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摘要 目的：探討虎潜丸对去卵巢骨质疏松症大鼠骨组织的保护作用，以及通过调控碱性磷酸酶（ALP）、白细胞介素-6（IL-6）和血清骨保护素（OPG）的表达而防治骨质疏松症的机制研究。方法：采用卵巢切除法复制绝经后骨质疏松症大鼠模型，随机分为模型组、虎潜丸组、雌二醇组，同时设置假手术组作为对照，各组分别给予相应的药物灌胃。灌胃12周后取血处死，称量各组大鼠的体质量、子宫重量;取大鼠左侧股骨、胫骨进行骨密度检测;全自动生化分析仪检测各组大鼠血清中血糖、血脂、钙磷的变化;ELISA检测各组大鼠血清中IL-6、ALP、OPG的水平。结果：与假手术组比较，模型组大鼠骨密度显著下降（P<0.05），骨微结构破坏明显;与模型组比较，虎潜丸组大鼠骨密度增加，骨小梁的完整性升高，骨微结构得到改善，体质量增长明显下降，血脂血糖水平降低，IL-6、ALP含量均有所降低，OPG含量升高，血钙含量有明显上升，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：虎潜丸能够提高去卵巢大鼠的骨量，防治绝经后骨质疏松症，其作用机制可能与降低ALP、IL-6，提高OPG含量有关。
关键词 虎潜丸;绝经后骨质疏松症;骨密度;去卵巢大鼠;雌激素;白细胞介素-6;中医药治疗
Study on the Protective Effect and Mechanism of Huqian Pill on Bone Tissue of Ovariectomized Osteoporosis Rats
WANG Jin1，ZHANG Qian 1，2，TANG Haozhi1，YANG Xu1，WANG Huaxin1，2
（1 Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Ji′nan 250355，China; 2 Shandong Co-Innovation Center of Classic Traditional Chinese Medicine Formula，Ji′nan 250355，China）
Abstract Objective：To explore the protective effect of Huqian Pill on bone tissue of ovariectomized osteoporosis rats and the mechanism of prevention and treatment of osteoporosis by regulating the expression of ALP，IL-6 and OPG.Methods：The model of postmenopausal osteoporosis rats was made by ovariectomy.The rats were randomly divided into a model group，a Huqian Pills group and an estradiol group.At the same time，a sham operation group was set up as a control，and each group was given corresponding drugs by gavage.After 12 weeks of gavage，blood was taken and executed，the body mass and uterus mass of each group were weighed; the bone density of left femur and tibia of each group were measured; the changes of blood glucose，blood lipid and calcium phosphorus in serum of each group were detected by automatic biochemical analyzer; the contents of IL-6，ALP and OPG in rat serum of each group were detected by ELISA.Results：Compared with sham group，model group BMD decreased significantly（P<0.05）; there was significant destruction of bone microarchitecture; compared with model group，Huqian Pill increased bone density of rats，increases the integrity of trabecular bone，bone microarchitecture was improved，the amount of weight gain decreased，blood lipid and