论文部分内容阅读
摘要：目的：建立益气复脉胶囊中五味子醇甲含量的反相高效液相色谱法（RP-HPLC）测定方法。方法：采用Shimadzu VP-ODS （150 mm×4.6 mm， 5 μm）为色谱柱，填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相为甲醇-水（65∶35），检测波长为 250 nm，流速为 1.0 mL/min，柱温为 30 ℃，测定其含量。结果：五味子醇甲浓度在 10.60～31.80 μg/mL 范围内，其直线回归方程为 A=91 289 C+10 392（r=0.999 9），呈现良好的线性关系，平均回收率为 100.06%。 结论：本法操作简便，分离效果与重现性较好，适用于益气复脉胶囊中五味子醇甲的含量测定。
关键词：HPLC；益气复脉胶囊；五味子醇甲；质量控制
为控制益气复脉胶囊的质量指标，笔者建立了益气复脉胶囊中北五味子主要成分五味子醇甲的反相高效液相色谱法（RP-HPLC）含量测定方法，以有效控制该制剂的质量，为新药开发提供试验数据。
1.仪器和试剂
1.1仪器
SPD-10Avp检测器（日本岛津）、LC-10ATvp高压泵（日本岛津）、工作站：N2010色谱工作站（浙江大学智能信息工程研究院）、UV-1700型紫外分光光度计（日本岛津）。
1.2试剂与用药
乙醚、甲醇（色谱纯）、超纯水、五味子对照品（由中国药品生物制品检定所提供，批号：110857-200405供含量测定用）。
益气复脉胶囊：海口奇力制药有限公司生产。规格：每粒重0.37g，批号：120201。
2.方法與结果
2.1色谱条件的选择
2.1.1检测波长的选择
取五味子醇甲对照品适量，加流动相溶解并稀释制成一定浓度的溶液。取上述溶液，以流动相为空白，在200nm～400nm范围内扫描，试验结果表明五味子醇甲在250nm处附近有最大吸收。同时，参考中国药典2005年版一部五味子药材标准中五味子醇甲含量测定的检测方法，拟选用250nm作为本品检测波长的选择。
2.1.2流动相的选择
流动相1：甲醇-水=73：27；检测波长为250nm。色谱柱为Shimadzu VP-ODS （150×4.6mm）（日本岛津），进行检测，结果五味子醇甲色谱峰的保留时间为4.399min，与相邻杂峰的分离度为1.177〈1.5，拖尾因子为1.050，理论塔板数为3709.8>2500；试验结果表明色谱条件不能满足含量测定的要求，因此暂不选用该流动相体系。
流动相2：甲醇-水=65：35；检测波长为250nm。色谱柱为Shimadzu VP-ODS （150×4.6mm）（日本岛津），进行检测，结果五味子醇甲色谱峰的保留时间为6.886min，分离度为5.278，拖尾因子为0.994，理论塔板数为3001.4>2500；试验结果表明该色谱条件可满足含量测定的要求，因此，决定选用该流动相体系。
2.2色谱条件与系统适用性试验
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以Shimadzu VP-ODS （150×4.6mm）（日本岛津）为色谱柱；流动相为甲醇-水=65：35；检测波长为250nm，流速：1.0ml/min，柱温：30℃。理论板数按五味子醇甲峰计应不低于2500，五味子醇甲峰与各其他成分峰的分离度应符合要求。
2.3溶剂空白试验
取甲醇20ul注入液相色谱仪。试验结果表明溶剂对本品含量测定无干扰。
2.4阴性样品试验
按处方工艺自制成不含五味子药材的阴性样品，同含量测定项下供试品溶液的制备方法，制备成阴性样品溶液。取20ul注入液相色谱仪。试验结果表明阴性样品溶液对本品含量测定无干扰。
2.5线性关系试验
精密称取于60℃真空干燥至恒重的五味子醇甲对照品5.3mg，置于50ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成母液。分别精密量取上述母液1.0、1.5、2.0、2.5、3.0ml置于10ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度。取上述溶液各20ul注入液相色谱仪，记录色谱图，结果见表1.1，如下图：
表1.1 线性关系试验结果
经线性回归分析，在10.60～31.80μg/ml范围内，直线方程Y=91289x+10392，r=0.9999，线性关系良好。
2.6进样精密度试验
取重复性试验项下的一份供试液，连续进样6针，记录色谱图。试验测定结果见表1.2：
