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摘要 [目的]探索短柄五加种子发育规律，缩短种子后熟时间，提高种子育苗成功率。[方法]采取种子层积变温沙藏处理的方法，缩短种子后熟时间，浅播及加强幼苗管理等措施提高种子育苗成苗率。[结果]该方法处理可使种子的后熟期缩短至150d，具胚率由14.13%以下提高到84.62%以上，大于3.00mm的成熟胚所占比列高达75%以上，150d和180d时发芽率分别为4.56%～13.05%和17.19%～47.56%。浅播与苗期管理等措施使种子出苗率达（11.47±3.73）%，2年成苗率达（79.44±5.18）%。[结论]初步掌握了短柄五加种子发育规律，建立了缩短种子后熟时间的方法，解决了种子发芽难的问题，同时对播种方法、田间管理等进行了研究，为短柄五加的种子育苗和推广应用奠定了基础。
关键词 短柄五加;种子层积变温沙藏处理;种胚发育;种子育苗技术
中图分类号 S.567文献标识码A文章编号0517-6611（2021）07-0057-04
Abstract[Objective]ToexplorethedevelopmentlawofEleutherococcusbrachypus（Harms）Nakaiseeds，shortentheafterripeningtimeofseedsandincreasethesuccessrateofseedbreeding.[Method]Thesandstoragetreatmentofseedstratificationwithvariabletemperaturewasusedtoshortentheseedafterripeningtime，shallowsowingandstrengthenthemanagementofseedlingtoincreasetherateofseedling.[Result]Thepostripeningperiodoftheseedswasshortenedto150dafterthesandstoragetreatmentofseedstratificationwithvariabletemperature，andthepercentageofembryoswithembryoincreasedfromlessthan14.13%tomorethan84.62%，andtheproportionofmatureembryoslargerthan3.00mmwasmorethan75%，thegerminationratewas4.56%-13.05%at150dand17.19%-47.56%at180d.Theseedemergenceratereached（11.47±3.73）%andthetwoyearseedlingratereached（79.44±5.18）%.[Conclusion]ThedevelopmentlawofEleutherococcusbrachypus（Harms）Nakaiseedshasbeenpreliminarilymastered，andthemethodofshorteningtheafterripeningtimeoftheseedsbythetreatmentofvariabletemperaturestratificationsandstoragehasbeenestablished，andthedifficultproblemofseedgerminationhasbeensolved，atthesametime，thesowingmethodandfieldmanagementtechniqueshavebeenstudied，whichlaidafoundationfortheseedbreedingandpopularization.
KeywordsEleutherococcusbrachypus（Harms）Nakai;Sandstoragetreatmentofseedstratificationwithvariabletemperature;Seedembryodevelopment;Seedseedlingraisingtechnique
