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摘 要：磺胺类抗生素是目前畜牧业中常用的一种抗菌药物，而磺胺类抗生素在猪肉当中残留积累，在被人体吸收后，会对人体产生毒副作用。因此，对鲜猪肉中磺胺类抗生素残留进行检测具有十分重要的现实意义。本文采用超高相液相色谱-串联质谱法测定了鲜猪肉中8种磺胺类药物残留，并对德阳市场和超市的30份鲜猪肉进行磺胺类抗生素残留的检测。结果表明，30份样品检测结果全部合格，利用该方法对磺胺类药物进行定性和定量分析，具有操作简单、方法稳定等优势，可满足检测和监管要求。
关键词：鲜猪肉;磺胺类药物残留;超高效液相色谱-质谱法
磺胺类药物为人工合成的抗菌药，具有抗菌谱较广、性质稳定、使用简便等优点，在畜牧业得到了广泛应用，养殖户在畜牧养殖的过程当会使用大量的磺胺类抗生素，牲畜被人类食用后，会对人类的身体健康造成一定的负面影响。因此，对各种畜牧产品，尤其是鲜肉类的产品进行磺胺类抗生素残留检测，是对消费者生命健康的保障，是一项十分重要的工作。
磺胺类药物残留的常用检测方法主要有酶联免疫法、高效液相色谱法、液相色谱质谱法等[1]。液质联用以液相色谱作为分离系统，质谱为检测系统，样品经液相系统进入质谱系统，被离子化后，经质谱的质量分析器将离子碎片按质量数分离，经检测器得到质谱图。液质联用体现了色谱和质谱优势的互补，将色谱对复杂样品的高分离能力与质谱具有高选择性、高灵敏度及能够提供相对分子质量与结构信息的优点结合起来，广泛应用在药物分析、食品分析和环境分析等众多领域。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
Agilent 1290高效液相色谱仪、Agilent 6420质谱仪、优普UPT-II-10T型超纯水仪、湘仪H1850R高速冷冻离心机、梅特勒托利多MS205DU电子天平、上海荣亚RE-300旋转蒸发仪、奥特赛恩斯MTN-5800A氮吹仪、IKA VORTEX涡旋仪、KQ-700DV数控超声仪以及九阳破壁机。
磺胺类标准品：BePure标准品磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺喹恶啉、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺甲氧哒嗪（浓度100 μg/mL），成都雅源科技C18填料、正己烷（色谱纯，诺尔施）、乙腈（色谱纯，诺尔施）、正丙醇和甲酸（GR级，成都科龙化工试剂）。
1.2 标准储备液
分别精确吸取浓度为100 μg/mL磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺喹恶啉、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺甲氧哒嗪标准溶液各1.0 mL于20 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度线，得5 μg/mL混合标准储备液，-18 ℃保存。再用甲醇逐级稀释成100 ng/mL得混合标准储备液。
1.3 标准工作液配制
分别称取5.00 g空白阴性样品于50 mL离心管中，处理方法同样品处理方法一致，制的基质溶液。精确吸取适量上述100 ng/mL储备液于1.5 mL进样瓶中，用空白基质溶液定容至1.0 mL，配置成5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL、80 ng/mL的混合標准浓度系列。
1.4 实验方法
1.4.1 样品前处理
精确称取试样2 g置于研钵中，加入6 g C18填料，研磨30 s，装于50 mL聚四氟乙烯离心管中，加入25 mL乙腈-水溶液，涡旋振荡1 min，超声10 min，于6 000 r/min离心5 min，将乙腈层转移至另一离心管中，离心后沉淀物重复提取一次，合并乙腈溶液，待净化[2]。
提取液中加入25 mL乙腈饱和正己烷溶液，振摇5 min，将乙腈溶液移入鸡心瓶中，加入10 mL正丙醇，45 ℃水浴减压蒸发至近干，氮吹至干后，加入1 mL流动相初始比列溶液，超声，溶解残渣，加入乙腈饱和正己烷涡旋、离心，取底层溶液过滤，上机待测。
1.4.2 色谱条件