glucose levels decreased，IL-6，and ALP content were decreased，levels of OPG elevated，calcium content significantly increased.The differences were statistically significant（P<0.05）.Conclusion：Haqian Pills can improve bone mass in ovariectomized rats，prevent postmenopausal osteoporosis，and its mechanism may reduce ALP，IL-6，and improve OPG related content. Keywords Huqian Pills; Postmenopausal osteoporosis; Bone density; Ovariectomized rats; Estrogen; IL-6; Traditional Chinese medicine treatment
中图分类号：R285.5;R274.9文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.12.010
绝经后骨质疏松症（Postmenopausal Osteoporosis，PMOP）以骨量减少，骨微结构被破坏，骨密度降低，骨脆性增加为特征[1]。此病通常发病隐蔽，临床症状出现较晚，以突发性骨折为主，严重影响着中老年妇女的健康[2]。对于女性来说，绝经后的生命时长约占其一生的三分之一，且随着人均寿命的延长，这一时段还会不断延长，因此提高中老年妇女绝经后骨质疏松症患者生命质量尤为重要。据预测，到21世纪中叶，中国骨质疏松性骨折人数将达到599万，相应的医疗支出高达1 745亿元[3]，且目前医学上没有针对骨质疏松症行之有效的治愈方法，因此骨质疏松症的预防以及早期的干预治疗尤为关键。
现阶段西医治疗骨质疏松症的药物有骨基础药物（如钙剂、维生素D和其衍生物等）、抗骨吸收药物（如雌激素、选择性雌激素受体调节剂、双膦酸盐类和降钙素等）、促进骨形成药物（如甲状旁腺激素、胰岛素生长因子-1和骨硬化素抗体等）以及双重药理作用药物（如雷尼酸锶）等，但均有不同程度的不良反应[4]。而中药以及中成药治疗骨质疏松症以其疗效明显、不良反应少的优势，受到了越来越多的关注[5]。虎潜丸出自《丹溪心法》，原方由黄柏、龟甲、知母、熟地黄、陈皮、白芍、锁阳、虎骨、干姜组成，为滋阴降火，益精填髓，强筋健骨的名方，主治肝肾亏虚，精血不足，筋骨痿弱。虎潜丸应用临床治疗绝经后骨质疏松症效果显著，但具体机制未明确[6-7]。
本实验采用卵巢切除法（OVX），构建大鼠骨质疏松症模型，然后分组观察虎潜丸的疗效。通过观察大鼠体质量、子宫形态、血糖血脂、钙磷、骨密度及骨微结构的情况，并检测大鼠血清碱性磷酸酶（ALP）、IL-6、血清骨保护素（OPG）的水平，探讨虎潜丸对骨质疏松症的疗效机制，为中药复方治疗骨质疏松症的研究提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物 SPF级SD大鼠32只，雌性，9月龄，体质量250～300 g，購自北京维通利华实验动物中心有限公司，许可证号：SCXK（京）2016-0006。于SPF级动物房进行饲养，饲养条件：温度20～26 ℃，相对湿度40%～70%，12 h明暗循环，自由饮水。
1.1.2 药物 虎潜丸由酒炒黄柏、酒炙龟甲、酒炒知母、熟地黄、陈皮、白芍、锁阳、炙狗骨（替代虎骨）、干姜9味中药组成（药材购于山东中医药大学新中鲁医院，经山东中医药大学李峰教授鉴定为合格产品）。
1.1.3 试剂与仪器 戊酸雌二醇片（拜耳医药保健有限公司广州分公司，批号：621B2）;0.9%氯化钠注射液（山东科伦药业有限公司，批号：B180301002）;异氟烷（深圳市瑞沃德生命科技有限公司，批号：217180501）;4%多聚甲醛固定液（Biosharp，批号：BL539A）;ALP试剂盒（南京建成生物工程研究所，货号：A059-2）;IL-6、OPG ELISA试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，批号：E-EL-R0015c;E-EL-R0050c）。小动物气体麻醉机（Matrx公司，美国，型号：VIP3000）;高速冷冻离心机（中国赛默飞世尔科技有限公司，型号：Multifuge X1R）;全自动生化分析仪（桂林优利特电子集团有限公司，型号：URIT-8036）;酶标仪（伯腾仪器有限公司，美国，型号：VT05404-0998）;离活体一体化Micro-CT设备—NEMO（平生医疗科技有限公司，型号：Super Nova Micro CT）。
1.2 方法