短柄五加（Eleutherococcusbrachypus（Harms）Nakai）为五加科五加属植物，以根和根茎或茎入药，与刺五加有相似的化学成分和药理作用[1]，具扶正固本、养心安神、补肾健脾、解郁和血的功效;主治脾肾阳虚、腰膝酸软、体虚乏力、失眠多梦、食欲不振、风寒湿痹等病癥[2]，以其为主要原料制成的五加冲剂、神衰康胶囊、佳蓉片等药品在治疗神经衰弱、男子性机能障碍、妇女更年期综合征等方面取得了满意疗效。
短柄五加仅分布于我国陕甘宁交界的黄土高原地区，现仍以野生植物入药，长期的开发利用，使其资源量急剧减少，为用药安全，应大力开展短柄五加的人工栽培，但首先遇到的难题就是种苗繁育问题。有性生殖具有扩大种群分布范围、增加种群数量、丰富遗传多样性的重要作用，因此，种子育苗是解决种苗来源的有效手段之一。
短柄五加种子繁殖存在的主要问题：一是结实株丛少，种子产量低;花粉量少，传粉率低，胚囊退化与败育导致受精率降低，产生不育种子，造成种子质量差[3];短柄五加饱满种子千粒重平均湿重8.24g，饱满种子占种子产量的28.29%～56.85%，饱满种子的潜在活力为62.4%，且种子活力与实际出苗率仍有相当大的差距[4]。二是短柄五加和五加属的其他植物[5-9]一样，存在种子休眠程度高、发芽率低的现象。果实成熟时种胚细小，结构不完整，无胚根、胚芽和子叶的分化，种子成熟度极不均匀，多数种胚处于胚原基或心形胚阶段，少数甚至无胚;种子不具备萌发能力，需要在适宜的温湿度条件下经过一段时间完成胚的分化与生长，形成具有胚根、胚轴、胚芽和子叶的完整胚，完成胚的形态后熟，然后在低温下再经过一段时间完成胚的生理后熟，从而解除种子休眠，播种后在适宜条件下发芽出苗。 如何缩短种子后熟时间，提高出苗率成为短柄五加种子育苗的技术关键。为此，笔者通过探索在不同条件下种子层积沙藏处理，初步掌握了种子发育规律，建立了种子层积变温沙藏处理的方法，缩短了种子后熟时间，解决了种子发芽难的问题，同时对短柄五加播种育苗过程中的圃地选择、播种时间、播种方法、田间管理等进行了研究，为短柄五加的种子育苗和推广应用奠定了基础。
1材料与方法
1.1试验地概况
试验地设在陕西省旬邑县马栏镇长舌头村（108°25′28″E，35°15′24″N，海拔1430m），属基本农田，壤土，肥力中等，较平整，用水方便，交通便利。该地区年平均气温9.1℃，1月平均氣温最低-4.6℃，7月平均气温最高21.5℃，昼夜温差较大。日照时数2390h。无霜期180d。年均降水量606mm。
1.2种子采制
每年9月25日—10月15日为短柄五加果实的成熟期，此时果实变成黑紫色，发软。采集时选择枝条生长健壮、年龄3～5年、光照条件较好的植株果实进行采集。将采摘的果实尽快用清水浸泡48h，搓去果皮和果肉，用清水反复漂洗后捞出沉下来的种子，摊开，放通风处阴干1d，簸弃瘪粒和虫粒，然后将饱满的种子立即进行处理。种子扁肾形或月牙形，两面微凸，红棕色、棕色和土黄色。
1.3种子层积沙藏处理
1.3.1沙子准备。取过筛除去粗沙与细沙的干净河沙，120℃处理6h杀菌，放冷后1kg沙子加入80%的多菌灵5g拌匀，备用。
1.3.2种子准备。饱满种子7份，每份300g，其中黄龙县野生的6份，旬邑县栽培的1份。
1.3.3种子前处理。
A处理用0.20%的多菌灵和0.1%DDV（敌敌畏）溶液2000mL浸种22h;D、E、F、G种子处理方法均同A。
B处理用含0.20%的多菌灵、0.1%DDV溶液和1.0mg/L赤霉素液2000mL浸种22h。
C处理用0.20%的多菌灵和0.1%DDV溶液2000mL浸种22h，捞出种子，淋干;再用改良的MS培养液（1/4大量元素、1/4微量元素、1/2铁盐和1/6有机成分，10mg/L6-苄基嘌呤，20mg/L吲哚乙酸，1mg/L激动素）1000mL浸种48h（表1）。
1.3.4种子层积沙藏处理。将上述处理的种子取出，淋干，分别加入1500g处理好的沙子拌匀，装入塑料饭盒进行培养。种子层积处理期间每隔7～10d翻动1次，保持好湿度和种子的透气性。
1.3.5种子培养方式。A、B、C处理先在18℃培养120d，后转入5℃继续培养60d。D处理实验室变温培养（20～10℃）120d，后转入5℃继续培养60d。E处理实验室变温培养（20～15℃）90d后转入5℃继续培养60d。F、G处理在20、15、10℃各培养30d，然后转入5℃继续培养60d。
