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摘要 [目的] 为进一步评价瑞鲍迪甙A的安全性积累资料。[方法] 于大鼠孕7～17 d经口给予340、1 130和3 400 mg/kg b.w. 劑量的瑞鲍迪甙A，观察母鼠和仔鼠的生长发育情况，研究瑞鲍迪甙A对大鼠的生殖毒性和胚胎毒性。[结果]各剂量瑞鲍迪甙A组孕鼠行为正常，无中毒和死亡情况。各剂量瑞鲍迪甙A组黄体数、着床数、活胎率、窝仔数及畸胎率、活胎仔畸形率及母体畸胎率等与正常对照组均无显著差异（P>0.05）。[结论]瑞鲍迪甙A对大鼠无明显生殖毒性及胚胎毒性和致畸作用。
关键词 瑞鲍迪甙A；致畸作用；Wistar大鼠
中图分类号 S859 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）05-131-02
Study on the Teratogenicity of Rebaudioside A in Wistar Rats
WANG Yujing1， LU Qianqian1， YU Zhengrong1， ZHANG Yumei1，2* et al
（1.College of Veterinary Medicine， Yangzhou University， Yangzhou， Jiangsu 225009； 2. Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses， Yangzhou， Jiangsu 225009）
Abstract [Objective] The research aimed to provide materials for evaluating the safety of rebaudioside A futher. [Method] Rats were administrated with rebaudioside A at the doses of 340， 1 130 and 3 400 mg/kg b.w by gavage from the 7th day to the 17th day during the gestation. The growth and development laws of mother rats and baby rats were observed. And the reproductive toxicity and fetal toxicity of rebaudioside A to rats were studied. [Result] Abnormal behaviours， toxic symptom and death were not found on tested rats. And there was no significant difference of the luteal count， implanted number and live fetus rate， litter size， abnormal fetus rate， abnormal rate of live fetus and maternal teratogenic rate in the groups of different doses of rebaudioside A had no significant difference with that on control group（P>0.05） . [Conclusion] Rebaudioside A had no obvious reproductive toxicity， embryo toxicity and teratogenic effect on Wistar rats.
Key words Rebaudioside A； Teratogenic effect； Wistar rats
基金项目 江苏高校优势学科建设工程资助项目；扬州大学“新世纪人才”工程资助项目。
作者简介
王雨晶（1991-），男，江苏南京人，硕士研究生，研究方向：兽医药理及毒理学。*通讯作者，教授，博士，硕士生导师，从事药理及毒理学研究。
收稿日期 20141223
甜菊糖苷是从菊科植物甜叶菊叶片中提取得到的一类天然的低热量的高倍甜味剂，其甜度为蔗糖的250～300倍，热量仅为蔗糖的1/250左右[1-2]。甜菊糖苷因其高甜度、低热量、味质好、无毒副作用等特点，在食品工业上得到了广泛应用。瑞鲍迪甙A是甜菊糖苷中甜度最高的一种糖苷，甜度约为蔗糖的450倍，纯化的瑞鲍迪甙A甜味纯正，甜味最接近蔗糖，可作为甜菊糖的精加工高端产品，在饮料、调味品和供给糖尿病患者食用的蜜饯、果脯中可应用[3-6]。
2008年，在食品添加剂专家委员会（JECFA）第69届会议上规定了甜菊糖苷每日允许摄入量（ADIS），以甜菊醇表示，ADIS为0～4 mg/kg体重[7]。同年，美国药品食品管理局（FDA）批准允许在食品中使用甜叶菊提取物瑞鲍迪苷A。2012年，法国成为欧盟第一个批准在食品和饮料产品内使用高纯度瑞鲍迪苷A（97%）的国家[8]。据报道，瑞鲍迪苷A在体内主要代谢为甜菊醇[9]，而甜菊醇体外试验中表现出一定的致突变性[10-11] ，以及目前瑞鲍迪苷A的代谢和毒理方面的资料不完整，其食用安全性还存在着争议，国内相关研究也较少。笔者对较高纯度的瑞鲍迪苷A进行了大鼠传统致畸试验，以期为进一步评价其食用（饲用）安全性积累资料。
1 材料与方法
