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摘要：目的 初步探讨藏药水母雪莲SMM（Saussurea medusa Maxim）的抗肿瘤免疫功能，为进一步开发水母雪莲药用价值提供科学依据。方法 建造lewis荷瘤小鼠模型后，随机分为生理盐水组（normal saline，NS）、SMM黄酮类组和环磷酰胺（Cyclophosphamide，CTX）组，体外治疗14天。以lewis荷瘤小鼠肿瘤组织HE形态染色以及血清中IL-2和IFN-γ为检测指标。结果 lewis荷瘤小鼠经SMM黄酮类提取物治疗后，肿瘤浸润组织部位的肿瘤细胞出现局灶性或者片状坏死并伴有新生血管形成;还提高了荷瘤小鼠血清中IL2和IFN-γ的含量。结论 水母雪莲黄酮类提取物有一定抗肺癌免疫治疗的效应。
关键字：水母雪莲;抗肿瘤效应
[Abstract] Objective To preliminarily explore the anti-tumor immune function of Saussurea medusa Maxim （Saussurea medusa Maxim）， and provide scientific basis for further development of the medicinal value of Saussurea medusa Maxim. Methods After the lewis tumor-bearing mouse model was constructed， they were randomly divided into normal saline ， SMM flavonoids and cyclophosphamide groups. They were treated in vitro for 14 days.The HE morphological staining of tumor tissue and serum IL-2 and IFN-γ in Lewis tumor-bearing mice were used as the detection indicators. Results After lewis tumor-bearing mice were treated with SMM flavonoids extract， focal or patchy necrosis of tumor cells and neovascularization were found in tumor infiltrating tissues; it also increased the levels of IL2 and IFN-γ in serum of tumor-bearing mice. Conclusion The flavonoid extract of Saussurea medusa has a certain anti-lung cancer immunotherapy effect.
肿瘤是严重威胁人类健康的一种疾病。其中肺癌的发病率逐年增高，也是致死率最高的癌症之一。其主要治疗方法包括手术、放疗和化疗等，但是该治疗方案会导致患者免疫功能紊乱，预后差[1]。近几年随着人们对肿瘤治疗的不断研究和深入，发现在恶性肿瘤的综合治疗中，中医药可以通过调节机体的免疫机制来发挥抗肿瘤作用且毒副作用小[2]。因此本文采用lewis荷瘤小鼠为研究对象，初步探讨藏药水母雪莲黄酮类的抗肿瘤作用，以期为肿瘤临床治疗及靶向药物开发提供新的思路。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要材料
SPF级野生型C57BL/6小鼠（6～8周龄、20～25 g）购于达科为生物公司，饲养于西藏民族大学实验动物科学部。Lewis肺癌细胞株3LL由上海复旦大学赠予。水母雪莲选择西藏山南野生品种。CTX购自江苏恒瑞制药公司。多聚甲醛、二甲苯购于武汉科瑞生物技术有限公司。鼠IL-2（高敏）试剂盒、小鼠IFN-γ（高敏）试剂盒购自深圳欣博盛生物科技公司。
1.2植物样本处理
100 g水母雪莲中加入70%乙醇，于 60℃、50 min条件下提取2次，提取物冻干处理后得黄酮粗品。10% 胎牛血清DMEM培养基为溶剂，按实验要求配制成水母雪莲黄酮溶液5 g/L。
1.4 Lewis肺癌荷瘤小鼠模型的建立与分组治疗
将1×106个/mL的3LL单细胞悬液接种于小鼠腹股沟皮下，第5-7天， 能明显触摸到肿瘤结节（直径约1 cm）则建模成功。建模成功后，随机将接种小鼠分为生理盐水组（NS）、SMM黄酮组、环磷酰胺阳性对照组（CTX），每组8只。每天早上同一时间阴性对照组给予生理盐水灌胃20mL·kg-1·d-1;SMM组分别给予5 mg·ml-1灌胃，10mL·kg-1·d-1;CTX组隔天一次给予环磷酰胺腹腔注射50 mg·kg-1 CTX ，连续治疗14 d。
1.5 HE染色
给药结束的第二天，将已固定的肿瘤组织常规脱水、包埋和切片后HE染色，光镜下进行组织形态学观察。病理学形态观察交由成都里来生物科技有限公司检测。
1.6 ELISA检测IL-2、IFN-γ的表达
给药结束的第二天，各组荷瘤小鼠脱颈椎前摘眼球取血，离心分离血清。按照IL-2和IFN-γ试剂盒说明书操作，将酶标仪设置490 nm检测各孔吸光度（A）值并计算IL-2和IFN-γ水平。
1.7 统计学处理
采用Graphpad Prism软件处理数据，正态分布的计量资料以x±s 表示，组间比较One-ANOVA分析，以P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 SMM黄酮类对Lewis肺癌荷瘤小鼠肿瘤浸润组織HE染色的影响 肿瘤组织HE染色观察可见，NS对照组瘤细胞生长旺盛，细胞异形性较大。CTX阳性组肿瘤细胞出现局灶性或者片状坏死，细胞核固缩。与NS组和CTX组相比，SMM组肿瘤细胞大小基本一致，细胞多呈圆形，肿瘤细胞出现局灶性或者片状坏死，少量的淋巴细胞和巨噬细胞浸润，肿瘤间可见少量的肿瘤细胞坏死形成的空泡和少量的新生血管形成。（如图1）。