1.4种子层积过程监测
1.4.1监测指标。为监测层积沙藏处理期间种胚的变化，参考文献[10-11]的方法以种子活力、种子见胚率、种子胚长作为监测指标。
1.4.2种子活力测定。用四氮唑（TTC）法测定种子的活力。
TTC溶液配制：称取TTC（Sigma）1.0g，加少量95%乙醇溶解，再用pH6.8的磷酸盐缓冲液定容至100mL。
种子活力测定：每次每样随机抽取30粒以上。未处理的种子用30℃温水浸泡24h或层积处理中的种子用30℃温水浸泡4h，使种子充分吸胀，吸胀后用滤纸吸去种子表面的水分，用解剖刀沿种胚中央准确切开，取其一半浸于1.0%TTC溶液中，于32～36℃培养箱中避光保持24h进行染色，然后清水冲掉溶液，保持湿润，体视显微镜下观察种子切面，根据着色情况统计有生活力的种子数，用测微尺测量其种胚大小并观察胚的形态（对未见胚种子，以胚乳的反应颜色进行统计）。
1.4.3种子见胚率。为胚长≥0.1mm的种子粒数占供测种子粒数的百分率。
1.4.4种子胚长的划分。依据短柄五加种胚的长度，形态可粗分为0.10～0.60mm的胚接近于球形;0.61～1.50mm的胚子叶与胚根等宽，呈棒状;1.51～3.00mm的胚子叶宽度大于胚根，形态近似于葫芦形;大于3.00mm的胚呈蝌蚪形，为具子叶、胚根、胚轴、胚芽的分化成熟胚。成熟胚率为胚长大于3.00mm的成熟胚占具胚种子的百分比。
1.5发芽试验
1.5.1培养皿发芽。随机抽取处理裂口的种子，分成3份，每份100粒，置于培养皿中用0.20%多菌灵溶液浸泡过的滤纸上，15℃发芽。
1.5.2花盆发芽试验。取装有80%沙土的花盆4只，浇透水，在每个花盆中平摆100粒培养至裂口的种子，分别上铺厚1cm的湿沙或1cm的湿黄土，套塑料袋在室温（10～18℃）下发芽。
1.5.3沙床发芽。将处理的种子放在厚度3cm沙床上，在10℃的生化培养箱中进行培养，定期观察发芽种子数。
1.6播种
1.6.1选地。选择交通方便、具备灌溉条件、排水良好、土质疏松、肥沃向阳的壤土、地势平坦或缓坡地块，忌黄黏土和涝洼地。
1.6.2整地作畦。将选好的田地进行深耕细耙，再根据地形做成低畦，畦面宽1.3m，畦间距0.6m，畦长10m，南北向。
1.6.3搭遮阳棚。选择高度约2.5m的木桩，按3.6m×3.5m的距离栽桩，栽桩深度0.5m，棚高约1.8m，用14号铁丝进行米字型拉网，周围和上面搭双层遮阳网。
1.6.4播种。处理种子于4月中下旬前播种。播前，畦内浇透水，待水完全渗完后，再将每份200g的处理种子，添加80%多菌灵粉135g及少量细沙拌匀后均匀撒播于畦面，最后再用筛子均匀覆盖一层厚约0.5cm的锯末拌细土（2∶1）。逐畦搭拱形保温保湿棚，覆盖农膜。 1.7种苗的苗期管理
1.7.1撤去拱棚。播种后15～45d小苗陆续出土，当小苗长到3～5片复叶时，可于09：00前揭开拱棚两端，18：00后盖棚，如此炼苗10d后，方可撤掉拱棚。
1.7.2浇水除草。幼苗出土后很嫩弱，抗逆性能较差，前期生长也很缓慢，为使幼苗得到充足的水和光，使其健壮生长，出苗撤棚后应及时人工拔草，避免杂草根系盘结而在拔草时带出幼苗，每次拔草后应及时洒水。幼苗生长初期，苗小根系短、深入土层浅、需水量不大，但要保持苗床湿润，洒水宜多次少量。生长后期，正是充实组织、硬化枝干、增强抗寒能力阶段，一般情况下可少浇水或不浇水。
1.7.3间苗补苗。间苗时间可在幼苗高3～5cm时进行，原则是应将密集处的小苗带土移开，向稀疏地段移栽。株距5cm为宜。短柄五加是阔叶植物，保留株数过多透光通风不良，易感染病害。将间出的苗带土就近补植到缺苗之处，补苗最好选择阴雨天或傍晚进行，补苗后及时浇水提高補苗成活率。2年苗龄的短柄五加幼苗的株距应扩大1倍，因为苗木拥挤生长，会严重影响苗木的质量，降低成活率。
1.7.4培土、出圃。秋末向枝条基部培土厚3～5cm。第3年3月上中旬苗木未发芽前可以出圃移栽。
2结果与分析
2.1种子的具胚率
种子的初始具胚率与果实采集时种子的成熟度有较强的相关性，与产地和年份有关。2015年和2016年黄龙县种子的初始具胚率分别为0和14.13%;在种子形态后熟期（A～D培养120d，E～G培养90d）转入低温培养时所有处理种子的具胚率均超过55%，初始由于种胚太小，抽样与解剖均存在较大的误差;在所有处理中，变温培养（D～G）明显优于恒温培养（A～C），植物激素对种子具胚率的影响作用不明显（C），在完成生理后熟时除C处理外其他处理种子的具胚率达84%以上（表2）。