1.2.1 分组与模型制备 大鼠适应性喂养1周后，按照随机数字表的方法将大鼠分为假手术组8只和手术组24只。将手术组大鼠行双侧卵巢摘除术。具体操作步骤：使用小动物麻醉机对大鼠进行麻醉，麻醉成功后，大鼠俯卧位，固定四肢，备皮消毒。触摸找到肋骨后缘，距离双侧肋后缘中点下1.5 cm及正中线两侧1.5 cm处，分别取2个长约1 cm的纵切口。依次切开皮肤、皮下组织、腹膜，暴露腹腔脏器;先找到一侧的Y形子宫，顺着子宫向远端探查，可找到梅花状的卵巢。结扎卵巢下端输卵管，完整地摘除双侧卵巢，摘除卵巢块经过切片镜下鉴定为卵巢。逐层缝合伤口，伤口滴加青霉素注射液以防感染。再进行另一侧操作。假手术组在暴露卵巢后，不予切除，在其附近切除与卵巢体积大小相近的脂肪组织，余操作均与手术组相同。术后连续3 d肌内注射青霉素G 20万单位/只以预防感染。术后7 d将手术组大鼠随机分为模型组、虎潜丸组与雌二醇组，每组8只。本实验经山东中医药大学实验动物福利伦理审查委员会审核，符合实验动物与动物实验福利、伦理要求（伦理审批号：SDUTCM2018112901）。
1.2.2 给药方法 造模后1周，根据人和动物药物等效剂量换算公式，以成人临床用药剂量计算动物用药剂量[8]。参考元代朱震亨的《丹溪心法》中虎潜丸用量，黄柏（酒炒）18 g、狗骨（酒炙）15 g、龟甲（酒炙）12 g、干姜10 g，锁阳8 g、知母（酒炒）、熟地黄、陈皮和白芍各6 g，加适量水煎。将中药饮片水煎2次后，混合滤液并浓缩至90 mg/mL，将戊酸雌二醇片配制成10 μg/mL的混悬液。按照1 mL/100 g的灌胃剂量，分别用虎潜丸水煎液和戊酸雌二醇片混悬液灌胃;假手术组和模型组大鼠用生理盐水灌胃;1次/d，连续灌胃12周。根据体质量调整灌胃量。 1.2.3 检测指标与方法
1.2.3.1 取材及实验指标检测 药物干预结束后进行实验动物取材。各组大鼠禁食不禁水12 h后，用10%水合氯醛麻醉，腹主动脉取血处死，血液离心，分离上清液，并置于-80 ℃冰箱中保存。取出Y形子宫用4%多聚甲醛固定，24 h后脱水石蜡包埋;取大鼠左侧股骨、胫骨，剔除附着在周围的软组织和肌肉，固定于4%多聚甲醛中備用。
1.2.3.2 体质量及子宫系数 大鼠造模后1周后连续给药3个月，每周称重并记录体质量。药物干预结束后取材后称取子宫重量。子宫系数=子宫重量/体质量。
1.2.3.3 骨密度检测及三维成像 取大鼠股骨，用Micro-CT进行扫描，利用自带软件进行股骨近端骨密度测定。利用BI-2000医学图像分析系统进行骨组织形态学计量分析，包括骨小梁数量、骨小梁面积等。
1.2.3.4 血生化检测 将大鼠麻醉，经腹主动脉取血，将全血以3 000 r/min的转速，13.5 cm的离心半径，在4 ℃下离心15 min分离血清。生化仪检测血清中血脂、血糖、钙、磷的水平。
1.2.3.5 ELISA法检测血清中碱性磷酸酶（ALP）、白细胞介素-6（Interleukin 6，IL-6）、人成骨细胞骨保护素（Osteoprorotegerin，OPG）的含量 将冻存血清按试剂盒操作步骤检测ALP、IL-6、OPG的含量。设置酶标仪吸光度A为450 nm，以标准品浓度为横坐标，A为纵坐标做标准曲线，计算各样品对应的浓度值。
1.3 统计学方法 采用SPSS 22.0统计软件对研究数据进行统计分析，计量资料符合正态分布者用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 虎潜丸对去卵巢大鼠体质量和子宫系数的影响 1）与假手术组比较，模型组体质量增加最多（P<0.01），而虎潜丸组和雌二醇组体质量增长比模型组低，差异均有统计学意义（均P<0.01）。2）与假手术组比较，模型组子宫系数明显减小。差异有统计学意义（P<0.05）。3）与模型组比较，虎潜丸组和雌二醇组子宫系数均有增长趋势。见表1。
2.2 虎潜丸对于去卵巢大鼠子宫形态的影响 假手术组大鼠子宫内膜组织轮廓清晰，血管丰富，腺体数量多。与假手术组比较，模型组大鼠子宫宫腔干瘪变形且内膜厚度明显变薄，柱状上皮细胞萎缩，胞质减少，固有层、肌层与浆膜层组织轮廓模糊，血管减少，腺体相对萎缩减少。与模型组比较，虎潜丸组与雌二醇组子宫宫腔相对丰满，固有层、肌层与浆膜层组织轮廓较为完整，血管较为丰富，宫腔萎缩情况略有改善，腺体数量较模型组多。见图1。
2.3 虎潜丸对去卵巢大鼠骨密度及骨微结构的影响 与假手术组比较，模型组大鼠的股骨骨密度显著降低，差异有统计学意义（P<0.01）。与模型组比较，虎潜丸组和雌二醇组骨密度均明显上升，差异有统计学意义（均P<0.05）。见表2。
从股骨三维成像图可见，假手术组大鼠骨小梁大小适中，骨小梁排列整齐且连接度好;模型组大鼠股骨骨小梁变短变小，稀疏，断裂，呈骨质疏松状。与假手术组比较，模型组骨小梁数目、厚度以及小梁面积均明显降低;与模型组比较，虎潜丸组和雌二醇组骨小梁数目、厚度以及小梁面积均明显上升，骨小梁结构完整。见图2。
2.4 虎潜丸对去卵巢大鼠血脂和血糖的影响 与假手术组比较，模型组的血糖、三酰甘油（Triglyceride，TG）、总胆固醇（Total Cholesterol，TC）显著上升，差异均有统计学意义（均P<0.01）;与模型组比较，虎潜丸组和雌二醇组大鼠的血糖、TG和TC均明显下降，差异有统计学意义（P<0.01）。见表3。
2.5 虎潜丸对去卵巢大鼠血清中钙、磷的影响 与假手术组比较，模型组大鼠血清中的钙、磷水平明显下降，差异有统计学意义（P<0.05）;与模型组比较，虎潜丸组和雌二醇组钙水平升高，差异有统计学意义（P<0.05）。见表4。
