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[摘 要] 目的：建立测定去叔丁基杯[6]芳烃含量的高效液相色谱方法。方法：采用 Diamonsil C18色谱柱色谱柱（250 mm × 4.6 mm，5 um）；流动相为甲醇（加入0.1%三氟乙酸）；流速：1.0 mL/min；检测波长为206 nm；柱温 40 ℃；进样体积：20 μL。结果：去叔丁基杯[6]芳烃主峰分离良好，HPLC 测定的线性范围为10.0 ～60.0 μg/mL（r=0.9998），该方法在仪器精密度、日内精密度、日间精密度以及重复性方面 RSD 均在 2% 以下。结论：用高效液相色谱法对去叔丁基杯[6]芳烃进行含量测定，方法简单，结果准确可靠。
[关键词] 杯芳烃；去叔丁基杯[6]芳烃；含量测定；高效液相色谱法
中图分类号：O657 文献标识码：B 文章编号：2095-5200（2016）05-075-03
DOI：10.11876/mimt201605028
杯芳烃（calixarene）是一类新型的大环多聚体，因其结构像酒杯而得名，该化合物在1942年首次由奥地利的金克（Zinke）合成[1]。杯芳烃可以形成主-客复合物，“空腔”的大小可以根据需要进行调节，是比冠醚和环糊精应用更加广泛、适应性更好的主体化合物[2-3]。其中以杯[4]芳烃、杯[6]芳烃和杯[8]芳烃最为常见，在碱性条件下对叔丁基苯酚与甲醛缩合成为大环的化合物，按照苯酚单元的个数命名为杯[n]芳烃。杯芳烃有多方面重要应用价值，比在生物模拟酶、电活性LB膜等方面的应用，并且在色谱、催化反应等领域应用比较广泛[4]。从杯[6]出发合成多种杯芳烃衍生物，去叔丁基杯芳烃是合成各种杯芳烃衍生物的中间体，对这种中间体进行含量测定可以为合成产物提供质量控制方法[5-6]。本文对中间体去叔丁基杯[6]芳烃采用高效液相色谱法进行含量的测定，并对测定方法结果的精密度、重现性等进行研究。
1 仪器与试剂
Waters2695/2996 高效液相色谱仪（DAD检测器），自动进样器（EMPOWER数据处理系统）；BP211D型电子天平（德国SARTORIUS）；溶剂过滤器；甲醇、乙腈（禹王试剂提供的色谱纯）；三氟乙酸由江苏康泰氟化工有限公司提供。对照品（批号：20141109）由北京精华耀邦医药科技有限公司提供，供试品（批号20151026）由军事医学科学院放射与辐射医学研究所提供。
2 实验与结果
2.1 色谱条件
色谱柱为 Diamonsil C18 （250 mm × 4.6 mm，5 um）色谱柱；流动相为甲醇（加入0.1%三氟乙酸）；检测波长为 206 nm；流速 1.0 mL/min；进样体积为 20 ?L；柱温 40 ℃。
2.2 溶液的制备
精密称定10 mg的供试品，置100 mL量瓶中，加甲醇：乙腈=70：30溶液，超声溶解并稀释至刻度，摇匀作为储备液。精密移取储备液5.0 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得浓度为50 ?g/mL的供试品溶液。精密称定10 mg的对照品，同法操作，取供试品与对照品溶液各 20 ?L注入高效液相色谱仪中，记录色谱图，空白溶液以及去叔丁基杯[6]芳烃色谱图见图 1。
去叔丁基杯[6]芳烃主峰保留时间为7.3 min，主峰与杂质能较好分离（分离度均大于1.5），理论塔板数不低于6000，该峰的纯度角小于纯度阈值，表明在该条件下色谱行为良好，峰为单一峰。见图 2。
3 专属性考察
3.1 检测限、定量限
精密称定对照品适量，用甲醇：乙腈=70：30溶液逐步稀释。将检测限定为信噪比（3：1） 时的进样量，将信噪比为 10：1 时的进样量作为定量限。测得检测限为 10 ng，定量限为30 ng。
3.2 线性范围