2.2种胚的生长
短柄五加种子发芽率低的主要原因是种胚成熟度不够所致的休眠程度高，自然播种到出苗需要540～660d，且发芽率仅1.67%[12]。要解除种子休眠需要经过适当的处理缩短种子完成胚形态后熟及生理后熟的时间。
在胚长及3mm以上成熟胚所占比例方面，前期的变温处理（D）优于恒温处理（A、B、C），加赤霉素处理（B）与不加赤霉素处理（A）差异不显著，用改良MS培养基处理的种子（C）较其他处理（A、B、D）差。进一步的试验是先进行20～10℃变温层积（E、F、G）处理90d以完成种胚的分化与生长，然后再转入5℃低温处理60d完成胚的继续生长及生理后熟，经过150d以上的变温处理还有7.69%～15.38%的种子仍看不到种胚，这部分种子很可能是败育的种子，但大于3.00mm的成熟胚所占比例高达75%以上。种胚生长最适温度为5～10℃。从种胚的生长来看，室温和培养箱变温培养均可行，开始室温略优于培养箱，后面培养箱优于室温。培养箱中的处理胚大小比较均匀，室温中的处理胚大小差异较大。通气性和湿度对种子活力影响较大。种子变温处理150d时有4.56%～13.05%的种子发芽，变温处理180d时种子发芽率达17.19%～47.56%，此时正是3月中旬—4月中旬，可进行适时播种（表3、4）。
2.3发芽试验
2.3.1培养皿发芽。处理的裂口种子平均发芽率高达95%。
2.3.2花盆发芽试验。上铺湿沙的出苗率为65%，上铺湿黄土的未见出苗，说明种子的顶土能力较差。
2.3.3沙床发芽。取经20、15和10℃各培养30d，再转入5℃处理60d的种子，放在厚度3cm沙床上，在10℃的生化培养箱中继续培养，进行发芽试验，结果见表5。
不同产地野生的短柄五加种子经变温层积处理后，种子发芽率差异不大，野生与栽培种子的发芽率差异极显著，因此培育优良种子是提高短柄五加种子育苗成功率的有效措施之一。
Allen等[13]认为同种植物的不同个体、不同年份，同一母株的不同花序或相同花序内不同位置的种子，皆有可能有不同的休眠特点，因而导致由同一植株产生的一批种子，其休眠性并非一致，种子的萌发率低。短柄五加种子不同个体胚休眠存在显著差异，在同一时间内所处的分化和生长状态不尽相同，发芽极不整齐，这可能也是造成种子萌发率低的原因。短柄五加种子发芽率总体不高，这可能与种子的成熟度参差不齐，或受精不良、胚与胚乳发育不良等因素有关。
2.4播种
2017年4月20日播种，5月4日后陆续出苗，6月26日苗高2～5cm时统计出苗情况;2018年4月26日统计成苗情况，结果见表6。
以短柄五加千粒重平均湿重8.24g，饱满种子的潜在活力为62.4%计，200g鲜种子应有15145粒种子出苗，实际播种后出苗率平均仅11.47%，出苗率最高的与沙床发芽试验的17.19%相差不大，各畦之间差异较大，说明种子播种时的覆土厚度与均匀度值得注意。另外苗圃的苗期遮阴也应给予重视，第6畦出苗率低的原因主要是该畦靠遮阴棚的东边，东边围挡遮阴不如其他畦子。
第二年10月观测成苗情况：普遍苗高80～120cm，最高达190cm。实生苗根系发达，主根粗壮，侧根较多，苗木质量好，完全可以出圃定植。
3结论
3.1种子处理方法
短柄五加种子具有较高的休眠特性，种子在采收后应及时处理，须经过20、15和10℃各处理30d或室温连续处理90d，以完成胚的分化与生长，再在5℃低温下处理60d以上，完成胚的继续生长和生理后熟，才能发芽，可作为适时播种所用种子有效的处理方法。
3.2播种处理种子要在4月中下旬前播种，浅播，搭拱形棚和遮阳棚，并加强苗期管理。
3.3提高种子质量
通过人工授粉提高种子的成胚率和质量，或通过栽培提高种子的质量以提高种子育苗的成功率，增加苗木数量。
参考文献
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[3]张晋宁，章英才.短柄五加生态环境及濒危原因的研究[C]∥中国土木工程学会.西部大开发科教先行与可持续发展——中国科协2000年学术年会文集.北京：中国科学技术出版社，2000：1139.