表1.2 进样精密度测定结果
试验结果表明，其RSD%为0.23%<2.0%，进样精密度能满足本品的含量测定要求。
2.7重复性试验
试验结果表明：其RSD%为1.61为<2.0%，本法测定结果重复性较好，符合含量测定的要求。
2.8溶液稳定性试验
取重复性试验项下的一份供试液，分别于0、2、4、6、8、12h取样20ul注入液相色谱仪，记录色谱图。试验结果表明，其RSD%为0.17%< 2.0%，说明样品室温条件下放置12h，溶液稳定。
2.9准确度试验
精密称取已知含量为0.638 mg/g的本品6份，每份约0.4g，分别置25ml容量瓶中，分别加入五味子醇甲对照品溶液 （0.053mg/ml） 5ml，按拟定含量测定项下供试品溶液处理方法处理，所得溶液作为供试品溶液。照含量测定项下的方法进行试验，测定回收率。本品回收率为100.06%，其RSD%为1.16%<2.0%试验结果表明本法准确度较好，符合含量测定的要求。
2.10含量测定方法的确定 2.10.1色谱条件与系统适用性试验
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水=65：35为流动相；Shimadzu VP-ODS （150×4.6mm）（日本岛津）为色谱柱；检测波长为250nm；流速为1.0ml/min；柱温为30℃。理论板数按五味子醇甲峰计应不低于2500[7]。
2.10.2对照品溶液的制备
精密称取五味子醇甲对照品5.0mg，置50ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度。精密吸取上述溶液5ml至25ml量瓶中，用甲醇定容，即可。（每1ml溶液中含五味子醇甲20.00μg）。
2.10.3供试品溶液的制备
取重量差异项下的本品，研细，精密称定约0.8g，置25ml量瓶中，加水约20ml，超声处理使完全溶散，放冷，加水稀释至刻度，摇匀。精密量取上述溶液10ml，置分液漏斗中，用乙醚提取5次，每次15ml，合并醚液，用水洗涤2次，每次10ml，水洗涤液再用乙醚10ml回提一次，合并醚液，60℃～80℃减压浓缩至干，残渣加甲醇适量使溶解，并分次转移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，即得。
2.10.4测定法
分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
2.10.5含量测定结果
精密称取样品，照含量测定项下的方法测定，结果见下表1.6。
表1.6 五味子醇甲含量测定结果（n=2）
3讨论和结论
益气复脉胶囊是由红参、麦冬、北五味子3味常用中药组成的，是临床治疗冠心病的一种治疗或辅助治疗的有效药。现代医学药理作用研究表明[2]：本处方中人参能改善心肌的代谢，增加心肌能量储备，促进DNA和RNA的合成，提高机体耐缺氧能力，从而增强心肌收缩力，扩张外周血管。特别对衰竭或中毒的心脏作用更为明显。并且红参能够提高血浆cAMP值，抑制血小板聚集，降低血浆中纤维蛋白原，清除微血栓，起到改善微循环的作用。人参还可抑制Na+-K+-ATP酶的活性，影响Na+-K+和Na+-Ca2+的交换，使Ca2+内流增加，从而增加心肌收缩力，降低血管阻力，还可清除自由基，增加心肌抗缺氧能力，并兼有抗心律失常作用，同时还具有调节免疫功能的反应。麥冬可稳定细胞膜，能够提高机体的耐缺氧能力；扩张周围血管，减轻心脏负荷，具有正性肌力的作用。五味子能增强机体对各种刺激的非特异性抵抗能力，三药协同应用具有扩血管，增强冠脉血流量和心肌营养血流量，强心，改善心肌组织代谢，促进损伤心肌功能恢复的作用，可以从根本上改善心肌功能。实验研究也证实[3]，益气复脉胶囊对实验性休克有保护、强心、升压作用；并能改善微循环，提高心肌耐缺氧功能。
3.1讨论
3.1.1检测波长的选择
本实验检测波长为250nm，是根据紫外测定。在250nm处，五味子醇甲具有最大吸收峰，选择此处波长，所得结果最明显，结果容易判断。
3.1.2流动相的选择
本文在选择流动相方面对两种流动相进行了尝试。其中流动相1：甲醇-水（73：27），检测的结果中保留时间、分离度、拖尾因子和理论塔板数等不满足含量测定的要求，故不能使用流动相1；而流动相2所检测的结果可满足含量测定要求，因此，决定选用该流动相体系。
3.2结论
经过线性关系、精密度、重复性、稳定性、准确度等试验，证明HPLC法操作简便、准确、快速，是测定益气复脉胶囊中北五味子的五味子醇甲的含量的理想方法。