精密称定10 mg的对照品，置100 mL量瓶中，加甲醇：乙腈=70：30溶液，超声溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液。分别精密移取储备液1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得浓度为10 ?g/mL、20 ?g/mL、30 ?g/mL、40 ?g/mL、50 ?g/mL、60 ?g/mL的溶液。滤过（0.22 um微孔滤膜），取20 ?L续滤液注入高效液相色谱仪中，记录色谱图。对结果进行线性回归，x轴为进样浓度?g/mL，y 轴为峰面积A，通过计算得到回归方程是：y=123583.3x-794661.9，r=0.9998（n=6）。供试品实验结果表明：在10 ?g/mL-60 ?g/mL 范围内线性关系良好。
3.3 仪器精密度实验
取上述线性范围项下50 ?g/mL溶液20 ?L，连续进样6次，注入高效液相色谱仪，峰面积RSD低于2.0%，仪器有良好的精密度。
3.4 方法精密度实验
取上述线性范围项下40 ?g/mL、50 ?g/mL、60 ?g/mL溶液，相当于含量测定供试品溶液浓度的80%、100%、120%，分别于配制0h、5h、10h后进样，考察日内精密度；分别于配制24h、48h、72h后进样，考察日间精密度，均注入高效液相色谱仪20 ?L。供试品实验结果表明：日内精密度的RSD低于2.0%、日间精密度的RSD低于2.0%，样品溶液在三天内比较稳定。
3.5 重复性实验
分别精密称定供试品4 mg、5 mg、6 mg，各三份，置100 mL量瓶中，加甲醇：乙腈=70：30溶液，超声溶解并稀释至刻度，摇匀，相当于含量测定供试品溶液浓度的80%、100%、120%，均注入高效液相色谱仪20 ?L，记录色谱图。高、中、低浓度的样品所测含量RSD结果均小低于2.0%，方法有良好的重复性。 3.6 样品含量测定
精密称定10 mg供试品，置100 mL量瓶中，加甲醇：乙腈=70：30溶液，超声溶解并稀释至刻度，摇匀，作储备溶液。精密移取5.0 mL储备溶液，置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得浓度为50 ?g/mL的供试品溶液。精密称定10 mg对照品，同法操作，注入高效液相色谱仪各20 ?L 的供试品与对照品溶液，记录色谱图，按峰面积计算去叔丁基杯[6]芳烃含量。结果样品含量为94.9%。
4 讨论
4.1 波长的选择
供试品溶解加甲醇：乙腈=70：30溶解，在紫外区 200nm～380nm间进行扫描，测得最大吸收波长为206 nm；溶剂干扰峰在该波长处出现的较靠前，对样品主峰的测定没有影响，所以最终选择206 nm作为检测波长。见图3。
4.2 流动相溶剂的优化
在色谱条件中流动相作为重要的参数，直接影响到样品的分离，去叔丁基杯[6]芳烃有“空穴”结构，且其分子结构式中没有带电荷以及极性强的基团性质，决定了其不溶于水溶液，而溶于有机溶剂中[7]。所以实验通过对甲醇、乙腈、甲醇：乙腈以及加入不同比例的三氟乙酸、乙酸等多种流动相对样品的测定进行考察分离效果，表明不加酸时主峰对称性差且保留时间，峰型不好，最后选择了甲醇（加入0.1%三氟乙酸）为流动相，容易洗脱，不仅出峰时间适宜，分离度以及对称性均较好，理论塔板数高，可以改善峰型。
4.3 柱温的考察
取“3.6”项下浓度为 50 ?g/mL 的对照品溶液 20 ?L 注入液相色谱仪，考察 25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃的柱温，记录色谱图。实验结果表明：不同的温度中各物质均能较好的分离，柱效、分离度、对称性差别不大。考虑到柱压对柱子的影响，选用40 ℃作为色谱柱的柱温。
5 结论
杯芳烃结构独特，含有疏水性基团，可以与苯环连在一起构成一个疏水性的杯状空腔，与中性有机分子形成主-客体化合物，环上还有亲水性的酚羟基整齐排列在一起，可以鳌合、输送离子型化合物，改变苯酚单元的数目、改变桥联基等都可以改变化合物的性质，得到不同功能的杯芳烃[8]。去叔丁基杯[6]芳烃在去掉了疏水性的叔丁基后，极性变强，在反相色谱柱上更易于洗脱，研究去叔丁基杯[6]芳烃，有利于其在色谱领域的应用[9]。本实验通过用HPLC对其定量研究，且经方法学研究结果表明，该方法简便、准确、重现性好、专属性强，可为去叔丁基杯[6]芳烃的质量标准提供可靠的依据。
参 考 文 献
[1] 武芸，曹端林，陈鑫，等.叔丁基杯[6]芳烃的去叔丁基反应[J].化学研究，2007，18（1）： 46-48.