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[12]田国伟，王仲礼，刘林德，等.短柄五加种子结构、后熟作用及其细胞化学研究[J].植物分类学报，1998，36（2）：128-133.
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关键词 短柄五加;种子层积变温沙藏处理;种胚发育;种子育苗技术
中图分类号 S.567文献标识码A文章编号0517-6611（2021）07-0057-04
Abstract[Objective]ToexplorethedevelopmentlawofEleutherococcusbrachypus（Harms）Nakaiseeds，shortentheafterripeningtimeofseedsandincreasethesuccessrateofseedbreeding.[Method]Thesandstoragetreatmentofseedstratificationwithvariabletemperaturewasusedtoshortentheseedafterripeningtime，shallowsowingandstrengthenthemanagementofseedlingtoincreasetherateofseedling.[Result]Thepostripeningperiodoftheseedswasshortenedto150dafterthesandstoragetreatmentofseedstratificationwithvariabletemperature，andthepercentageofembryoswithembryoincreasedfromlessthan14.13%tomorethan84.62%，andtheproportionofmatureembryoslargerthan3.00mmwasmorethan75%，thegerminationratewas4.56%-13.05%at150dand17.19%-47.56%at180d.Theseedemergenceratereached（11.47±3.73）%andthetwoyearseedlingratereached（79.44±5.18）%.[Conclusion]ThedevelopmentlawofEleutherococcusbrachypus（Harms）Nakaiseedshasbeenpreliminarilymastered，andthemethodofshorteningtheafterripeningtimeoftheseedsbythetreatmentofvariabletemperaturestratificationsandstoragehasbeenestablished，andthedifficultproblemofseedgerminationhasbeensolved，atthesametime，thesowingmethodandfieldmanagementtechniqueshavebeenstudied，whichlaidafoundationfortheseedbreedingandpopularization.
KeywordsEleutherococcusbrachypus（Harms）Nakai;Sandstoragetreatmentofseedstratificationwithvariabletemperature;Seedembryodevelopment;Seedseedlingraisingtechnique
短柄五加（Eleutherococcusbrachypus（Harms）Nakai）为五加科五加属植物，以根和根茎或茎入药，与刺五加有相似的化学成分和药理作用[1]，具扶正固本、养心安神、补肾健脾、解郁和血的功效;主治脾肾阳虚、腰膝酸软、体虚乏力、失眠多梦、食欲不振、风寒湿痹等病癥[2]，以其为主要原料制成的五加冲剂、神衰康胶囊、佳蓉片等药品在治疗神经衰弱、男子性机能障碍、妇女更年期综合征等方面取得了满意疗效。