2.6 虎潜丸对去卵巢大鼠血清中ALP、OPG及IL-6的影响 与假手术组比较，模型组的ALP及IL-6水平明显升高，而OPG水平则显著下降（P<0.01）;比较于模型组，虎潜丸组大鼠ALP及IL-6水平明显下降，而OPG水平则明显上升（P<0.05）。见表5。
3 讨论
随着我国老龄化程度不断提高，骨质疏松症发病率明显上升。其中绝经后骨质疏松症是最常见的骨质疏松症类型。女性绝经后卵巢功能衰退，雌激素分泌不足，导致骨代谢紊乱，骨吸收大于骨重建，进而发展为骨质疏松症[9]。中医学将PMOP列为“骨痿、骨枯、骨痹”的范畴，《素问·痿论》就有记载：“肾气热，则腰脊不举，骨枯而髓减，发为骨痿。”其病位在骨，与肾肝关系密切，其主要病机是肾精亏虚，肾失滋养。中医学理论认为“肝主筋，主藏血，主疏泄”，在体合筋，连接骨节，与肢体运动紧密相连，气血衰少，血不养筋，则易发骨质疏松[10]。故治疗以益精填髓，滋养肝肾为主。现代研究发现，中医药在防治PMOP方面具有很大的优势，能够提高患者骨密度，减少骨折发生率，并且疗效显著，不良反应小[5]。现代药理学证明，龟甲可能通过降低骨转换有效改善激素性骨质疏松[11]。锁阳中的有效成分具有清除自由基、抗氧化、增强免疫功能等作用，能够作用于股骨头坏死中的成骨细胞[12]。
虎潜丸出自《丹溪心法》，是经典的补肾名方。有滋阴降火，益精填髓，强筋健骨的功效，主治肝肾亏虚，精血不足，筋骨痿弱。方中黄柏、龟甲、知母、熟地黄养血滋阴，益精补肾;陈皮、白芍、锁阳、虎骨（现用狗骨代替）、干姜益精填髓，理气和中，使补而不滞。诸药合用，充养精血，益精填髓，强筋健骨。现代药理研究证明，虎潜丸具有促进骨髓间充质干细胞（BMSC）增殖的作用，并且可以促进其向成骨细胞分化，对于骨质疏松症有较好的疗效[13]。 Kim等[14]研究表明，肥胖对骨质疏松症具有保护作用，能够增加骨骼负荷，使成骨细胞功能代偿性增强。Saunier等[15]的研究表明，长期雌激素缺乏会增加肥胖风险。王艳等[16]研究发现，雌激素通过降低脂蛋白脂肪酶，诱导激素敏感性脂肪酶的活性以及通过增加肾上腺素的脂解作用来抑制脂肪形成，促进脂肪的分解。Kalinich等[17]研究表明雌激素可以直接通过影响下丘脑来影响摄食。绝经后的女性雌激素分泌不足也多有肥胖的表现，主要表现为体质量的上升以及血清TG、TC的升高以及血糖的异常。本研究发现，大鼠摘除卵巢后，模型组的体质量较假手术组明显升高，血清中血糖、TG、TC明显上升，经过雌二醇和虎潜丸治疗的大鼠体质量增长量以及血清中血糖、TG、TC含量明显下降。研究结果显示，大鼠切除卵巢后，雌激素分泌减少，进而加剧了肥胖，体质量上升。这与Saunier等[15]的研究相吻合。
血清钙、磷含量的变化是反映全身骨质代谢情况的重要指标。血清中的钙、磷含量可以间接反映骨骼中的矿物质变化情况[18]。实验发现模型组血钙含量、血磷含量较假手术组均有降低，经过虎潜丸和雌激素治疗后，血钙含量有明显上升。原因可能是破骨细胞分化活跃，钙、磷离子流失加重，导致了血钙、血磷含量降低。
骨免疫在绝经后骨质疏松症的发病机制中起着关键作用，在活化的T淋巴细胞能够产生促炎细胞因子，其中就包括IL-6，IL-6起着破骨细胞增殖和分化的双重角色[19]。IL-6也是破骨细胞活性的主要介质，能够激活骨吸收[20]，这是由于IL-6可以通过多种作用途径，增加破骨细胞形成，并提高其活性，延长破骨细胞的寿命，抑制破骨细胞的凋亡，最终促进骨吸收，导致骨质疏松症的发生[21]。人成骨细胞骨保护素（Osteoprorotegerin，OPG）属于肿瘤坏死因子受体家族中的一员，OPG的主要功能是抑制破骨细胞的形成、分化，促进成熟破骨细胞的凋亡[22]。Bucay等[23]的实验显示，OPG基因敲除小鼠破骨细胞数量明显增多，并伴有严重的骨质疏松。ALP在人体细胞膜分布广泛。李海等[24]的研究显示，在骨质疏松发生时，破骨细胞功能增强，骨质流失增多，代偿性引起成骨细胞的功能增强，机体分泌ALP增多。Zhao等[25]的研究显示，ALP在肾脏中近曲小管的细胞表面分布广泛，当骨质疏松发生时，机体尤其是肾脏与骨的ALP流失入血，血液中的ALP含量因此升高。在本实验中，模型组相较于假手术组IL-6、ALP含量升高，OPG含量下降。经过虎潜丸和雌激素治疗后，IL-6、ALP含量均有所降低，OPG含量升高，虎潜丸可能影响了ALP、IL-6、OPG的表达。
通过切除大鼠双侧卵巢来复制绝经后妇女骨质疏松症模型是目前公认的造模方法[26]，故本研究以此建立绝经后妇女骨质疏松症模型。骨密度检测结果显示，模型组大鼠骨密度显著低于假手术组，很好地模拟了绝经后骨质疏松症[27]。同时研究结果表明，虎潜丸可能通过影响ALP、IL-6、OPG的表达，促进成骨细胞的发育以及抑制破骨细胞的分化成熟，可以有效地减缓因雌激素缺乏导致的骨质疏松症。因此，临床上使用虎潜丸治疗绝经后妇女骨质疏松症是一种安全有效的方法，具有良好的临床推广价值。
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（2020-07-08收稿 责任编辑：苍宁）