安捷伦C18色谱柱（2.1 mm×50 mm，5 μm）;柱温：30 ℃;进样体积：10 μL;流速：0.3 mL/min;流动相：0.1%甲酸-水（A），甲醇（B），乙腈（C）;梯度洗脱：0～5 min，A：78%～70%，B：20%，C：2%～10%;5～8 min，A：70%～40%，B：20%，C：10%～40%。
1.4.3 质谱条件
离子源：EI;电离模式：电喷雾正离子;采集方式：MRM;离子喷雾电压：4 000 V;干燥气温度：300 ℃;干燥气流速：11 mL/min;磺胺类药物多反应监测质谱优化结果见表1，优化图谱见图1。
2 结果与分析
2.1 实验条件优化
2.1.1 前处理条件优化
处理过程中比较了乙腈-水、甲醇-水、乙腈、甲醇4种溶剂的提取效果，选用乙腈-水回收率最高且能达到回收率要求，目标物峰形较好，分离度良好，表明乙腈-水的提取效果最优。试验中采用加入正己烷和不加正己烷做对比，得出加入正己烷溶液后除油效果佳，且样品最后过滤时溶液较澄清[3]。
2.1.2 液相条件优化
温度会影响色谱峰的出峰时间，随着温度的增加，色谱峰的出峰时间提前，使得检测时间缩短，但是当温度过高，时间前移较多时，多种目标物同时检测时峰会重叠，从而影响分离度。试验中在25 ℃、30 ℃、35 ℃ 3种液相柱温下进样测定，得出在30 ℃时峰的分离度最好，流出时间短，峰形对称尖锐，所以色谱柱温度选择为30 ℃。流动相比较了纯水、0.1%甲酸水溶液。由于水溶液中加入甲酸，有利于磺胺类药物的离子化，为阳离子的形成提供质子，同时甲酸质子化色谱柱内的硅羟基，降低了磺胺类药物与羟基形成氢键的可能性，从而改善峰形，减少峰拖尾现象。 2.1.3 质谱条件优化
在正离子模式下进行母离子的扫描，确定子离子，设定一定范围内的一组锥孔电压，选出最优的锥孔电压，在最优电压下，优化碰撞能量，通过子离子信号丰度，选出最优的碰撞能量，确定目标物的最优质谱条件[4]。
2.2 标准曲线及线性范围
猪肉基质复杂，应用高相液相色谱-串联质谱进行测定时，基质对药物产生基质效应，对目标物有增强或抑制效应[5]。因此，为了减小基质效应，本试验采用基质表准曲线进行定量。用阴性猪肉样品空白基质溶液配制浓度为5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL、80 ng/mL的混合标准溶液进行测定。以浓度为横坐标，相应峰响应值为纵坐标绘制标准曲线，线性良好，相关系数为0.997 6～0.999 9。8种磺胺类药物线性范围、相关系数、回归方程见表2。
2.3 方法准确度
以阴性猪肉样品作为空白样品，在空白样品中加入混合标准溶液，设3个添加浓度，每个添加浓度设置6个重复，以每个浓度的6个重复样品的回收率评价方法的准确度。添加水平为5 μg/kg、20 μg/kg、50 μg/kg，阴性猪肉样品的加标回收率在70.7%～101.3%，符合分析要求，见表3。
2.4 精密度
以阴性猪肉样品作为空白样品，在空白样品中加入混合标准溶液，设3个添加浓度，每个添加浓度设置6个重复，以6次测试结果的相对标准偏差评价方法的精密度，添加水平为5 μg/kg、20 μg/kg、50 μg/kg，阴性猪肉样品浓度的相对标准偏差在1.2%～3.9%，符合分析要求，见表3。
2.5 实际检测验证试验
在试验优化的最优检测条件下，对菜市场和超市购买的30份猪肉样品进行磺胺类药物残留的检测，均未超过GB 31650—2019标准中磺胺类药物的残留限量100 μg/kg的规定。
4 结论
超高相液相色谱-串联质谱法是一种综合性检测技术，结合了液相色谱的高效分离能力与质谱的高灵敏度特点，其色谱柱可多次重复利用，并且检测结果快速、准确，本文实验结果表明将超高相液相色谱-串联质谱法应用于食物中残留药品检测，可以满足对大分子化合物的分離要求，值得进一步在食品检测行业推广应用。
参考文献
[1]冯才伟，朱君红，王会玲，等.酶联免疫法测定猪肉中磺胺类药物的残留[J].四川畜牧兽医，2012，39（2）：27-29.
[2]陈振桂，占春瑞，郭平，等.高效液相色谱法同时测定水产品中13种磺胺类药物残留的研究[J].食品科学，2007（10）：448-451.
[3]王浩，郭启雷，殷晓燕，等.液相色谱-串联三重四极杆质谱对牛奶中10种磺胺类药物残留的同时测定[J].分析测试学报，2008（增刊1）：137-139.