短柄五加仅分布于我国陕甘宁交界的黄土高原地区，现仍以野生植物入药，长期的开发利用，使其资源量急剧减少，为用药安全，应大力开展短柄五加的人工栽培，但首先遇到的难题就是种苗繁育问题。有性生殖具有扩大种群分布范围、增加种群数量、丰富遗传多样性的重要作用，因此，种子育苗是解决种苗来源的有效手段之一。
短柄五加种子繁殖存在的主要问题：一是结实株丛少，种子产量低;花粉量少，传粉率低，胚囊退化与败育导致受精率降低，产生不育种子，造成种子质量差[3];短柄五加饱满种子千粒重平均湿重8.24g，饱满种子占种子产量的28.29%～56.85%，饱满种子的潜在活力为62.4%，且种子活力与实际出苗率仍有相当大的差距[4]。二是短柄五加和五加属的其他植物[5-9]一样，存在种子休眠程度高、发芽率低的现象。果实成熟时种胚细小，结构不完整，无胚根、胚芽和子叶的分化，种子成熟度极不均匀，多数种胚处于胚原基或心形胚阶段，少数甚至无胚;种子不具备萌发能力，需要在适宜的温湿度条件下经过一段时间完成胚的分化与生长，形成具有胚根、胚轴、胚芽和子叶的完整胚，完成胚的形态后熟，然后在低温下再经过一段时间完成胚的生理后熟，从而解除种子休眠，播种后在适宜条件下发芽出苗。 如何缩短种子后熟时间，提高出苗率成为短柄五加种子育苗的技术关键。为此，笔者通过探索在不同条件下种子层积沙藏处理，初步掌握了种子发育规律，建立了种子层积变温沙藏处理的方法，缩短了种子后熟时间，解决了种子发芽难的问题，同时对短柄五加播种育苗过程中的圃地选择、播种时间、播种方法、田间管理等进行了研究，为短柄五加的种子育苗和推广应用奠定了基础。
1材料与方法
1.1试验地概况
试验地设在陕西省旬邑县马栏镇长舌头村（108°25′28″E，35°15′24″N，海拔1430m），属基本农田，壤土，肥力中等，较平整，用水方便，交通便利。该地区年平均气温9.1℃，1月平均氣温最低-4.6℃，7月平均气温最高21.5℃，昼夜温差较大。日照时数2390h。无霜期180d。年均降水量606mm。
1.2种子采制
每年9月25日—10月15日为短柄五加果实的成熟期，此时果实变成黑紫色，发软。采集时选择枝条生长健壮、年龄3～5年、光照条件较好的植株果实进行采集。将采摘的果实尽快用清水浸泡48h，搓去果皮和果肉，用清水反复漂洗后捞出沉下来的种子，摊开，放通风处阴干1d，簸弃瘪粒和虫粒，然后将饱满的种子立即进行处理。种子扁肾形或月牙形，两面微凸，红棕色、棕色和土黄色。
1.3种子层积沙藏处理
1.3.1沙子准备。取过筛除去粗沙与细沙的干净河沙，120℃处理6h杀菌，放冷后1kg沙子加入80%的多菌灵5g拌匀，备用。
1.3.2种子准备。饱满种子7份，每份300g，其中黄龙县野生的6份，旬邑县栽培的1份。
1.3.3种子前处理。
A处理用0.20%的多菌灵和0.1%DDV（敌敌畏）溶液2000mL浸种22h;D、E、F、G种子处理方法均同A。
B处理用含0.20%的多菌灵、0.1%DDV溶液和1.0mg/L赤霉素液2000mL浸种22h。
C处理用0.20%的多菌灵和0.1%DDV溶液2000mL浸种22h，捞出种子，淋干;再用改良的MS培养液（1/4大量元素、1/4微量元素、1/2铁盐和1/6有机成分，10mg/L6-苄基嘌呤，20mg/L吲哚乙酸，1mg/L激动素）1000mL浸种48h（表1）。
1.3.4种子层积沙藏处理。将上述处理的种子取出，淋干，分别加入1500g处理好的沙子拌匀，装入塑料饭盒进行培养。种子层积处理期间每隔7～10d翻动1次，保持好湿度和种子的透气性。
1.3.5种子培养方式。A、B、C处理先在18℃培养120d，后转入5℃继续培养60d。D处理实验室变温培养（20～10℃）120d，后转入5℃继续培养60d。E处理实验室变温培养（20～15℃）90d后转入5℃继续培养60d。F、G处理在20、15、10℃各培养30d，然后转入5℃继续培养60d。
1.4种子层积过程监测