2.2 SMM黄酮类可显著提高Lewis荷瘤小鼠血清IL-2和IFN-γ含量
与NS组比较（图2），SMM黄酮组荷瘤小鼠血清中IL-2和IFN-γ含量极显著升高，差异有统计学意义（P<0.01）。与CTX组相比，SMM黄酮组IL-2和IFN-γ含量均显著升高，差异有统计学意义（P<0.05）。
3 讨论
水母雪莲又称水母雪兔子，属菊科风毛菊属，是青藏高原分布较广，产量较大的雪莲花药材，经证实水母雪莲的乙醇、甲醇和水提物以及纯化出的多糖、单体黄酮类化合物均有着明显的抗肿瘤、抗风湿、镇痛、强心、抗菌消炎和抗氧化等药理活性[3]。研究表明水母雪莲提取物对腹水型肝癌、S180癌细胞具有直接的杀伤作用[4]。但其是否可以通过调节患者免疫功能从而达到抗肿瘤效应的研究相对较少。
本研究以SMM黄酮类提取物为对象，探讨了SMM的抗肿瘤作用。结果发现SMM黄酮类提取物不仅能够促进肿瘤浸润组织的肿瘤细胞坏死，还能帮助肿瘤间形成空泡并伴有新生血管形成。此外，本研究发现经SMM黃酮类提取物处理的Lewis肺癌荷瘤小鼠血清中的IL2、IFN-γ含量显著增加。众所周知，细胞因子是抗肿瘤免疫效应的重要评估指标[5]，其中IFN-γ主要由活化的CTL细胞、辅助T细胞、NK细胞等产生，可通过促进MHC-II类分子的表达从而增强APC细胞的抗原呈递能力;还可通过促进MHC-I类分子表达以增强CTL细胞的杀伤活性，此外还可辅助刺激IL-2、TNF等细胞因子的产生[6]。提示SMM黄酮类提取物可以显著上调肿瘤环境下正调控细胞因子的分泌以达到抗肿瘤免疫效应。
综上所述，SMM黄酮类提取物能够改善和恢复机体免疫功能，间接达到抗肿瘤的作用。促进正向细胞因子的分泌，从而抑制杀死肿瘤并促进肿瘤局部新生血管的形成。值得今后进一步深入研究。
参考文献：
[1] 崔益雯，王杰，陈腾.中药调节肿瘤免疫应答的研究进展[J].肿瘤，2019，39（08）：674-679.
[2] 宋磊， 张岚， 唐敏， 等. 中医药在恶性肿瘤整合医学疗法中的运用[J].中医学报， 2018， 33（5）：23-26.
[3] 达娃卓玛.西藏产雪莲花的化学和药理研究进展[J].中国民族民间医药，2015，24（12）：25-31.
[4] 杨璐铭，陈虎彪，郭乔如，等.雪莲的化学成分及药理作用研究进展[J].药学学报，2020，55（07）：1466-1477.
[5] Conlon KC， Miljkovic MD， Waldmann TA. Cytokines in the Treatment of Cancer[J]. J Interferon Cytokine Res. 2019 Jan;39（1）：6-21.
[6] Schoenborn JR， Wilson CB. Regulation of interferon-gamma during innate and adaptive immune responses[J]. Adv Immunol. 2007;96：41-101.
基金项目：国家自然科学基金资助项目（81860719）;西藏自治区自然科学基金资助项目（XZ2017ZRG-59，XZ2018ZRG-72）;西藏民族大学新冠肺炎疫情应急项目（XZMDYJ04）;西藏自治区科技厅自然基金（2021年）。
作者简介：张燕丽（1988-），女，硕士，讲师，主要从事藏药抗肿瘤免疫研究
通讯作者：张敏（1971-），女，博士，教授，主要从事抗肿瘤免疫研究
（西藏民族大学医学部 自治区生命科学基础实验室 陕西 咸阳 712082）
关键字：水母雪莲;抗肿瘤效应
[Abstract] Objective To preliminarily explore the anti-tumor immune function of Saussurea medusa Maxim （Saussurea medusa Maxim）， and provide scientific basis for further development of the medicinal value of Saussurea medusa Maxim. Methods After the lewis tumor-bearing mouse model was constructed， they were randomly divided into normal saline ， SMM flavonoids and cyclophosphamide groups. They were treated in vitro for 14 days.The HE morphological staining of tumor tissue and serum IL-2 and IFN-γ in Lewis tumor-bearing mice were used as the detection indicators. Results After lewis tumor-bearing mice were treated with SMM flavonoids extract， focal or patchy necrosis of tumor cells and neovascularization were found in tumor infiltrating tissues; it also increased the levels of IL2 and IFN-γ in serum of tumor-bearing mice. Conclusion The flavonoid extract of Saussurea medusa has a certain anti-lung cancer immunotherapy effect.