[2] 郑琴，龚淑玲，张春雷，等.双杯芳烃研究进展[J].化学进展，2007，21（5）：722-734.
[3] 彭程，马云川，陈萧萧，等.取代杯[6]芳烃的制备及在18F-FET制备中的应用[J].同位素，2011，43（3）：166-171.
[4] 李海兵，曾丽霖，熊得军，等.磺化杯[6]芳烃修饰的金纳米粒的合成及其对多环芳烃的比色检测[J].高等学校化学学报，2008，11（9）：1736-1739.
[5] RODRIGUEZ A， COSTA-BAUZA A， SAEZ-TORRES C， et al. HPLC method for urinary theobromine determination： Effect of consumption of cocoa products on theobromine urinary excretion in children[J]. Clin Biochem， 2015， 48（16-17）： 1138-1143.
[6] 李秋莲，冯炎飞，聂进，等.对叔丁基杯芳烃合成及性能研究的综合实验[J].实验室研究与探索，2008，27（9）：24-25.
[7] 安琳，蔡亚华，颜朝国.对叔丁基杯[n]芳烃酰胺衍生物的合成及其对某些金属离子的萃取性能[J].应用化学，2005，12（9）：58-61.
[8] 李来生，达世禄，冯钰，等.杯芳烃在液相色谱、毛细管电泳和电色谱中的应用进展[J].化学进展，2005，17（3）：530-523.
[9] 于昆，字敏，袁黎明.杯芳烃及其衍生物在色谱分离中的应用[J].辽宁化工，2004，33（1）：53-54.
[关键词] 杯芳烃；去叔丁基杯[6]芳烃；含量测定；高效液相色谱法
中图分类号：O657 文献标识码：B 文章编号：2095-5200（2016）05-075-03
DOI：10.11876/mimt201605028
杯芳烃（calixarene）是一类新型的大环多聚体，因其结构像酒杯而得名，该化合物在1942年首次由奥地利的金克（Zinke）合成[1]。杯芳烃可以形成主-客复合物，“空腔”的大小可以根据需要进行调节，是比冠醚和环糊精应用更加广泛、适应性更好的主体化合物[2-3]。其中以杯[4]芳烃、杯[6]芳烃和杯[8]芳烃最为常见，在碱性条件下对叔丁基苯酚与甲醛缩合成为大环的化合物，按照苯酚单元的个数命名为杯[n]芳烃。杯芳烃有多方面重要应用价值，比在生物模拟酶、电活性LB膜等方面的应用，并且在色谱、催化反应等领域应用比较广泛[4]。从杯[6]出发合成多种杯芳烃衍生物，去叔丁基杯芳烃是合成各种杯芳烃衍生物的中间体，对这种中间体进行含量测定可以为合成产物提供质量控制方法[5-6]。本文对中间体去叔丁基杯[6]芳烃采用高效液相色谱法进行含量的测定，并对测定方法结果的精密度、重现性等进行研究。
1 仪器与试剂
Waters2695/2996 高效液相色谱仪（DAD检测器），自动进样器（EMPOWER数据处理系统）；BP211D型电子天平（德国SARTORIUS）；溶剂过滤器；甲醇、乙腈（禹王试剂提供的色谱纯）；三氟乙酸由江苏康泰氟化工有限公司提供。对照品（批号：20141109）由北京精华耀邦医药科技有限公司提供，供试品（批号20151026）由军事医学科学院放射与辐射医学研究所提供。
2 实验与结果
2.1 色谱条件
色谱柱为 Diamonsil C18 （250 mm × 4.6 mm，5 um）色谱柱；流动相为甲醇（加入0.1%三氟乙酸）；检测波长为 206 nm；流速 1.0 mL/min；进样体积为 20 ?L；柱温 40 ℃。
2.2 溶液的制备