1.4.1监测指标。为监测层积沙藏处理期间种胚的变化，参考文献[10-11]的方法以种子活力、种子见胚率、种子胚长作为监测指标。
1.4.2种子活力测定。用四氮唑（TTC）法测定种子的活力。
TTC溶液配制：称取TTC（Sigma）1.0g，加少量95%乙醇溶解，再用pH6.8的磷酸盐缓冲液定容至100mL。
种子活力测定：每次每样随机抽取30粒以上。未处理的种子用30℃温水浸泡24h或层积处理中的种子用30℃温水浸泡4h，使种子充分吸胀，吸胀后用滤纸吸去种子表面的水分，用解剖刀沿种胚中央准确切开，取其一半浸于1.0%TTC溶液中，于32～36℃培养箱中避光保持24h进行染色，然后清水冲掉溶液，保持湿润，体视显微镜下观察种子切面，根据着色情况统计有生活力的种子数，用测微尺测量其种胚大小并观察胚的形态（对未见胚种子，以胚乳的反应颜色进行统计）。
1.4.3种子见胚率。为胚长≥0.1mm的种子粒数占供测种子粒数的百分率。
1.4.4种子胚长的划分。依据短柄五加种胚的长度，形态可粗分为0.10～0.60mm的胚接近于球形;0.61～1.50mm的胚子叶与胚根等宽，呈棒状;1.51～3.00mm的胚子叶宽度大于胚根，形态近似于葫芦形;大于3.00mm的胚呈蝌蚪形，为具子叶、胚根、胚轴、胚芽的分化成熟胚。成熟胚率为胚长大于3.00mm的成熟胚占具胚种子的百分比。
1.5发芽试验
1.5.1培养皿发芽。随机抽取处理裂口的种子，分成3份，每份100粒，置于培养皿中用0.20%多菌灵溶液浸泡过的滤纸上，15℃发芽。
1.5.2花盆发芽试验。取装有80%沙土的花盆4只，浇透水，在每个花盆中平摆100粒培养至裂口的种子，分别上铺厚1cm的湿沙或1cm的湿黄土，套塑料袋在室温（10～18℃）下发芽。
1.5.3沙床发芽。将处理的种子放在厚度3cm沙床上，在10℃的生化培养箱中进行培养，定期观察发芽种子数。
1.6播种
1.6.1选地。选择交通方便、具备灌溉条件、排水良好、土质疏松、肥沃向阳的壤土、地势平坦或缓坡地块，忌黄黏土和涝洼地。
1.6.2整地作畦。将选好的田地进行深耕细耙，再根据地形做成低畦，畦面宽1.3m，畦间距0.6m，畦长10m，南北向。
1.6.3搭遮阳棚。选择高度约2.5m的木桩，按3.6m×3.5m的距离栽桩，栽桩深度0.5m，棚高约1.8m，用14号铁丝进行米字型拉网，周围和上面搭双层遮阳网。
1.6.4播种。处理种子于4月中下旬前播种。播前，畦内浇透水，待水完全渗完后，再将每份200g的处理种子，添加80%多菌灵粉135g及少量细沙拌匀后均匀撒播于畦面，最后再用筛子均匀覆盖一层厚约0.5cm的锯末拌细土（2∶1）。逐畦搭拱形保温保湿棚，覆盖农膜。 1.7种苗的苗期管理
1.7.1撤去拱棚。播种后15～45d小苗陆续出土，当小苗长到3～5片复叶时，可于09：00前揭开拱棚两端，18：00后盖棚，如此炼苗10d后，方可撤掉拱棚。
1.7.2浇水除草。幼苗出土后很嫩弱，抗逆性能较差，前期生长也很缓慢，为使幼苗得到充足的水和光，使其健壮生长，出苗撤棚后应及时人工拔草，避免杂草根系盘结而在拔草时带出幼苗，每次拔草后应及时洒水。幼苗生长初期，苗小根系短、深入土层浅、需水量不大，但要保持苗床湿润，洒水宜多次少量。生长后期，正是充实组织、硬化枝干、增强抗寒能力阶段，一般情况下可少浇水或不浇水。
1.7.3间苗补苗。间苗时间可在幼苗高3～5cm时进行，原则是应将密集处的小苗带土移开，向稀疏地段移栽。株距5cm为宜。短柄五加是阔叶植物，保留株数过多透光通风不良，易感染病害。将间出的苗带土就近补植到缺苗之处，补苗最好选择阴雨天或傍晚进行，补苗后及时浇水提高補苗成活率。2年苗龄的短柄五加幼苗的株距应扩大1倍，因为苗木拥挤生长，会严重影响苗木的质量，降低成活率。
1.7.4培土、出圃。秋末向枝条基部培土厚3～5cm。第3年3月上中旬苗木未发芽前可以出圃移栽。
2结果与分析
2.1种子的具胚率
