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摘 要：为研究茶叶不同前处理对气相色谱法检测有机磷农药的影响，将茶叶样品用乙酸乙酯-正己烷（1+1，体积比）溶液振荡提取有机磷，用 ENVI-Carb柱（SPE小柱）净化，气相法检测，外标法定量。结果表明，该方法的线性范围为10～1000μg/L，样品加标浓度为50、100、500μg/kg 3个水平时，回收率敌敌畏为72.5%～101.6%、甲拌磷为80.3%～109.4%、甲基毒死蜱为85.6%～107.4%、毒死蜱为75.6%～102.7%、杀螟硫磷为75.4%～106.9%、對硫磷为73.5%～107.1%、水胺硫磷为76.5%～104.7%。该方法满足茶叶中有机磷农药的分析要求。
关键词：气相色谱；茶叶；有机磷农药；固相萃取
中图分类号 O657.7+1 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2019）07-0076-04
Abstract：In this paper，Gas chromatography has been used to study the influence of organophosphorus pesticide by different pretreatment in tea.The organic phosphorus was oscillation extracted from the tea samples with ethyl acetate，n-hexane （1+1，Volume ratio），the purification was Used ENVI - small column （SPE）Carb column .The quantitative determination with the gas phase method and the external standard method. The results show that the linear range of method for 10～1000μg/L，the addition concentration of tea samples has three level：50，100，500μg/kg ，meanwhile，The recovery result of dichlorvos：72.5%～101.6%，phorate：80.3%～109.4%，the methyl chlorpyrifos：85.6%～107.4%，chlorpyrifos，75.6%～102.7%，fenitrothion：75.4%～106.9%，parathion：73.5%～107.1%，isocarbophos：76.5%～104.7%. This method satisfies the requirement of analysis of the organophosphorus pesticides in tea.
Key words：Gas chromatography；Tea；Organophosphorus pesticide；Solid phase extraction
目前，有机磷农药是使用量最大的杀虫剂，常用产品有敌百虫、敌敌畏、马拉硫磷、乐果等。大多数有机磷农药的性质不稳定，易分解，对人体的主要危害是引起急性中毒。有机磷农药可通过消化道、呼吸道和皮肤进入体内，经血液和淋巴转运至全身。其毒性原理：与生物体内胆碱酯酶结合，形成稳定的磷酰化乙酰胆碱酯酶，从而使胆碱酶失去活性，导致乙酰胆碱在体内大量堆积，引起胆碱能神经纤维高度兴奋[1]。
长久以来，茶叶作为我国出口商品，在国际市场上占据着重要的地位[2]。茶叶中有机磷残留分析是一项针对复杂混合物中痕量组分的分析技术。由于茶树的种类多，不同种属的茶树成分存在很大差异，因此，对于茶叶的检测和控制农药的残留对保证人类健康有着重大的意义。茶叶样品性质复杂，含有大量的杂质和色素，会干扰农药残留的检测，因此前处理技术对茶叶中农药残留提取和分离等检测研究有很大的影响[3]。
气相色谱法由于具有分析速度快、分离效率高、分离和检测能一次完成等优点，已成为检测农药残留最广泛使用的仪器分析方法。近年来，随着人们对进样系统、检测器的不断研究，分辨率高的毛细管柱得到广泛应用，GC分析的精密度和灵敏度大大提高，扩大了GC在农药残留分析中的应用。现代GC一般针对农药类型采用选择性检测器，应用最多的是火焰光度检测器、电子捕获检测器和氮磷检测器，分别适用于含硫/磷农药、负电子原子的农药（有机氯）和含氮/磷农药。谢文等[4]对样品的提取和净化方法进行了研究，介绍了应用配有FPD检测器的气相色谱仪测定茶叶中有机磷农药残留量的方法。陈新焕等[5]以毛细管气相色谱法测定了茶叶中甲胺磷的残留量[6]。笔者通过采用合适的提取剂和固相萃取柱净化，预处理茶叶样品，观察净化前后的提取液颜色，比较净化前后的区别以及测得的回收率，试图找出最佳前处理净化方法，以便更准确地测定茶叶中的有机磷农药。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂 气相色谱仪GC-2010plus（日本岛津公司）；氮吹仪（MTN-2800D）；粉碎机（IKA）