基金项目：国家自然科学基金委员会青年科学基金项目（82004087）;山东省中医药科技发展计划项目（2017-004）;山东省高等学校科技计划项目（J18KA271）;山东省自然科学基金重大基础研究项目（ZR2019ZD23）;国家级大学生创新训练计划项目（201910441010）;山东中医药大学青年创新团队项目
作者简介：王进（1997.11—），男，本科生在读，研究方向：骨质疏松症研究，E-mail：[email protected]
通信作者：王花欣（1984.02—），女，博士，副教授，研究方向：骨病及分子机制研究，E-mail：[email protected]
关键词 虎潜丸;绝经后骨质疏松症;骨密度;去卵巢大鼠;雌激素;白细胞介素-6;中医药治疗
Study on the Protective Effect and Mechanism of Huqian Pill on Bone Tissue of Ovariectomized Osteoporosis Rats
WANG Jin1，ZHANG Qian 1，2，TANG Haozhi1，YANG Xu1，WANG Huaxin1，2
（1 Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Ji′nan 250355，China; 2 Shandong Co-Innovation Center of Classic Traditional Chinese Medicine Formula，Ji′nan 250355，China）
Abstract Objective：To explore the protective effect of Huqian Pill on bone tissue of ovariectomized osteoporosis rats and the mechanism of prevention and treatment of osteoporosis by regulating the expression of ALP，IL-6 and OPG.Methods：The model of postmenopausal osteoporosis rats was made by ovariectomy.The rats were randomly divided into a model group，a Huqian Pills group and an estradiol group.At the same time，a sham operation group was set up as a control，and each group was given corresponding drugs by gavage.After 12 weeks of gavage，blood was taken and executed，the body mass and uterus mass of each group were weighed; the bone density of left femur and tibia of each group were measured; the changes of blood glucose，blood lipid and calcium phosphorus in serum of each group were detected by automatic biochemical analyzer; the contents of IL-6，ALP and OPG in rat serum of each group were detected by ELISA.Results：Compared with sham group，model group BMD decreased significantly（P<0.05）; there was significant destruction of bone microarchitecture; compared with model group，Huqian Pill increased bone density of rats，increases the integrity of trabecular bone，bone microarchitecture was improved，the amount of weight gain decreased，blood lipid and glucose levels decreased，IL-6，and ALP content were decreased，levels of OPG elevated，calcium content significantly increased.The differences were statistically significant（P<0.05）.Conclusion：Haqian Pills can improve bone mass in ovariectomized rats，prevent postmenopausal osteoporosis，and its mechanism may reduce ALP，IL-6，and improve OPG related content. Keywords Huqian Pills; Postmenopausal osteoporosis; Bone density; Ovariectomized rats; Estrogen; IL-6; Traditional Chinese medicine treatment