1.1 实验动物
Wistar大鼠（清洁级），10周龄，由扬州大学比较医学中心提供，动物生产许可证号为SCXK（苏）2012-0004，使用许可证号为SYXK（苏）2012-0029。 1.2 孕鼠的获得
Wistar大鼠按雌雄比1∶1合笼过夜，次日清晨检查阴道栓，以见栓的当天为孕0 d。每組13只受精鼠，以保证试验结束时每组妊娠母鼠数不少于10只。
1.3 受试物的给予及染毒剂量
瑞鲍迪苷A，含量≥97%，批号为2012-002P，由上海永优生物技术公司生产。
瑞鲍迪甙A用蒸馏水配制成适宜浓度，采用灌胃法给予孕鼠，灌胃体积为10.0 ml/kg体重。
瑞鲍迪甙A分为3 400、1 130和340 mg/kg b.w.3个剂量组；另设置阴性（蒸馏水）对照组。于检栓后第7～17天连续给予，每天1次。
1.4 观察指标
试验期间每周称取母鼠体重，观察受孕大鼠的妊娠情况和胚胎发育情况。
在受孕第20天处死孕鼠，取出子宫，称取窝重、胎盘重，统计活产幼仔数、死胎以及吸收胎数，按窝计算活产胎仔平均体重。按照传统致畸试验指导原则[12]，先进行外观畸形检查，然后进行内脏及软组织畸形检查，再进行骨骼畸形检查，最后统计畸胎总数和畸形总数。分析与正常对照组比畸胎率、活胎仔平均畸形率和母体畸胎率的差异性。
1.5 数据处理
数据统计与分析采用SPSS12.0软件进行，显著性分析采用ANOVA检验或χ2检验。
2 结果与分析
瑞鲍迪甙A在340～3 400 mg/kg b.w. 范围内孕鼠行为正常，无中毒和死亡情况。
由表1可知，试验期间不同处理对孕鼠的体重增加无明显影响（P﹥0.05）。瑞鲍迪甙A对母鼠的生殖机能指标（黄体数、着床数、活胎率、窝仔数等）与正常对照组无明显差异（表2）。由表3可知，各剂量组平均卵巢重、胎仔平均体重、体长、胎盘重、性别比及吸收胎率等与正常对照组无统计学差异（P>0.05）。瑞鲍迪甙A试验组未出现死胎，在外观畸形、骨骼畸形及内脏畸形检查中畸胎率、活胎仔畸形率及母体畸胎率，与正常对照组无显著差异（P>0.05）。
3 结论与讨论
瑞鲍迪甙A在340～3 400 mg/kg b.w. 范围内，对Wistar大鼠无明显生殖毒性及胚胎毒性。该试验中采用的瑞鲍迪甙A剂量分别相当于1/10、1/30和1/100 LD50。
传统致畸试验是应用试验动物鉴定外来化合物致畸性的最基本的试验，可用于评价受试物作用于妊娠母体，干扰胚胎的正常发育，导致先天性畸形的毒作用。通过致畸试验可以检测受试物导致胚胎死亡、结构畸形及生长迟缓的毒作用。
Curry等[13]对瑞鲍迪甙A进行的亚慢性毒性试验中，也考察了对繁殖性能的影响，包括交配性能、生育能力、妊娠长度、发情周期、精子活力、浓度及形态，结果表明无生殖毒性问题，与该试验的结果一致。鉴于瑞鲍迪甙A的主要代谢物甜菊醇存在着一定的体外致突变作用，对其生殖及胚胎毒性的研究还需要深入研究。
参考文献
[1]
胡献丽， 董文宾， 郑丹， 等. 甜菊及甜菊糖研究进展[J]. 食品研究与开发， 2005， 26（1）： 36-38.
[2] 孙传范，李进伟.甜菊糖苷研究进展[J]. 食品科学， 2010， 31（9）：338-340.
[3] SUSANN ZAHN，ANNE FORKER，LYDIA KRGEL，et al. Combined use of rebaudioside A and fibres for partial sucrose replacement in muffins[J]. LWTFood Sci Techno，2013，50：695-701.
[4] 路勇，胡国华.莱鲍迪A苷的研究进展[J].添加剂与营养，2012（6）：50-51.
[5] WANG L S， SHI Z， SHI B M， et al. Effects of dietary stevioside/rebaudioside A on the growth performance and diarrhea incidence of weaned piglets[J]. Animal Feed Sci Techno， 2014， 187：104-109.
[6] 杨旭艳，路勇，胡国华. 新型天然高倍甜味剂-莱鲍迪苷A[J]. 中国食品添加剂， 2012（37）：77-81.
[7] JECFA/69/SC，Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives Sixtyninth meeting[R].Italy：Summary and Conclusion Rome，2008.
[8] 法国提高食品中添加甜菊糖苷的限量[J]. 饲料工业，2010， 13（2）：6.
[9] ROBERTS A， RENWICK A G. Comparative toxicokinetics and metabolism of rebaudioside A， stevioside and steviol in rats[J]. Food Chem Toxicol， 2008， 46（S7）：31-39.
[10] SUTTAJIT M， VINITKETKAUMNUEN U， MEEVATEE U， et al. Mutagenicity and human chromosomal effect of stevioside， a sweetener from Stevia rebaudiana Bertoni[J]. Environ Health Perspec， 1993， 101：53-56.