ENVI-Carb固相萃取柱0.25g/3mL（SUPELCLEAN）；Cleanert TPT固相萃取柱2000mg/12mL（Agela Technologies）；Carb-NH2固相萃取柱500mg/6cc（Waters）；Florisil固相萃取小柱（Phenomenex 8B-SO13-JCH）。
7种标准品（敌敌畏、甲拌磷、毒死蜱、对硫磷、杀螟硫磷、水胺硫磷、甲基毒死蜱）均购于国家标准物质中心，浓度为100μg/mL，用丙酮将各种标准品配制成校正曲线混标工作液，其浓度范围为0.01～1.0mg/L。丙酮、正己烷、乙酸乙酯、异辛烷均为色谱纯。 1.2 仪器条件 GC条件：色谱柱名称Rtx-1701，膜厚0.25μm，长度30.0m，内径0.25mm。进样口温度250℃，不分流进样，载气为氮气（N2），流量控制方式恒线速度，线速度35.5cm/s，吹扫流量3.0mL/min。升温条件80℃起始，以30℃/min升温到230℃，保持0min；继续以-15℃/min升温到200℃，保持4min；以30℃/min升温到240℃，保持5min。
1.3 样品前处理 茶叶（干样）经粉碎后称取0.5g（精确到0.001g）试样于10mL试管中，加入1～1.5mL水，浸泡10min。加入无水硫酸钠使之饱和后，用2mL乙酸乙酯提取2次，每次振荡2min，于2000r/min 离心3min，收集上层有机相；残渣再用2mL乙酸乙酯-正己烷（1∶1，体积比）提取1次，合并上层有机相。过SPE小柱净化，净化液供气相色谱分析[7] 。
1.4 样品净化研究 在固相萃取柱上端装入1cm高无水硫酸钠，用4mL乙酸乙酯预淋洗小柱，弃去流出液，然后将提取液全部倾入柱中，再用洗脱液洗脱，收集全部流出液于10mL具塞刻度离心管中，于40℃下用氮气流吹至0.50mL，供气相色谱分析。
2 结果与分析
2.1 固相萃取柱的选择 对于普洱茶等颜色较深的茶叶样品，经提取有机磷组分后，提取液颜色呈墨绿色，液体状，为了保证在固相萃取方法吸附茶叶中大量色素和部分杂质的前提下，最终使得预处理方法能够获得较为满意的回收率，因此，本实验选取的固相萃取小柱为ENVI-Carb、Cleanert TPT、Carb-NH2和Florisil，按照上述样品处理和净化方法进行试验上机，具体比较结果见表1。
由表1可知，ENVI-Carb柱的样品色素较浅，杂质峰较少，溶剂使用量较少，回收率高，耗时短，同时提取的有机磷组分重现性高，故本实验的固相萃取柱选用ENVI-Carb柱。
2.2 洗脱液的选择 洗脱溶剂需要根据有机磷农药的性质进行选择，极性太强，干扰组分会增加，达不到净化的目的；极性太弱，某些强极性的组分会因为被保留在柱上而损失。
实验分别以5mL的正己烷、环己烷、乙酸乙酯、异辛烷、丙酮及任意两者的混合物（体积比都为1∶1）为研究对象，对样品溶液进行洗脱，以待测物的回收率为考察指标。实验结果得出以乙酸乙酯-正己烷的混合物为洗脱剂时，待测物的回收率最高。再以待测物的回收率为考察指标，以两者的不同比例为研究对象，以选择最佳的洗脱液比例。实验结果得出，正己烷和乙酸乙酯含量约50%时，溶液的洗脱能力趋于平衡不再增加。因此，选择乙酸乙酯-正己烷（体积比为1∶1）溶液为最佳洗脱液比例。
2.3 固相萃取柱的最优洗脱体积 洗脱溶剂的体积也是影响回收率的一个重要因素，确定洗脱溶液体积不仅可以保证较高的回收率，还可以避免有机溶剂的浪费[7]。笔者比较了乙酸乙酯+正己烷（1∶1，体积比）的不同体积洗脱ENVI-Carb柱，综合有机磷的回收率及有机溶剂的使用两方面考虑得出，10mL洗脱回收率最高。乙酸乙酯+正己烷（1∶1，体积比）不同洗脱液体积的峰面积见表2，据此而得图1。因此，固相萃取柱净化过程应选择10mL乙酸乙酯+正己烷（1∶1，体积比）洗脱液。
2.4 方法线性范围和检出限 用配好的标准储备液进行稀释得到浓度分别为0、10、50、100、500、1000μg/L的标准溶液。每个浓度进行平行测定2次，得出峰面积的平均值，以峰面积（Y）为纵坐标，以标准品浓度（X）为横坐标，根据6点校正法绘制标准曲线。同时以3倍噪音比来确定最低检出限，10倍噪音比来确定定量限，得出方法的线性范围、相关系数、最低检出限、回归方程及7种有机磷的标准图谱，结果见表3。