参考文献：
[1] 杨晓敏. 冠心病心绞痛中医药治疗进展. 临床合理用药，2013；6（8）：1
[2] 周军.生脉注射液治疗气阴两虚型冠心病心绞痛 60 例.中国中医药现代远程教育，2013；11（3）：28～29
[3] 刘小娟，苏丹，路秀云，等. 生脉胶囊的临床应用研究进展.现代中西医结合杂志，1010；19（19）：2468
关键词：HPLC；益气复脉胶囊；五味子醇甲；质量控制
为控制益气复脉胶囊的质量指标，笔者建立了益气复脉胶囊中北五味子主要成分五味子醇甲的反相高效液相色谱法（RP-HPLC）含量测定方法，以有效控制该制剂的质量，为新药开发提供试验数据。
1.仪器和试剂
1.1仪器
SPD-10Avp检测器（日本岛津）、LC-10ATvp高压泵（日本岛津）、工作站：N2010色谱工作站（浙江大学智能信息工程研究院）、UV-1700型紫外分光光度计（日本岛津）。
1.2试剂与用药
乙醚、甲醇（色谱纯）、超纯水、五味子对照品（由中国药品生物制品检定所提供，批号：110857-200405供含量测定用）。
益气复脉胶囊：海口奇力制药有限公司生产。规格：每粒重0.37g，批号：120201。
2.方法與结果
2.1色谱条件的选择
2.1.1检测波长的选择
取五味子醇甲对照品适量，加流动相溶解并稀释制成一定浓度的溶液。取上述溶液，以流动相为空白，在200nm～400nm范围内扫描，试验结果表明五味子醇甲在250nm处附近有最大吸收。同时，参考中国药典2005年版一部五味子药材标准中五味子醇甲含量测定的检测方法，拟选用250nm作为本品检测波长的选择。
2.1.2流动相的选择
流动相1：甲醇-水=73：27；检测波长为250nm。色谱柱为Shimadzu VP-ODS （150×4.6mm）（日本岛津），进行检测，结果五味子醇甲色谱峰的保留时间为4.399min，与相邻杂峰的分离度为1.177〈1.5，拖尾因子为1.050，理论塔板数为3709.8>2500；试验结果表明色谱条件不能满足含量测定的要求，因此暂不选用该流动相体系。
流动相2：甲醇-水=65：35；检测波长为250nm。色谱柱为Shimadzu VP-ODS （150×4.6mm）（日本岛津），进行检测，结果五味子醇甲色谱峰的保留时间为6.886min，分离度为5.278，拖尾因子为0.994，理论塔板数为3001.4>2500；试验结果表明该色谱条件可满足含量测定的要求，因此，决定选用该流动相体系。
2.2色谱条件与系统适用性试验
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以Shimadzu VP-ODS （150×4.6mm）（日本岛津）为色谱柱；流动相为甲醇-水=65：35；检测波长为250nm，流速：1.0ml/min，柱温：30℃。理论板数按五味子醇甲峰计应不低于2500，五味子醇甲峰与各其他成分峰的分离度应符合要求。
2.3溶剂空白试验
取甲醇20ul注入液相色谱仪。试验结果表明溶剂对本品含量测定无干扰。
2.4阴性样品试验
按处方工艺自制成不含五味子药材的阴性样品，同含量测定项下供试品溶液的制备方法，制备成阴性样品溶液。取20ul注入液相色谱仪。试验结果表明阴性样品溶液对本品含量测定无干扰。
2.5线性关系试验
精密称取于60℃真空干燥至恒重的五味子醇甲对照品5.3mg，置于50ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成母液。分别精密量取上述母液1.0、1.5、2.0、2.5、3.0ml置于10ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度。取上述溶液各20ul注入液相色谱仪，记录色谱图，结果见表1.1，如下图：
表1.1 线性关系试验结果
经线性回归分析，在10.60～31.80μg/ml范围内，直线方程Y=91289x+10392，r=0.9999，线性关系良好。
2.6进样精密度试验
取重复性试验项下的一份供试液，连续进样6针，记录色谱图。试验测定结果见表1.2：
表1.2 进样精密度测定结果
试验结果表明，其RSD%为0.23%<2.0%，进样精密度能满足本品的含量测定要求。
2.7重复性试验
试验结果表明：其RSD%为1.61为<2.0%，本法测定结果重复性较好，符合含量测定的要求。
2.8溶液稳定性试验
取重复性试验项下的一份供试液，分别于0、2、4、6、8、12h取样20ul注入液相色谱仪，记录色谱图。试验结果表明，其RSD%为0.17%< 2.0%，说明样品室温条件下放置12h，溶液稳定。