[11] MATSUI M ， MATSUI K， KAWASAKI Y， et al. Evaluation of the genotoxicity of stevioside and steviol using six in vitro and one in vivo mutagenicity assays[J]. Mutagenesis， 1996， 11：573.
[12] 中华人民共和国农业部公告第1247号，兽药大鼠传统致畸试验指导原则[S].2009.
[13] CURRY L L， ROBERTS A. Subchronic toxicity of rebaudioside A[J]. Food Chem Toxicol，2008，46：1-20.
责任编辑 乔利利 责任校对 况玲玲
关键词 瑞鲍迪甙A；致畸作用；Wistar大鼠
中图分类号 S859 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）05-131-02
Study on the Teratogenicity of Rebaudioside A in Wistar Rats
WANG Yujing1， LU Qianqian1， YU Zhengrong1， ZHANG Yumei1，2* et al
（1.College of Veterinary Medicine， Yangzhou University， Yangzhou， Jiangsu 225009； 2. Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses， Yangzhou， Jiangsu 225009）
Abstract [Objective] The research aimed to provide materials for evaluating the safety of rebaudioside A futher. [Method] Rats were administrated with rebaudioside A at the doses of 340， 1 130 and 3 400 mg/kg b.w by gavage from the 7th day to the 17th day during the gestation. The growth and development laws of mother rats and baby rats were observed. And the reproductive toxicity and fetal toxicity of rebaudioside A to rats were studied. [Result] Abnormal behaviours， toxic symptom and death were not found on tested rats. And there was no significant difference of the luteal count， implanted number and live fetus rate， litter size， abnormal fetus rate， abnormal rate of live fetus and maternal teratogenic rate in the groups of different doses of rebaudioside A had no significant difference with that on control group（P>0.05） . [Conclusion] Rebaudioside A had no obvious reproductive toxicity， embryo toxicity and teratogenic effect on Wistar rats.
Key words Rebaudioside A； Teratogenic effect； Wistar rats
基金项目 江苏高校优势学科建设工程资助项目；扬州大学“新世纪人才”工程资助项目。
作者简介
王雨晶（1991-），男，江苏南京人，硕士研究生，研究方向：兽医药理及毒理学。*通讯作者，教授，博士，硕士生导师，从事药理及毒理学研究。
收稿日期 20141223
甜菊糖苷是从菊科植物甜叶菊叶片中提取得到的一类天然的低热量的高倍甜味剂，其甜度为蔗糖的250～300倍，热量仅为蔗糖的1/250左右[1-2]。甜菊糖苷因其高甜度、低热量、味质好、无毒副作用等特点，在食品工业上得到了广泛应用。瑞鲍迪甙A是甜菊糖苷中甜度最高的一种糖苷，甜度约为蔗糖的450倍，纯化的瑞鲍迪甙A甜味纯正，甜味最接近蔗糖，可作为甜菊糖的精加工高端产品，在饮料、调味品和供给糖尿病患者食用的蜜饯、果脯中可应用[3-6]。
2008年，在食品添加剂专家委员会（JECFA）第69届会议上规定了甜菊糖苷每日允许摄入量（ADIS），以甜菊醇表示，ADIS为0～4 mg/kg体重[7]。同年，美国药品食品管理局（FDA）批准允许在食品中使用甜叶菊提取物瑞鲍迪苷A。2012年，法国成为欧盟第一个批准在食品和饮料产品内使用高纯度瑞鲍迪苷A（97%）的国家[8]。据报道，瑞鲍迪苷A在体内主要代谢为甜菊醇[9]，而甜菊醇体外试验中表现出一定的致突变性[10-11] ，以及目前瑞鲍迪苷A的代谢和毒理方面的资料不完整，其食用安全性还存在着争议，国内相关研究也较少。笔者对较高纯度的瑞鲍迪苷A进行了大鼠传统致畸试验，以期为进一步评价其食用（饲用）安全性积累资料。
1 材料与方法
1.1 实验动物
Wistar大鼠（清洁级），10周龄，由扬州大学比较医学中心提供，动物生产许可证号为SCXK（苏）2012-0004，使用许可证号为SYXK（苏）2012-0029。 1.2 孕鼠的获得