由表3可知，该方法测定7种有机磷的线性范围在10～1000μg/L内线性较好，各有机磷的相关系数在0.99913～0.99993，最低检出限在5～40μg/kg。
7种有机磷物质的气相色谱图（浓度为1mg/L）如图1所示。由图1可见，该方法可以将7种有机磷完全分离，且背景较低，出锋较好。根据信噪比（S/N=3）得出的检出限均达到μg/L级别，可见方法靈敏度较高。
2.5 方法的回收率和重现性 通过加标回收率和样品结果的重现性来评价本方法的可靠性，首先记录下样品本身的本底值，然后选择高、中、低（500、100、50μg/kg）3个不同水平的混标，按照本方法的实验步骤（溶解、过柱、定容上机）进行实验。同时每一水平分别做6次平行，计算平均回收率和标准偏差，其结果及图谱见表4和图2、3、4。
由表4可知，7种有机磷的回收率在70%～110%，总体来说回收率较高。RSD值都小于10%，说明方法的重现性符合要求，数值准确可靠。该方法经过几个阶段的净化处理后仍能获得比较良好的回收率，可以满足茶叶中残留有机磷农药组分含量的检测要求。
3 结论
茶叶样品用乙酸乙酯-正己烷（1∶1，体积比）溶液振荡提取有机磷，用ENVI-Carb柱（SPE小柱）净化，10mL乙酸乙酯-正己烷（1∶1，体积比）为洗脱液，可以除去大部分色素，满足检测要求。实验结果表明，该方法能减少实验成本，分离效果好，精密度高，平均回收率高，适合于茶叶中7种有机磷含量的检测。
参考文献
[1]韦莉萍，公共营养师[M]//胡志庚.唐弋.广东：广东经济出版社，2012：348.
[2]姜伟.茶叶中多农药残留确证分析技术的研究[D].南京：南京农业大学，2009.
[3]陆万平，游飞明，李鑫，等.茶叶中有机氯和拟除虫菊酯多种农药残留同时分析的样品前处理研究[J].分析测试技术与仪器，2009（02）：101-105.
[4]谢文，慧瑛，郑自强，等.硅胶活性炭柱净化-气相色谱法测定茶叶中多种有机磷农药残留量[J].理化检验-化学分册，2005，41：231-233.
[5]陈新焕，黄志强.气相色谱法测定茶叶中甲胺磷残留量[J].分析试验室，2001，20（1）：99-100.
[6]蔡向阳.茶叶和茶汤中有机磷农残检测的研究[D].福建：福建农林大学，2008.
[7]SN/T 1950-1007，进出口茶叶中多种有机磷农药残留量的检测方法-气相色谱法[S]，北京：中国标准出版社，2008.
（责编：徐世红）
关键词：气相色谱；茶叶；有机磷农药；固相萃取
中图分类号 O657.7+1 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2019）07-0076-04
Abstract：In this paper，Gas chromatography has been used to study the influence of organophosphorus pesticide by different pretreatment in tea.The organic phosphorus was oscillation extracted from the tea samples with ethyl acetate，n-hexane （1+1，Volume ratio），the purification was Used ENVI - small column （SPE）Carb column .The quantitative determination with the gas phase method and the external standard method. The results show that the linear range of method for 10～1000μg/L，the addition concentration of tea samples has three level：50，100，500μg/kg ，meanwhile，The recovery result of dichlorvos：72.5%～101.6%，phorate：80.3%～109.4%，the methyl chlorpyrifos：85.6%～107.4%，chlorpyrifos，75.6%～102.7%，fenitrothion：75.4%～106.9%，parathion：73.5%～107.1%，isocarbophos：76.5%～104.7%. This method satisfies the requirement of analysis of the organophosphorus pesticides in tea.