种子的初始具胚率与果实采集时种子的成熟度有较强的相关性，与产地和年份有关。2015年和2016年黄龙县种子的初始具胚率分别为0和14.13%;在种子形态后熟期（A～D培养120d，E～G培养90d）转入低温培养时所有处理种子的具胚率均超过55%，初始由于种胚太小，抽样与解剖均存在较大的误差;在所有处理中，变温培养（D～G）明显优于恒温培养（A～C），植物激素对种子具胚率的影响作用不明显（C），在完成生理后熟时除C处理外其他处理种子的具胚率达84%以上（表2）。
2.2种胚的生长
短柄五加种子发芽率低的主要原因是种胚成熟度不够所致的休眠程度高，自然播种到出苗需要540～660d，且发芽率仅1.67%[12]。要解除种子休眠需要经过适当的处理缩短种子完成胚形态后熟及生理后熟的时间。
在胚长及3mm以上成熟胚所占比例方面，前期的变温处理（D）优于恒温处理（A、B、C），加赤霉素处理（B）与不加赤霉素处理（A）差异不显著，用改良MS培养基处理的种子（C）较其他处理（A、B、D）差。进一步的试验是先进行20～10℃变温层积（E、F、G）处理90d以完成种胚的分化与生长，然后再转入5℃低温处理60d完成胚的继续生长及生理后熟，经过150d以上的变温处理还有7.69%～15.38%的种子仍看不到种胚，这部分种子很可能是败育的种子，但大于3.00mm的成熟胚所占比例高达75%以上。种胚生长最适温度为5～10℃。从种胚的生长来看，室温和培养箱变温培养均可行，开始室温略优于培养箱，后面培养箱优于室温。培养箱中的处理胚大小比较均匀，室温中的处理胚大小差异较大。通气性和湿度对种子活力影响较大。种子变温处理150d时有4.56%～13.05%的种子发芽，变温处理180d时种子发芽率达17.19%～47.56%，此时正是3月中旬—4月中旬，可进行适时播种（表3、4）。
2.3发芽试验
2.3.1培养皿发芽。处理的裂口种子平均发芽率高达95%。
2.3.2花盆发芽试验。上铺湿沙的出苗率为65%，上铺湿黄土的未见出苗，说明种子的顶土能力较差。
2.3.3沙床发芽。取经20、15和10℃各培养30d，再转入5℃处理60d的种子，放在厚度3cm沙床上，在10℃的生化培养箱中继续培养，进行发芽试验，结果见表5。
不同产地野生的短柄五加种子经变温层积处理后，种子发芽率差异不大，野生与栽培种子的发芽率差异极显著，因此培育优良种子是提高短柄五加种子育苗成功率的有效措施之一。
Allen等[13]认为同种植物的不同个体、不同年份，同一母株的不同花序或相同花序内不同位置的种子，皆有可能有不同的休眠特点，因而导致由同一植株产生的一批种子，其休眠性并非一致，种子的萌发率低。短柄五加种子不同个体胚休眠存在显著差异，在同一时间内所处的分化和生长状态不尽相同，发芽极不整齐，这可能也是造成种子萌发率低的原因。短柄五加种子发芽率总体不高，这可能与种子的成熟度参差不齐，或受精不良、胚与胚乳发育不良等因素有关。
2.4播种
2017年4月20日播种，5月4日后陆续出苗，6月26日苗高2～5cm时统计出苗情况;2018年4月26日统计成苗情况，结果见表6。
以短柄五加千粒重平均湿重8.24g，饱满种子的潜在活力为62.4%计，200g鲜种子应有15145粒种子出苗，实际播种后出苗率平均仅11.47%，出苗率最高的与沙床发芽试验的17.19%相差不大，各畦之间差异较大，说明种子播种时的覆土厚度与均匀度值得注意。另外苗圃的苗期遮阴也应给予重视，第6畦出苗率低的原因主要是该畦靠遮阴棚的东边，东边围挡遮阴不如其他畦子。
第二年10月观测成苗情况：普遍苗高80～120cm，最高达190cm。实生苗根系发达，主根粗壮，侧根较多，苗木质量好，完全可以出圃定植。
3结论
3.1种子处理方法
短柄五加种子具有较高的休眠特性，种子在采收后应及时处理，须经过20、15和10℃各处理30d或室温连续处理90d，以完成胚的分化与生长，再在5℃低温下处理60d以上，完成胚的继续生长和生理后熟，才能发芽，可作为适时播种所用种子有效的处理方法。
3.2播种处理种子要在4月中下旬前播种，浅播，搭拱形棚和遮阳棚，并加强苗期管理。
3.3提高种子质量
通过人工授粉提高种子的成胚率和质量，或通过栽培提高种子的质量以提高种子育苗的成功率，增加苗木数量。
参考文献
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