中图分类号：R285.5;R274.9文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.12.010
绝经后骨质疏松症（Postmenopausal Osteoporosis，PMOP）以骨量减少，骨微结构被破坏，骨密度降低，骨脆性增加为特征[1]。此病通常发病隐蔽，临床症状出现较晚，以突发性骨折为主，严重影响着中老年妇女的健康[2]。对于女性来说，绝经后的生命时长约占其一生的三分之一，且随着人均寿命的延长，这一时段还会不断延长，因此提高中老年妇女绝经后骨质疏松症患者生命质量尤为重要。据预测，到21世纪中叶，中国骨质疏松性骨折人数将达到599万，相应的医疗支出高达1 745亿元[3]，且目前医学上没有针对骨质疏松症行之有效的治愈方法，因此骨质疏松症的预防以及早期的干预治疗尤为关键。
现阶段西医治疗骨质疏松症的药物有骨基础药物（如钙剂、维生素D和其衍生物等）、抗骨吸收药物（如雌激素、选择性雌激素受体调节剂、双膦酸盐类和降钙素等）、促进骨形成药物（如甲状旁腺激素、胰岛素生长因子-1和骨硬化素抗体等）以及双重药理作用药物（如雷尼酸锶）等，但均有不同程度的不良反应[4]。而中药以及中成药治疗骨质疏松症以其疗效明显、不良反应少的优势，受到了越来越多的关注[5]。虎潜丸出自《丹溪心法》，原方由黄柏、龟甲、知母、熟地黄、陈皮、白芍、锁阳、虎骨、干姜组成，为滋阴降火，益精填髓，强筋健骨的名方，主治肝肾亏虚，精血不足，筋骨痿弱。虎潜丸应用临床治疗绝经后骨质疏松症效果显著，但具体机制未明确[6-7]。
本实验采用卵巢切除法（OVX），构建大鼠骨质疏松症模型，然后分组观察虎潜丸的疗效。通过观察大鼠体质量、子宫形态、血糖血脂、钙磷、骨密度及骨微结构的情况，并检测大鼠血清碱性磷酸酶（ALP）、IL-6、血清骨保护素（OPG）的水平，探讨虎潜丸对骨质疏松症的疗效机制，为中药复方治疗骨质疏松症的研究提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物 SPF级SD大鼠32只，雌性，9月龄，体质量250～300 g，購自北京维通利华实验动物中心有限公司，许可证号：SCXK（京）2016-0006。于SPF级动物房进行饲养，饲养条件：温度20～26 ℃，相对湿度40%～70%，12 h明暗循环，自由饮水。
1.1.2 药物 虎潜丸由酒炒黄柏、酒炙龟甲、酒炒知母、熟地黄、陈皮、白芍、锁阳、炙狗骨（替代虎骨）、干姜9味中药组成（药材购于山东中医药大学新中鲁医院，经山东中医药大学李峰教授鉴定为合格产品）。
1.1.3 试剂与仪器 戊酸雌二醇片（拜耳医药保健有限公司广州分公司，批号：621B2）;0.9%氯化钠注射液（山东科伦药业有限公司，批号：B180301002）;异氟烷（深圳市瑞沃德生命科技有限公司，批号：217180501）;4%多聚甲醛固定液（Biosharp，批号：BL539A）;ALP试剂盒（南京建成生物工程研究所，货号：A059-2）;IL-6、OPG ELISA试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，批号：E-EL-R0015c;E-EL-R0050c）。小动物气体麻醉机（Matrx公司，美国，型号：VIP3000）;高速冷冻离心机（中国赛默飞世尔科技有限公司，型号：Multifuge X1R）;全自动生化分析仪（桂林优利特电子集团有限公司，型号：URIT-8036）;酶标仪（伯腾仪器有限公司，美国，型号：VT05404-0998）;离活体一体化Micro-CT设备—NEMO（平生医疗科技有限公司，型号：Super Nova Micro CT）。
1.2 方法
1.2.1 分组与模型制备 大鼠适应性喂养1周后，按照随机数字表的方法将大鼠分为假手术组8只和手术组24只。将手术组大鼠行双侧卵巢摘除术。具体操作步骤：使用小动物麻醉机对大鼠进行麻醉，麻醉成功后，大鼠俯卧位，固定四肢，备皮消毒。触摸找到肋骨后缘，距离双侧肋后缘中点下1.5 cm及正中线两侧1.5 cm处，分别取2个长约1 cm的纵切口。依次切开皮肤、皮下组织、腹膜，暴露腹腔脏器;先找到一侧的Y形子宫，顺着子宫向远端探查，可找到梅花状的卵巢。结扎卵巢下端输卵管，完整地摘除双侧卵巢，摘除卵巢块经过切片镜下鉴定为卵巢。逐层缝合伤口，伤口滴加青霉素注射液以防感染。再进行另一侧操作。假手术组在暴露卵巢后，不予切除，在其附近切除与卵巢体积大小相近的脂肪组织，余操作均与手术组相同。术后连续3 d肌内注射青霉素G 20万单位/只以预防感染。术后7 d将手术组大鼠随机分为模型组、虎潜丸组与雌二醇组，每组8只。本实验经山东中医药大学实验动物福利伦理审查委员会审核，符合实验动物与动物实验福利、伦理要求（伦理审批号：SDUTCM2018112901）。