精密称定10 mg的供试品，置100 mL量瓶中，加甲醇：乙腈=70：30溶液，超声溶解并稀释至刻度，摇匀作为储备液。精密移取储备液5.0 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得浓度为50 ?g/mL的供试品溶液。精密称定10 mg的对照品，同法操作，取供试品与对照品溶液各 20 ?L注入高效液相色谱仪中，记录色谱图，空白溶液以及去叔丁基杯[6]芳烃色谱图见图 1。
去叔丁基杯[6]芳烃主峰保留时间为7.3 min，主峰与杂质能较好分离（分离度均大于1.5），理论塔板数不低于6000，该峰的纯度角小于纯度阈值，表明在该条件下色谱行为良好，峰为单一峰。见图 2。
3 专属性考察
3.1 检测限、定量限
精密称定对照品适量，用甲醇：乙腈=70：30溶液逐步稀释。将检测限定为信噪比（3：1） 时的进样量，将信噪比为 10：1 时的进样量作为定量限。测得检测限为 10 ng，定量限为30 ng。
3.2 线性范围
精密称定10 mg的对照品，置100 mL量瓶中，加甲醇：乙腈=70：30溶液，超声溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液。分别精密移取储备液1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得浓度为10 ?g/mL、20 ?g/mL、30 ?g/mL、40 ?g/mL、50 ?g/mL、60 ?g/mL的溶液。滤过（0.22 um微孔滤膜），取20 ?L续滤液注入高效液相色谱仪中，记录色谱图。对结果进行线性回归，x轴为进样浓度?g/mL，y 轴为峰面积A，通过计算得到回归方程是：y=123583.3x-794661.9，r=0.9998（n=6）。供试品实验结果表明：在10 ?g/mL-60 ?g/mL 范围内线性关系良好。
3.3 仪器精密度实验
取上述线性范围项下50 ?g/mL溶液20 ?L，连续进样6次，注入高效液相色谱仪，峰面积RSD低于2.0%，仪器有良好的精密度。
3.4 方法精密度实验
取上述线性范围项下40 ?g/mL、50 ?g/mL、60 ?g/mL溶液，相当于含量测定供试品溶液浓度的80%、100%、120%，分别于配制0h、5h、10h后进样，考察日内精密度；分别于配制24h、48h、72h后进样，考察日间精密度，均注入高效液相色谱仪20 ?L。供试品实验结果表明：日内精密度的RSD低于2.0%、日间精密度的RSD低于2.0%，样品溶液在三天内比较稳定。
3.5 重复性实验
分别精密称定供试品4 mg、5 mg、6 mg，各三份，置100 mL量瓶中，加甲醇：乙腈=70：30溶液，超声溶解并稀释至刻度，摇匀，相当于含量测定供试品溶液浓度的80%、100%、120%，均注入高效液相色谱仪20 ?L，记录色谱图。高、中、低浓度的样品所测含量RSD结果均小低于2.0%，方法有良好的重复性。 3.6 样品含量测定
精密称定10 mg供试品，置100 mL量瓶中，加甲醇：乙腈=70：30溶液，超声溶解并稀释至刻度，摇匀，作储备溶液。精密移取5.0 mL储备溶液，置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得浓度为50 ?g/mL的供试品溶液。精密称定10 mg对照品，同法操作，注入高效液相色谱仪各20 ?L 的供试品与对照品溶液，记录色谱图，按峰面积计算去叔丁基杯[6]芳烃含量。结果样品含量为94.9%。
4 讨论
4.1 波长的选择
