物酶活性的影响，突变导致酶活性完全丧失可引起高度INH耐药。
1.3 kasA 基因，ahpC基因和ndh基因
kasA 基因编码β‐酮酰基载体蛋白合成酶，与分枝菌酸生物合成相关，是异烟肼耐药的另一个相关基因，最常见的突变是第312位点。ahpC 基因是烯酰基还原酶的编码基因，参与氧化-应激应答的表达，它能控制解毒酶基因的如katG 基因的表达。Dhandayuthapani[9]等发现部分katG突变的耐异烟肼分离株存在ahpC启动子（存在于oxyR-ahpC区）突变，增强ahpC表达来补偿过氧化氢酶一过氧化物酶的缺乏，从而抵抗宿主巨噬细胞的氧化。ndh 基因能编码NADH 脱氢酶，ndh 基因的突变使NADH 脱氢酶活性受到抑制，使NADH/NAD 比率升高，抑制异烟肼的过氧化，也阻止异烟酰乙酸NADH 与inhA 酶的结合，从而使结核杆菌产生耐药性。katG、inhA、kasA 、ahpC和ndh基因突变并不能解释所有的异烟肼耐药问题，相关的机制还有待进一步研究。
随着异烟肼耐药相关基因和耐药机制的深入研究，其敏感性必定会得到较大提高。
2 利福平
利福平是抗结核病多药联合方案中的主要成分之一，其主要作用对象是结核分枝杆菌DNA 依赖的RNA 聚合酶的β 亚基，通过抑制mRNA 的转录，发挥抗菌作用，与之相关的耐药基因主要是其编码基因rpoB。rpoB基因是结核杆菌DNA依赖RNA聚合酶β亚单位的编码基因，全长3543个碱基，95%左右的RFP耐药菌株的基因突变都集中在rpoB基因507～533位的27个氨基酸（81bp）组成的区域，这一突变区被称为利福平耐药决定区（RRDR）。当RRDR发生突变时，包括点突变或短的插入、缺失突变等，使DNA依赖性RNA聚合酶B亚单位酶结构改变，利福平不能与细菌RNA聚合酶β亚单位结合而表现为耐药。已知RFP耐药菌的rpoB基因有14种突变，其中9种突变对利福布丁和利福喷丁交叉耐药。531、526位点突变株对所有利福霉素类药物均高度耐药。到目前为止，利福平相关耐药基因研究已较明确，其中以编码531位氨基酸的碱基TCG→TTG的和编码526位氨基酸的碱基CAC→TAC的突变最常见，因此这个区域的突变可作为一种检测结核杆菌耐RFP简易、快速的方法。在临床分离的MDR-MTB中，86%的耐药株有rpoB基因的突变，因此认为rpoB基因的突变是MDR-MTB菌株的标志。 3耐药性的检测方法
迄今为止，对利福平和异烟肼抗结核分支杆菌耐药性的检测方法有多种。变色液体培养基法3利用选择性培养基颜色的改变以检测结核分枝杆菌的耐药性。MTT检测法4 5也被用于结核分枝杆菌耐药性的检测，MTT是黄色四唑盐燃料能在有代谢活性的细胞内被脱氢酶降解产生紫色的甲月替，进而通过分光光度计（570nm）检测吸收光的变化。SYBR Green I-based real-time定量PCR检测法6也被用于结核分枝杆菌耐药性的检测。随着分子生物学的进一步发展，The GenoType MTBDRplus assay7是目前在结核分枝杆菌耐药性的检测中应用最为广泛的一种方法，与传统的检测方法相比较，该方法更能快速的检测出耐药的突变基因，但Jin8 等的研究表明，虽然The GenoType MTBDRplus assay具有较强的优越性，但在其研究中发现一个较罕见的katG S315N突变却不在这一检测方法内。
随着结核分支杆菌耐药性的不断增强以及新型耐药菌株的不断出现，目前如果只单纯的运用某一方法来进行检测是不能得到准确可信的结果，因而我们要将多种检测方法同时运用，以使检测结果真实可信为结核分枝杆菌耐药的检测提供优效的证据。
4 展望
结核病耐多药菌株的出现增加了结核病治疗的难度，而耐药机制是治疗的关键，随着分子生物学技术的发展，耐药机制的研究得到了有效的提高。结核病耐多药菌株主要是由于基因的突变引起，及时对患者的突变菌株进行检测为临床的治疗将提供有效的治疗依据，从而减轻患者的病情，为进一步治疗和控制耐多药结核病提供了有效的手段。
参考文献
[1]
[2]Visalakshi， P.， Meharwal， S. K.， Myneedu， V. P. & Behera， D. Evaluation of direct method of drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis to rifampicin and isoniazid by nitrate reductase assay in a national reference laboratory. Diagnostic microbiology and infectious disease 66， 148-152， doi：10.1016/j.diagmicrobio.2009.09.008 （2010）.
[3]Toit， K. et al. The Colour Test for drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis strains. The international journal of tuberculosis and lung disease ： the official journal of the International Union against Tuberculosis and Lung Disease 16， 1113-1118， doi：10.5588/ijtld.11.0609 （2012）.
[4]
[5]
[6]Hsueh， C.-W. et al. Quantitative diagnosis and analysis of mutations affecting drug resistance to rifampicin and isoniazid of clinical Mycobacterium tuberculosis isolates in Taiwan. Annals of Microbiology 60， 391-397， doi：10.1007/s13213-010-0054-z （2010）.
[7]Chryssanthou， E. & Angeby， K. The GenoType（R） MTBDRplus assay for detection of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis in Sweden. APMIS ： acta pathologica， microbiologica， et immunologica Scandinavica 120， 405-409， doi：10.1111/j.1600-0463.2011.02845.x （2012）.
[8]Jin， J. et al. Evaluation of the GenoType（R） MTBDRplus assay and identification of a rare mutation for improving MDR-TB detection. The international journal of tuberculosis and lung disease ： the official journal of the International Union against Tuberculosis and Lung Disease 16， 521-526， doi：10.5588/ijtld.11.0269 （2012）.