1.2.2 给药方法 造模后1周，根据人和动物药物等效剂量换算公式，以成人临床用药剂量计算动物用药剂量[8]。参考元代朱震亨的《丹溪心法》中虎潜丸用量，黄柏（酒炒）18 g、狗骨（酒炙）15 g、龟甲（酒炙）12 g、干姜10 g，锁阳8 g、知母（酒炒）、熟地黄、陈皮和白芍各6 g，加适量水煎。将中药饮片水煎2次后，混合滤液并浓缩至90 mg/mL，将戊酸雌二醇片配制成10 μg/mL的混悬液。按照1 mL/100 g的灌胃剂量，分别用虎潜丸水煎液和戊酸雌二醇片混悬液灌胃;假手术组和模型组大鼠用生理盐水灌胃;1次/d，连续灌胃12周。根据体质量调整灌胃量。 1.2.3 检测指标与方法
1.2.3.1 取材及实验指标检测 药物干预结束后进行实验动物取材。各组大鼠禁食不禁水12 h后，用10%水合氯醛麻醉，腹主动脉取血处死，血液离心，分离上清液，并置于-80 ℃冰箱中保存。取出Y形子宫用4%多聚甲醛固定，24 h后脱水石蜡包埋;取大鼠左侧股骨、胫骨，剔除附着在周围的软组织和肌肉，固定于4%多聚甲醛中備用。
1.2.3.2 体质量及子宫系数 大鼠造模后1周后连续给药3个月，每周称重并记录体质量。药物干预结束后取材后称取子宫重量。子宫系数=子宫重量/体质量。
1.2.3.3 骨密度检测及三维成像 取大鼠股骨，用Micro-CT进行扫描，利用自带软件进行股骨近端骨密度测定。利用BI-2000医学图像分析系统进行骨组织形态学计量分析，包括骨小梁数量、骨小梁面积等。
1.2.3.4 血生化检测 将大鼠麻醉，经腹主动脉取血，将全血以3 000 r/min的转速，13.5 cm的离心半径，在4 ℃下离心15 min分离血清。生化仪检测血清中血脂、血糖、钙、磷的水平。
1.2.3.5 ELISA法检测血清中碱性磷酸酶（ALP）、白细胞介素-6（Interleukin 6，IL-6）、人成骨细胞骨保护素（Osteoprorotegerin，OPG）的含量 将冻存血清按试剂盒操作步骤检测ALP、IL-6、OPG的含量。设置酶标仪吸光度A为450 nm，以标准品浓度为横坐标，A为纵坐标做标准曲线，计算各样品对应的浓度值。
1.3 统计学方法 采用SPSS 22.0统计软件对研究数据进行统计分析，计量资料符合正态分布者用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 虎潜丸对去卵巢大鼠体质量和子宫系数的影响 1）与假手术组比较，模型组体质量增加最多（P<0.01），而虎潜丸组和雌二醇组体质量增长比模型组低，差异均有统计学意义（均P<0.01）。2）与假手术组比较，模型组子宫系数明显减小。差异有统计学意义（P<0.05）。3）与模型组比较，虎潜丸组和雌二醇组子宫系数均有增长趋势。见表1。
2.2 虎潜丸对于去卵巢大鼠子宫形态的影响 假手术组大鼠子宫内膜组织轮廓清晰，血管丰富，腺体数量多。与假手术组比较，模型组大鼠子宫宫腔干瘪变形且内膜厚度明显变薄，柱状上皮细胞萎缩，胞质减少，固有层、肌层与浆膜层组织轮廓模糊，血管减少，腺体相对萎缩减少。与模型组比较，虎潜丸组与雌二醇组子宫宫腔相对丰满，固有层、肌层与浆膜层组织轮廓较为完整，血管较为丰富，宫腔萎缩情况略有改善，腺体数量较模型组多。见图1。
2.3 虎潜丸对去卵巢大鼠骨密度及骨微结构的影响 与假手术组比较，模型组大鼠的股骨骨密度显著降低，差异有统计学意义（P<0.01）。与模型组比较，虎潜丸组和雌二醇组骨密度均明显上升，差异有统计学意义（均P<0.05）。见表2。
从股骨三维成像图可见，假手术组大鼠骨小梁大小适中，骨小梁排列整齐且连接度好;模型组大鼠股骨骨小梁变短变小，稀疏，断裂，呈骨质疏松状。与假手术组比较，模型组骨小梁数目、厚度以及小梁面积均明显降低;与模型组比较，虎潜丸组和雌二醇组骨小梁数目、厚度以及小梁面积均明显上升，骨小梁结构完整。见图2。
2.4 虎潜丸对去卵巢大鼠血脂和血糖的影响 与假手术组比较，模型组的血糖、三酰甘油（Triglyceride，TG）、总胆固醇（Total Cholesterol，TC）显著上升，差异均有统计学意义（均P<0.01）;与模型组比较，虎潜丸组和雌二醇组大鼠的血糖、TG和TC均明显下降，差异有统计学意义（P<0.01）。见表3。
2.5 虎潜丸对去卵巢大鼠血清中钙、磷的影响 与假手术组比较，模型组大鼠血清中的钙、磷水平明显下降，差异有统计学意义（P<0.05）;与模型组比较，虎潜丸组和雌二醇组钙水平升高，差异有统计学意义（P<0.05）。见表4。
2.6 虎潜丸对去卵巢大鼠血清中ALP、OPG及IL-6的影响 与假手术组比较，模型组的ALP及IL-6水平明显升高，而OPG水平则显著下降（P<0.01）;比较于模型组，虎潜丸组大鼠ALP及IL-6水平明显下降，而OPG水平则明显上升（P<0.05）。见表5。
3 讨论
