【摘 要】
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目的 构建人颗粒溶素(GNLY)质粒,进行原核表达,纯化得到相对分子质量9 000目的 片段,免疫新西兰大白兔得到兔抗GNLY多克隆抗体.方法分离外周血单个核细胞,用卡介苗和白细胞介
【机 构】
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上海第二军医大学附属长征医院实验诊断科,上海,200003
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目的 构建人颗粒溶素(GNLY)质粒,进行原核表达,纯化得到相对分子质量9 000目的 片段,免疫新西兰大白兔得到兔抗GNLY多克隆抗体.方法分离外周血单个核细胞,用卡介苗和白细胞介素-2(IL-2)刺激,培养12 d.抽提细胞RNA,通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)获得含有222 bp的GNLY cDNA,克隆到pMD18-T载体,测序正确后再亚克隆到质粒pET28a(+)中,得到重组质粒pET28a(+)-GNLY并将其转化大肠杆菌,诱导表达后用镍(Ni)亲和层析纯化,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹试验(Western blot)进行鉴定.用纯化的蛋白免疫新西兰大白兔,得到抗-GNLY特异性多抗.结果成功构建了pET28a(+)-GNLY表达质粒.用大肠杆菌表达带6个组氨酸的融合蛋白并进行纯化,最后免疫兔得到抗-GNLY特异性多抗,并经Western blot验证正确.结论获得了纯化的GNLY蛋白和抗-GNLY多抗血清,为今后对疾病中细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和自然杀伤(NK)细胞活性的研究打下了基础.
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