2.9准确度试验
精密称取已知含量为0.638 mg/g的本品6份，每份约0.4g，分别置25ml容量瓶中，分别加入五味子醇甲对照品溶液 （0.053mg/ml） 5ml，按拟定含量测定项下供试品溶液处理方法处理，所得溶液作为供试品溶液。照含量测定项下的方法进行试验，测定回收率。本品回收率为100.06%，其RSD%为1.16%<2.0%试验结果表明本法准确度较好，符合含量测定的要求。
2.10含量测定方法的确定 2.10.1色谱条件与系统适用性试验
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水=65：35为流动相；Shimadzu VP-ODS （150×4.6mm）（日本岛津）为色谱柱；检测波长为250nm；流速为1.0ml/min；柱温为30℃。理论板数按五味子醇甲峰计应不低于2500[7]。
2.10.2对照品溶液的制备
精密称取五味子醇甲对照品5.0mg，置50ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度。精密吸取上述溶液5ml至25ml量瓶中，用甲醇定容，即可。（每1ml溶液中含五味子醇甲20.00μg）。
2.10.3供试品溶液的制备
取重量差异项下的本品，研细，精密称定约0.8g，置25ml量瓶中，加水约20ml，超声处理使完全溶散，放冷，加水稀释至刻度，摇匀。精密量取上述溶液10ml，置分液漏斗中，用乙醚提取5次，每次15ml，合并醚液，用水洗涤2次，每次10ml，水洗涤液再用乙醚10ml回提一次，合并醚液，60℃～80℃减压浓缩至干，残渣加甲醇适量使溶解，并分次转移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，即得。
2.10.4测定法
分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
2.10.5含量测定结果
精密称取样品，照含量测定项下的方法测定，结果见下表1.6。
表1.6 五味子醇甲含量测定结果（n=2）
3讨论和结论
益气复脉胶囊是由红参、麦冬、北五味子3味常用中药组成的，是临床治疗冠心病的一种治疗或辅助治疗的有效药。现代医学药理作用研究表明[2]：本处方中人参能改善心肌的代谢，增加心肌能量储备，促进DNA和RNA的合成，提高机体耐缺氧能力，从而增强心肌收缩力，扩张外周血管。特别对衰竭或中毒的心脏作用更为明显。并且红参能够提高血浆cAMP值，抑制血小板聚集，降低血浆中纤维蛋白原，清除微血栓，起到改善微循环的作用。人参还可抑制Na+-K+-ATP酶的活性，影响Na+-K+和Na+-Ca2+的交换，使Ca2+内流增加，从而增加心肌收缩力，降低血管阻力，还可清除自由基，增加心肌抗缺氧能力，并兼有抗心律失常作用，同时还具有调节免疫功能的反应。麥冬可稳定细胞膜，能够提高机体的耐缺氧能力；扩张周围血管，减轻心脏负荷，具有正性肌力的作用。五味子能增强机体对各种刺激的非特异性抵抗能力，三药协同应用具有扩血管，增强冠脉血流量和心肌营养血流量，强心，改善心肌组织代谢，促进损伤心肌功能恢复的作用，可以从根本上改善心肌功能。实验研究也证实[3]，益气复脉胶囊对实验性休克有保护、强心、升压作用；并能改善微循环，提高心肌耐缺氧功能。
3.1讨论
3.1.1检测波长的选择
本实验检测波长为250nm，是根据紫外测定。在250nm处，五味子醇甲具有最大吸收峰，选择此处波长，所得结果最明显，结果容易判断。
3.1.2流动相的选择
本文在选择流动相方面对两种流动相进行了尝试。其中流动相1：甲醇-水（73：27），检测的结果中保留时间、分离度、拖尾因子和理论塔板数等不满足含量测定的要求，故不能使用流动相1；而流动相2所检测的结果可满足含量测定要求，因此，决定选用该流动相体系。
3.2结论
经过线性关系、精密度、重复性、稳定性、准确度等试验，证明HPLC法操作简便、准确、快速，是测定益气复脉胶囊中北五味子的五味子醇甲的含量的理想方法。
参考文献：
[1] 杨晓敏. 冠心病心绞痛中医药治疗进展. 临床合理用药，2013；6（8）：1
[2] 周军.生脉注射液治疗气阴两虚型冠心病心绞痛 60 例.中国中医药现代远程教育，2013；11（3）：28～29
[3] 刘小娟，苏丹，路秀云，等. 生脉胶囊的临床应用研究进展.现代中西医结合杂志，1010；19（19）：2468