供试品溶解加甲醇：乙腈=70：30溶解，在紫外区 200nm～380nm间进行扫描，测得最大吸收波长为206 nm；溶剂干扰峰在该波长处出现的较靠前，对样品主峰的测定没有影响，所以最终选择206 nm作为检测波长。见图3。
4.2 流动相溶剂的优化
在色谱条件中流动相作为重要的参数，直接影响到样品的分离，去叔丁基杯[6]芳烃有“空穴”结构，且其分子结构式中没有带电荷以及极性强的基团性质，决定了其不溶于水溶液，而溶于有机溶剂中[7]。所以实验通过对甲醇、乙腈、甲醇：乙腈以及加入不同比例的三氟乙酸、乙酸等多种流动相对样品的测定进行考察分离效果，表明不加酸时主峰对称性差且保留时间，峰型不好，最后选择了甲醇（加入0.1%三氟乙酸）为流动相，容易洗脱，不仅出峰时间适宜，分离度以及对称性均较好，理论塔板数高，可以改善峰型。
4.3 柱温的考察
取“3.6”项下浓度为 50 ?g/mL 的对照品溶液 20 ?L 注入液相色谱仪，考察 25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃的柱温，记录色谱图。实验结果表明：不同的温度中各物质均能较好的分离，柱效、分离度、对称性差别不大。考虑到柱压对柱子的影响，选用40 ℃作为色谱柱的柱温。
5 结论
杯芳烃结构独特，含有疏水性基团，可以与苯环连在一起构成一个疏水性的杯状空腔，与中性有机分子形成主-客体化合物，环上还有亲水性的酚羟基整齐排列在一起，可以鳌合、输送离子型化合物，改变苯酚单元的数目、改变桥联基等都可以改变化合物的性质，得到不同功能的杯芳烃[8]。去叔丁基杯[6]芳烃在去掉了疏水性的叔丁基后，极性变强，在反相色谱柱上更易于洗脱，研究去叔丁基杯[6]芳烃，有利于其在色谱领域的应用[9]。本实验通过用HPLC对其定量研究，且经方法学研究结果表明，该方法简便、准确、重现性好、专属性强，可为去叔丁基杯[6]芳烃的质量标准提供可靠的依据。
参 考 文 献
[1] 武芸，曹端林，陈鑫，等.叔丁基杯[6]芳烃的去叔丁基反应[J].化学研究，2007，18（1）： 46-48.
[2] 郑琴，龚淑玲，张春雷，等.双杯芳烃研究进展[J].化学进展，2007，21（5）：722-734.
[3] 彭程，马云川，陈萧萧，等.取代杯[6]芳烃的制备及在18F-FET制备中的应用[J].同位素，2011，43（3）：166-171.
[4] 李海兵，曾丽霖，熊得军，等.磺化杯[6]芳烃修饰的金纳米粒的合成及其对多环芳烃的比色检测[J].高等学校化学学报，2008，11（9）：1736-1739.
[5] RODRIGUEZ A， COSTA-BAUZA A， SAEZ-TORRES C， et al. HPLC method for urinary theobromine determination： Effect of consumption of cocoa products on theobromine urinary excretion in children[J]. Clin Biochem， 2015， 48（16-17）： 1138-1143.
[6] 李秋莲，冯炎飞，聂进，等.对叔丁基杯芳烃合成及性能研究的综合实验[J].实验室研究与探索，2008，27（9）：24-25.
[7] 安琳，蔡亚华，颜朝国.对叔丁基杯[n]芳烃酰胺衍生物的合成及其对某些金属离子的萃取性能[J].应用化学，2005，12（9）：58-61.
[8] 李来生，达世禄，冯钰，等.杯芳烃在液相色谱、毛细管电泳和电色谱中的应用进展[J].化学进展，2005，17（3）：530-523.
[9] 于昆，字敏，袁黎明.杯芳烃及其衍生物在色谱分离中的应用[J].辽宁化工，2004，33（1）：53-54.