[4]杨杰程，刘丁溪，郭扰扰，等.动物性食品中磺胺类药物残留检测方法的研究进展[J].畜牧与兽医，2019，51（6）：134-139
[5]邓樱花，李林，张洪权，等.高效液相色谱-荧光检测法测定鸡肉中5种磺胺类药物残留[J].华中第二师范学院化学与生命科学学院，2014，48（1）：53-57.
关键词：鲜猪肉;磺胺类药物残留;超高效液相色谱-质谱法
磺胺类药物为人工合成的抗菌药，具有抗菌谱较广、性质稳定、使用简便等优点，在畜牧业得到了广泛应用，养殖户在畜牧养殖的过程当会使用大量的磺胺类抗生素，牲畜被人类食用后，会对人类的身体健康造成一定的负面影响。因此，对各种畜牧产品，尤其是鲜肉类的产品进行磺胺类抗生素残留检测，是对消费者生命健康的保障，是一项十分重要的工作。
磺胺类药物残留的常用检测方法主要有酶联免疫法、高效液相色谱法、液相色谱质谱法等[1]。液质联用以液相色谱作为分离系统，质谱为检测系统，样品经液相系统进入质谱系统，被离子化后，经质谱的质量分析器将离子碎片按质量数分离，经检测器得到质谱图。液质联用体现了色谱和质谱优势的互补，将色谱对复杂样品的高分离能力与质谱具有高选择性、高灵敏度及能够提供相对分子质量与结构信息的优点结合起来，广泛应用在药物分析、食品分析和环境分析等众多领域。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
Agilent 1290高效液相色谱仪、Agilent 6420质谱仪、优普UPT-II-10T型超纯水仪、湘仪H1850R高速冷冻离心机、梅特勒托利多MS205DU电子天平、上海荣亚RE-300旋转蒸发仪、奥特赛恩斯MTN-5800A氮吹仪、IKA VORTEX涡旋仪、KQ-700DV数控超声仪以及九阳破壁机。
磺胺类标准品：BePure标准品磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺喹恶啉、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺甲氧哒嗪（浓度100 μg/mL），成都雅源科技C18填料、正己烷（色谱纯，诺尔施）、乙腈（色谱纯，诺尔施）、正丙醇和甲酸（GR级，成都科龙化工试剂）。
1.2 标准储备液
分别精确吸取浓度为100 μg/mL磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺喹恶啉、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺甲氧哒嗪标准溶液各1.0 mL于20 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度线，得5 μg/mL混合标准储备液，-18 ℃保存。再用甲醇逐级稀释成100 ng/mL得混合标准储备液。
1.3 标准工作液配制
分别称取5.00 g空白阴性样品于50 mL离心管中，处理方法同样品处理方法一致，制的基质溶液。精确吸取适量上述100 ng/mL储备液于1.5 mL进样瓶中，用空白基质溶液定容至1.0 mL，配置成5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL、80 ng/mL的混合標准浓度系列。
1.4 实验方法
1.4.1 样品前处理
精确称取试样2 g置于研钵中，加入6 g C18填料，研磨30 s，装于50 mL聚四氟乙烯离心管中，加入25 mL乙腈-水溶液，涡旋振荡1 min，超声10 min，于6 000 r/min离心5 min，将乙腈层转移至另一离心管中，离心后沉淀物重复提取一次，合并乙腈溶液，待净化[2]。
提取液中加入25 mL乙腈饱和正己烷溶液，振摇5 min，将乙腈溶液移入鸡心瓶中，加入10 mL正丙醇，45 ℃水浴减压蒸发至近干，氮吹至干后，加入1 mL流动相初始比列溶液，超声，溶解残渣，加入乙腈饱和正己烷涡旋、离心，取底层溶液过滤，上机待测。
1.4.2 色谱条件
安捷伦C18色谱柱（2.1 mm×50 mm，5 μm）;柱温：30 ℃;进样体积：10 μL;流速：0.3 mL/min;流动相：0.1%甲酸-水（A），甲醇（B），乙腈（C）;梯度洗脱：0～5 min，A：78%～70%，B：20%，C：2%～10%;5～8 min，A：70%～40%，B：20%，C：10%～40%。