Wistar大鼠按雌雄比1∶1合笼过夜，次日清晨检查阴道栓，以见栓的当天为孕0 d。每組13只受精鼠，以保证试验结束时每组妊娠母鼠数不少于10只。
1.3 受试物的给予及染毒剂量
瑞鲍迪苷A，含量≥97%，批号为2012-002P，由上海永优生物技术公司生产。
瑞鲍迪甙A用蒸馏水配制成适宜浓度，采用灌胃法给予孕鼠，灌胃体积为10.0 ml/kg体重。
瑞鲍迪甙A分为3 400、1 130和340 mg/kg b.w.3个剂量组；另设置阴性（蒸馏水）对照组。于检栓后第7～17天连续给予，每天1次。
1.4 观察指标
试验期间每周称取母鼠体重，观察受孕大鼠的妊娠情况和胚胎发育情况。
在受孕第20天处死孕鼠，取出子宫，称取窝重、胎盘重，统计活产幼仔数、死胎以及吸收胎数，按窝计算活产胎仔平均体重。按照传统致畸试验指导原则[12]，先进行外观畸形检查，然后进行内脏及软组织畸形检查，再进行骨骼畸形检查，最后统计畸胎总数和畸形总数。分析与正常对照组比畸胎率、活胎仔平均畸形率和母体畸胎率的差异性。
1.5 数据处理
数据统计与分析采用SPSS12.0软件进行，显著性分析采用ANOVA检验或χ2检验。
2 结果与分析
瑞鲍迪甙A在340～3 400 mg/kg b.w. 范围内孕鼠行为正常，无中毒和死亡情况。
由表1可知，试验期间不同处理对孕鼠的体重增加无明显影响（P﹥0.05）。瑞鲍迪甙A对母鼠的生殖机能指标（黄体数、着床数、活胎率、窝仔数等）与正常对照组无明显差异（表2）。由表3可知，各剂量组平均卵巢重、胎仔平均体重、体长、胎盘重、性别比及吸收胎率等与正常对照组无统计学差异（P>0.05）。瑞鲍迪甙A试验组未出现死胎，在外观畸形、骨骼畸形及内脏畸形检查中畸胎率、活胎仔畸形率及母体畸胎率，与正常对照组无显著差异（P>0.05）。
3 结论与讨论
瑞鲍迪甙A在340～3 400 mg/kg b.w. 范围内，对Wistar大鼠无明显生殖毒性及胚胎毒性。该试验中采用的瑞鲍迪甙A剂量分别相当于1/10、1/30和1/100 LD50。
传统致畸试验是应用试验动物鉴定外来化合物致畸性的最基本的试验，可用于评价受试物作用于妊娠母体，干扰胚胎的正常发育，导致先天性畸形的毒作用。通过致畸试验可以检测受试物导致胚胎死亡、结构畸形及生长迟缓的毒作用。
Curry等[13]对瑞鲍迪甙A进行的亚慢性毒性试验中，也考察了对繁殖性能的影响，包括交配性能、生育能力、妊娠长度、发情周期、精子活力、浓度及形态，结果表明无生殖毒性问题，与该试验的结果一致。鉴于瑞鲍迪甙A的主要代谢物甜菊醇存在着一定的体外致突变作用，对其生殖及胚胎毒性的研究还需要深入研究。
参考文献
[1]
胡献丽， 董文宾， 郑丹， 等. 甜菊及甜菊糖研究进展[J]. 食品研究与开发， 2005， 26（1）： 36-38.
[2] 孙传范，李进伟.甜菊糖苷研究进展[J]. 食品科学， 2010， 31（9）：338-340.
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[4] 路勇，胡国华.莱鲍迪A苷的研究进展[J].添加剂与营养，2012（6）：50-51.
[5] WANG L S， SHI Z， SHI B M， et al. Effects of dietary stevioside/rebaudioside A on the growth performance and diarrhea incidence of weaned piglets[J]. Animal Feed Sci Techno， 2014， 187：104-109.
[6] 杨旭艳，路勇，胡国华. 新型天然高倍甜味剂-莱鲍迪苷A[J]. 中国食品添加剂， 2012（37）：77-81.
[7] JECFA/69/SC，Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives Sixtyninth meeting[R].Italy：Summary and Conclusion Rome，2008.
[8] 法国提高食品中添加甜菊糖苷的限量[J]. 饲料工业，2010， 13（2）：6.
[9] ROBERTS A， RENWICK A G. Comparative toxicokinetics and metabolism of rebaudioside A， stevioside and steviol in rats[J]. Food Chem Toxicol， 2008， 46（S7）：31-39.
[10] SUTTAJIT M， VINITKETKAUMNUEN U， MEEVATEE U， et al. Mutagenicity and human chromosomal effect of stevioside， a sweetener from Stevia rebaudiana Bertoni[J]. Environ Health Perspec， 1993， 101：53-56.
[11] MATSUI M ， MATSUI K， KAWASAKI Y， et al. Evaluation of the genotoxicity of stevioside and steviol using six in vitro and one in vivo mutagenicity assays[J]. Mutagenesis， 1996， 11：573.
[12] 中华人民共和国农业部公告第1247号，兽药大鼠传统致畸试验指导原则[S].2009.
[13] CURRY L L， ROBERTS A. Subchronic toxicity of rebaudioside A[J]. Food Chem Toxicol，2008，46：1-20.
责任编辑 乔利利 责任校对 况玲玲