Key words：Gas chromatography；Tea；Organophosphorus pesticide；Solid phase extraction
目前，有机磷农药是使用量最大的杀虫剂，常用产品有敌百虫、敌敌畏、马拉硫磷、乐果等。大多数有机磷农药的性质不稳定，易分解，对人体的主要危害是引起急性中毒。有机磷农药可通过消化道、呼吸道和皮肤进入体内，经血液和淋巴转运至全身。其毒性原理：与生物体内胆碱酯酶结合，形成稳定的磷酰化乙酰胆碱酯酶，从而使胆碱酶失去活性，导致乙酰胆碱在体内大量堆积，引起胆碱能神经纤维高度兴奋[1]。
长久以来，茶叶作为我国出口商品，在国际市场上占据着重要的地位[2]。茶叶中有机磷残留分析是一项针对复杂混合物中痕量组分的分析技术。由于茶树的种类多，不同种属的茶树成分存在很大差异，因此，对于茶叶的检测和控制农药的残留对保证人类健康有着重大的意义。茶叶样品性质复杂，含有大量的杂质和色素，会干扰农药残留的检测，因此前处理技术对茶叶中农药残留提取和分离等检测研究有很大的影响[3]。
气相色谱法由于具有分析速度快、分离效率高、分离和检测能一次完成等优点，已成为检测农药残留最广泛使用的仪器分析方法。近年来，随着人们对进样系统、检测器的不断研究，分辨率高的毛细管柱得到广泛应用，GC分析的精密度和灵敏度大大提高，扩大了GC在农药残留分析中的应用。现代GC一般针对农药类型采用选择性检测器，应用最多的是火焰光度检测器、电子捕获检测器和氮磷检测器，分别适用于含硫/磷农药、负电子原子的农药（有机氯）和含氮/磷农药。谢文等[4]对样品的提取和净化方法进行了研究，介绍了应用配有FPD检测器的气相色谱仪测定茶叶中有机磷农药残留量的方法。陈新焕等[5]以毛细管气相色谱法测定了茶叶中甲胺磷的残留量[6]。笔者通过采用合适的提取剂和固相萃取柱净化，预处理茶叶样品，观察净化前后的提取液颜色，比较净化前后的区别以及测得的回收率，试图找出最佳前处理净化方法，以便更准确地测定茶叶中的有机磷农药。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂 气相色谱仪GC-2010plus（日本岛津公司）；氮吹仪（MTN-2800D）；粉碎机（IKA）
ENVI-Carb固相萃取柱0.25g/3mL（SUPELCLEAN）；Cleanert TPT固相萃取柱2000mg/12mL（Agela Technologies）；Carb-NH2固相萃取柱500mg/6cc（Waters）；Florisil固相萃取小柱（Phenomenex 8B-SO13-JCH）。
7种标准品（敌敌畏、甲拌磷、毒死蜱、对硫磷、杀螟硫磷、水胺硫磷、甲基毒死蜱）均购于国家标准物质中心，浓度为100μg/mL，用丙酮将各种标准品配制成校正曲线混标工作液，其浓度范围为0.01～1.0mg/L。丙酮、正己烷、乙酸乙酯、异辛烷均为色谱纯。 1.2 仪器条件 GC条件：色谱柱名称Rtx-1701，膜厚0.25μm，长度30.0m，内径0.25mm。进样口温度250℃，不分流进样，载气为氮气（N2），流量控制方式恒线速度，线速度35.5cm/s，吹扫流量3.0mL/min。升温条件80℃起始，以30℃/min升温到230℃，保持0min；继续以-15℃/min升温到200℃，保持4min；以30℃/min升温到240℃，保持5min。
1.3 样品前处理 茶叶（干样）经粉碎后称取0.5g（精确到0.001g）试样于10mL试管中，加入1～1.5mL水，浸泡10min。加入无水硫酸钠使之饱和后，用2mL乙酸乙酯提取2次，每次振荡2min，于2000r/min 离心3min，收集上层有机相；残渣再用2mL乙酸乙酯-正己烷（1∶1，体积比）提取1次，合并上层有机相。过SPE小柱净化，净化液供气相色谱分析[7] 。
1.4 样品净化研究 在固相萃取柱上端装入1cm高无水硫酸钠，用4mL乙酸乙酯预淋洗小柱，弃去流出液，然后将提取液全部倾入柱中，再用洗脱液洗脱，收集全部流出液于10mL具塞刻度离心管中，于40℃下用氮气流吹至0.50mL，供气相色谱分析。
2 结果与分析
2.1 固相萃取柱的选择 对于普洱茶等颜色较深的茶叶样品，经提取有机磷组分后，提取液颜色呈墨绿色，液体状，为了保证在固相萃取方法吸附茶叶中大量色素和部分杂质的前提下，最终使得预处理方法能够获得较为满意的回收率，因此，本实验选取的固相萃取小柱为ENVI-Carb、Cleanert TPT、Carb-NH2和Florisil，按照上述样品处理和净化方法进行试验上机，具体比较结果见表1。