1.4.3 质谱条件
离子源：EI;电离模式：电喷雾正离子;采集方式：MRM;离子喷雾电压：4 000 V;干燥气温度：300 ℃;干燥气流速：11 mL/min;磺胺类药物多反应监测质谱优化结果见表1，优化图谱见图1。
2 结果与分析
2.1 实验条件优化
2.1.1 前处理条件优化
处理过程中比较了乙腈-水、甲醇-水、乙腈、甲醇4种溶剂的提取效果，选用乙腈-水回收率最高且能达到回收率要求，目标物峰形较好，分离度良好，表明乙腈-水的提取效果最优。试验中采用加入正己烷和不加正己烷做对比，得出加入正己烷溶液后除油效果佳，且样品最后过滤时溶液较澄清[3]。
2.1.2 液相条件优化
温度会影响色谱峰的出峰时间，随着温度的增加，色谱峰的出峰时间提前，使得检测时间缩短，但是当温度过高，时间前移较多时，多种目标物同时检测时峰会重叠，从而影响分离度。试验中在25 ℃、30 ℃、35 ℃ 3种液相柱温下进样测定，得出在30 ℃时峰的分离度最好，流出时间短，峰形对称尖锐，所以色谱柱温度选择为30 ℃。流动相比较了纯水、0.1%甲酸水溶液。由于水溶液中加入甲酸，有利于磺胺类药物的离子化，为阳离子的形成提供质子，同时甲酸质子化色谱柱内的硅羟基，降低了磺胺类药物与羟基形成氢键的可能性，从而改善峰形，减少峰拖尾现象。 2.1.3 质谱条件优化
在正离子模式下进行母离子的扫描，确定子离子，设定一定范围内的一组锥孔电压，选出最优的锥孔电压，在最优电压下，优化碰撞能量，通过子离子信号丰度，选出最优的碰撞能量，确定目标物的最优质谱条件[4]。
2.2 标准曲线及线性范围
猪肉基质复杂，应用高相液相色谱-串联质谱进行测定时，基质对药物产生基质效应，对目标物有增强或抑制效应[5]。因此，为了减小基质效应，本试验采用基质表准曲线进行定量。用阴性猪肉样品空白基质溶液配制浓度为5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL、80 ng/mL的混合标准溶液进行测定。以浓度为横坐标，相应峰响应值为纵坐标绘制标准曲线，线性良好，相关系数为0.997 6～0.999 9。8种磺胺类药物线性范围、相关系数、回归方程见表2。
2.3 方法准确度
以阴性猪肉样品作为空白样品，在空白样品中加入混合标准溶液，设3个添加浓度，每个添加浓度设置6个重复，以每个浓度的6个重复样品的回收率评价方法的准确度。添加水平为5 μg/kg、20 μg/kg、50 μg/kg，阴性猪肉样品的加标回收率在70.7%～101.3%，符合分析要求，见表3。
2.4 精密度
以阴性猪肉样品作为空白样品，在空白样品中加入混合标准溶液，设3个添加浓度，每个添加浓度设置6个重复，以6次测试结果的相对标准偏差评价方法的精密度，添加水平为5 μg/kg、20 μg/kg、50 μg/kg，阴性猪肉样品浓度的相对标准偏差在1.2%～3.9%，符合分析要求，见表3。
2.5 实际检测验证试验
在试验优化的最优检测条件下，对菜市场和超市购买的30份猪肉样品进行磺胺类药物残留的检测，均未超过GB 31650—2019标准中磺胺类药物的残留限量100 μg/kg的规定。
4 结论
超高相液相色谱-串联质谱法是一种综合性检测技术，结合了液相色谱的高效分离能力与质谱的高灵敏度特点，其色谱柱可多次重复利用，并且检测结果快速、准确，本文实验结果表明将超高相液相色谱-串联质谱法应用于食物中残留药品检测，可以满足对大分子化合物的分離要求，值得进一步在食品检测行业推广应用。
参考文献
[1]冯才伟，朱君红，王会玲，等.酶联免疫法测定猪肉中磺胺类药物的残留[J].四川畜牧兽医，2012，39（2）：27-29.
[2]陈振桂，占春瑞，郭平，等.高效液相色谱法同时测定水产品中13种磺胺类药物残留的研究[J].食品科学，2007（10）：448-451.
[3]王浩，郭启雷，殷晓燕，等.液相色谱-串联三重四极杆质谱对牛奶中10种磺胺类药物残留的同时测定[J].分析测试学报，2008（增刊1）：137-139.
[4]杨杰程，刘丁溪，郭扰扰，等.动物性食品中磺胺类药物残留检测方法的研究进展[J].畜牧与兽医，2019，51（6）：134-139
[5]邓樱花，李林，张洪权，等.高效液相色谱-荧光检测法测定鸡肉中5种磺胺类药物残留[J].华中第二师范学院化学与生命科学学院，2014，48（1）：53-57.