随着我国老龄化程度不断提高，骨质疏松症发病率明显上升。其中绝经后骨质疏松症是最常见的骨质疏松症类型。女性绝经后卵巢功能衰退，雌激素分泌不足，导致骨代谢紊乱，骨吸收大于骨重建，进而发展为骨质疏松症[9]。中医学将PMOP列为“骨痿、骨枯、骨痹”的范畴，《素问·痿论》就有记载：“肾气热，则腰脊不举，骨枯而髓减，发为骨痿。”其病位在骨，与肾肝关系密切，其主要病机是肾精亏虚，肾失滋养。中医学理论认为“肝主筋，主藏血，主疏泄”，在体合筋，连接骨节，与肢体运动紧密相连，气血衰少，血不养筋，则易发骨质疏松[10]。故治疗以益精填髓，滋养肝肾为主。现代研究发现，中医药在防治PMOP方面具有很大的优势，能够提高患者骨密度，减少骨折发生率，并且疗效显著，不良反应小[5]。现代药理学证明，龟甲可能通过降低骨转换有效改善激素性骨质疏松[11]。锁阳中的有效成分具有清除自由基、抗氧化、增强免疫功能等作用，能够作用于股骨头坏死中的成骨细胞[12]。
虎潜丸出自《丹溪心法》，是经典的补肾名方。有滋阴降火，益精填髓，强筋健骨的功效，主治肝肾亏虚，精血不足，筋骨痿弱。方中黄柏、龟甲、知母、熟地黄养血滋阴，益精补肾;陈皮、白芍、锁阳、虎骨（现用狗骨代替）、干姜益精填髓，理气和中，使补而不滞。诸药合用，充养精血，益精填髓，强筋健骨。现代药理研究证明，虎潜丸具有促进骨髓间充质干细胞（BMSC）增殖的作用，并且可以促进其向成骨细胞分化，对于骨质疏松症有较好的疗效[13]。 Kim等[14]研究表明，肥胖对骨质疏松症具有保护作用，能够增加骨骼负荷，使成骨细胞功能代偿性增强。Saunier等[15]的研究表明，长期雌激素缺乏会增加肥胖风险。王艳等[16]研究发现，雌激素通过降低脂蛋白脂肪酶，诱导激素敏感性脂肪酶的活性以及通过增加肾上腺素的脂解作用来抑制脂肪形成，促进脂肪的分解。Kalinich等[17]研究表明雌激素可以直接通过影响下丘脑来影响摄食。绝经后的女性雌激素分泌不足也多有肥胖的表现，主要表现为体质量的上升以及血清TG、TC的升高以及血糖的异常。本研究发现，大鼠摘除卵巢后，模型组的体质量较假手术组明显升高，血清中血糖、TG、TC明显上升，经过雌二醇和虎潜丸治疗的大鼠体质量增长量以及血清中血糖、TG、TC含量明显下降。研究结果显示，大鼠切除卵巢后，雌激素分泌减少，进而加剧了肥胖，体质量上升。这与Saunier等[15]的研究相吻合。
血清钙、磷含量的变化是反映全身骨质代谢情况的重要指标。血清中的钙、磷含量可以间接反映骨骼中的矿物质变化情况[18]。实验发现模型组血钙含量、血磷含量较假手术组均有降低，经过虎潜丸和雌激素治疗后，血钙含量有明显上升。原因可能是破骨细胞分化活跃，钙、磷离子流失加重，导致了血钙、血磷含量降低。
骨免疫在绝经后骨质疏松症的发病机制中起着关键作用，在活化的T淋巴细胞能够产生促炎细胞因子，其中就包括IL-6，IL-6起着破骨细胞增殖和分化的双重角色[19]。IL-6也是破骨细胞活性的主要介质，能够激活骨吸收[20]，这是由于IL-6可以通过多种作用途径，增加破骨细胞形成，并提高其活性，延长破骨细胞的寿命，抑制破骨细胞的凋亡，最终促进骨吸收，导致骨质疏松症的发生[21]。人成骨细胞骨保护素（Osteoprorotegerin，OPG）属于肿瘤坏死因子受体家族中的一员，OPG的主要功能是抑制破骨细胞的形成、分化，促进成熟破骨细胞的凋亡[22]。Bucay等[23]的实验显示，OPG基因敲除小鼠破骨细胞数量明显增多，并伴有严重的骨质疏松。ALP在人体细胞膜分布广泛。李海等[24]的研究显示，在骨质疏松发生时，破骨细胞功能增强，骨质流失增多，代偿性引起成骨细胞的功能增强，机体分泌ALP增多。Zhao等[25]的研究显示，ALP在肾脏中近曲小管的细胞表面分布广泛，当骨质疏松发生时，机体尤其是肾脏与骨的ALP流失入血，血液中的ALP含量因此升高。在本实验中，模型组相较于假手术组IL-6、ALP含量升高，OPG含量下降。经过虎潜丸和雌激素治疗后，IL-6、ALP含量均有所降低，OPG含量升高，虎潜丸可能影响了ALP、IL-6、OPG的表达。
通过切除大鼠双侧卵巢来复制绝经后妇女骨质疏松症模型是目前公认的造模方法[26]，故本研究以此建立绝经后妇女骨质疏松症模型。骨密度检测结果显示，模型组大鼠骨密度显著低于假手术组，很好地模拟了绝经后骨质疏松症[27]。同时研究结果表明，虎潜丸可能通过影响ALP、IL-6、OPG的表达，促进成骨细胞的发育以及抑制破骨细胞的分化成熟，可以有效地减缓因雌激素缺乏导致的骨质疏松症。因此，临床上使用虎潜丸治疗绝经后妇女骨质疏松症是一种安全有效的方法，具有良好的临床推广价值。
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（2020-07-08收稿 责任编辑：苍宁）
基金项目：国家自然科学基金委员会青年科学基金项目（82004087）;山东省中医药科技发展计划项目（2017-004）;山东省高等学校科技计划项目（J18KA271）;山东省自然科学基金重大基础研究项目（ZR2019ZD23）;国家级大学生创新训练计划项目（201910441010）;山东中医药大学青年创新团队项目
作者简介：王进（1997.11—），男，本科生在读，研究方向：骨质疏松症研究，E-mail：[email protected]
通信作者：王花欣（1984.02—），女，博士，副教授，研究方向：骨病及分子机制研究，E-mail：[email protected]