由表1可知，ENVI-Carb柱的样品色素较浅，杂质峰较少，溶剂使用量较少，回收率高，耗时短，同时提取的有机磷组分重现性高，故本实验的固相萃取柱选用ENVI-Carb柱。
2.2 洗脱液的选择 洗脱溶剂需要根据有机磷农药的性质进行选择，极性太强，干扰组分会增加，达不到净化的目的；极性太弱，某些强极性的组分会因为被保留在柱上而损失。
实验分别以5mL的正己烷、环己烷、乙酸乙酯、异辛烷、丙酮及任意两者的混合物（体积比都为1∶1）为研究对象，对样品溶液进行洗脱，以待测物的回收率为考察指标。实验结果得出以乙酸乙酯-正己烷的混合物为洗脱剂时，待测物的回收率最高。再以待测物的回收率为考察指标，以两者的不同比例为研究对象，以选择最佳的洗脱液比例。实验结果得出，正己烷和乙酸乙酯含量约50%时，溶液的洗脱能力趋于平衡不再增加。因此，选择乙酸乙酯-正己烷（体积比为1∶1）溶液为最佳洗脱液比例。
2.3 固相萃取柱的最优洗脱体积 洗脱溶剂的体积也是影响回收率的一个重要因素，确定洗脱溶液体积不仅可以保证较高的回收率，还可以避免有机溶剂的浪费[7]。笔者比较了乙酸乙酯+正己烷（1∶1，体积比）的不同体积洗脱ENVI-Carb柱，综合有机磷的回收率及有机溶剂的使用两方面考虑得出，10mL洗脱回收率最高。乙酸乙酯+正己烷（1∶1，体积比）不同洗脱液体积的峰面积见表2，据此而得图1。因此，固相萃取柱净化过程应选择10mL乙酸乙酯+正己烷（1∶1，体积比）洗脱液。
2.4 方法线性范围和检出限 用配好的标准储备液进行稀释得到浓度分别为0、10、50、100、500、1000μg/L的标准溶液。每个浓度进行平行测定2次，得出峰面积的平均值，以峰面积（Y）为纵坐标，以标准品浓度（X）为横坐标，根据6点校正法绘制标准曲线。同时以3倍噪音比来确定最低检出限，10倍噪音比来确定定量限，得出方法的线性范围、相关系数、最低检出限、回归方程及7种有机磷的标准图谱，结果见表3。
由表3可知，该方法测定7种有机磷的线性范围在10～1000μg/L内线性较好，各有机磷的相关系数在0.99913～0.99993，最低检出限在5～40μg/kg。
7种有机磷物质的气相色谱图（浓度为1mg/L）如图1所示。由图1可见，该方法可以将7种有机磷完全分离，且背景较低，出锋较好。根据信噪比（S/N=3）得出的检出限均达到μg/L级别，可见方法靈敏度较高。
2.5 方法的回收率和重现性 通过加标回收率和样品结果的重现性来评价本方法的可靠性，首先记录下样品本身的本底值，然后选择高、中、低（500、100、50μg/kg）3个不同水平的混标，按照本方法的实验步骤（溶解、过柱、定容上机）进行实验。同时每一水平分别做6次平行，计算平均回收率和标准偏差，其结果及图谱见表4和图2、3、4。
由表4可知，7种有机磷的回收率在70%～110%，总体来说回收率较高。RSD值都小于10%，说明方法的重现性符合要求，数值准确可靠。该方法经过几个阶段的净化处理后仍能获得比较良好的回收率，可以满足茶叶中残留有机磷农药组分含量的检测要求。
3 结论
茶叶样品用乙酸乙酯-正己烷（1∶1，体积比）溶液振荡提取有机磷，用ENVI-Carb柱（SPE小柱）净化，10mL乙酸乙酯-正己烷（1∶1，体积比）为洗脱液，可以除去大部分色素，满足检测要求。实验结果表明，该方法能减少实验成本，分离效果好，精密度高，平均回收率高，适合于茶叶中7种有机磷含量的检测。
参考文献
[1]韦莉萍，公共营养师[M]//胡志庚.唐弋.广东：广东经济出版社，2012：348.
[2]姜伟.茶叶中多农药残留确证分析技术的研究[D].南京：南京农业大学，2009.
[3]陆万平，游飞明，李鑫，等.茶叶中有机氯和拟除虫菊酯多种农药残留同时分析的样品前处理研究[J].分析测试技术与仪器，2009（02）：101-105.
[4]谢文，慧瑛，郑自强，等.硅胶活性炭柱净化-气相色谱法测定茶叶中多种有机磷农药残留量[J].理化检验-化学分册，2005，41：231-233.
[5]陈新焕，黄志强.气相色谱法测定茶叶中甲胺磷残留量[J].分析试验室，2001，20（1）：99-100.
[6]蔡向阳.茶叶和茶汤中有机磷农残检测的研究[D].福建：福建农林大学，2008.
[7]SN/T 1950-1007，进出口茶叶中多种有机磷农药残留量的检测方法-气相色谱法[S]，北京：中国标准出版社，2008.
（责编：徐世红）