肿瘤是严重威胁人类健康的一种疾病。其中肺癌的发病率逐年增高，也是致死率最高的癌症之一。其主要治疗方法包括手术、放疗和化疗等，但是该治疗方案会导致患者免疫功能紊乱，预后差[1]。近几年随着人们对肿瘤治疗的不断研究和深入，发现在恶性肿瘤的综合治疗中，中医药可以通过调节机体的免疫机制来发挥抗肿瘤作用且毒副作用小[2]。因此本文采用lewis荷瘤小鼠为研究对象，初步探讨藏药水母雪莲黄酮类的抗肿瘤作用，以期为肿瘤临床治疗及靶向药物开发提供新的思路。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要材料
SPF级野生型C57BL/6小鼠（6～8周龄、20～25 g）购于达科为生物公司，饲养于西藏民族大学实验动物科学部。Lewis肺癌细胞株3LL由上海复旦大学赠予。水母雪莲选择西藏山南野生品种。CTX购自江苏恒瑞制药公司。多聚甲醛、二甲苯购于武汉科瑞生物技术有限公司。鼠IL-2（高敏）试剂盒、小鼠IFN-γ（高敏）试剂盒购自深圳欣博盛生物科技公司。
1.2植物样本处理
100 g水母雪莲中加入70%乙醇，于 60℃、50 min条件下提取2次，提取物冻干处理后得黄酮粗品。10% 胎牛血清DMEM培养基为溶剂，按实验要求配制成水母雪莲黄酮溶液5 g/L。
1.4 Lewis肺癌荷瘤小鼠模型的建立与分组治疗
将1×106个/mL的3LL单细胞悬液接种于小鼠腹股沟皮下，第5-7天， 能明显触摸到肿瘤结节（直径约1 cm）则建模成功。建模成功后，随机将接种小鼠分为生理盐水组（NS）、SMM黄酮组、环磷酰胺阳性对照组（CTX），每组8只。每天早上同一时间阴性对照组给予生理盐水灌胃20mL·kg-1·d-1;SMM组分别给予5 mg·ml-1灌胃，10mL·kg-1·d-1;CTX组隔天一次给予环磷酰胺腹腔注射50 mg·kg-1 CTX ，连续治疗14 d。
1.5 HE染色
给药结束的第二天，将已固定的肿瘤组织常规脱水、包埋和切片后HE染色，光镜下进行组织形态学观察。病理学形态观察交由成都里来生物科技有限公司检测。
1.6 ELISA检测IL-2、IFN-γ的表达
给药结束的第二天，各组荷瘤小鼠脱颈椎前摘眼球取血，离心分离血清。按照IL-2和IFN-γ试剂盒说明书操作，将酶标仪设置490 nm检测各孔吸光度（A）值并计算IL-2和IFN-γ水平。
1.7 统计学处理
采用Graphpad Prism软件处理数据，正态分布的计量资料以x±s 表示，组间比较One-ANOVA分析，以P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 SMM黄酮类对Lewis肺癌荷瘤小鼠肿瘤浸润组織HE染色的影响 肿瘤组织HE染色观察可见，NS对照组瘤细胞生长旺盛，细胞异形性较大。CTX阳性组肿瘤细胞出现局灶性或者片状坏死，细胞核固缩。与NS组和CTX组相比，SMM组肿瘤细胞大小基本一致，细胞多呈圆形，肿瘤细胞出现局灶性或者片状坏死，少量的淋巴细胞和巨噬细胞浸润，肿瘤间可见少量的肿瘤细胞坏死形成的空泡和少量的新生血管形成。（如图1）。
2.2 SMM黄酮类可显著提高Lewis荷瘤小鼠血清IL-2和IFN-γ含量
与NS组比较（图2），SMM黄酮组荷瘤小鼠血清中IL-2和IFN-γ含量极显著升高，差异有统计学意义（P<0.01）。与CTX组相比，SMM黄酮组IL-2和IFN-γ含量均显著升高，差异有统计学意义（P<0.05）。
3 讨论
水母雪莲又称水母雪兔子，属菊科风毛菊属，是青藏高原分布较广，产量较大的雪莲花药材，经证实水母雪莲的乙醇、甲醇和水提物以及纯化出的多糖、单体黄酮类化合物均有着明显的抗肿瘤、抗风湿、镇痛、强心、抗菌消炎和抗氧化等药理活性[3]。研究表明水母雪莲提取物对腹水型肝癌、S180癌细胞具有直接的杀伤作用[4]。但其是否可以通过调节患者免疫功能从而达到抗肿瘤效应的研究相对较少。
本研究以SMM黄酮类提取物为对象，探讨了SMM的抗肿瘤作用。结果发现SMM黄酮类提取物不仅能够促进肿瘤浸润组织的肿瘤细胞坏死，还能帮助肿瘤间形成空泡并伴有新生血管形成。此外，本研究发现经SMM黃酮类提取物处理的Lewis肺癌荷瘤小鼠血清中的IL2、IFN-γ含量显著增加。众所周知，细胞因子是抗肿瘤免疫效应的重要评估指标[5]，其中IFN-γ主要由活化的CTL细胞、辅助T细胞、NK细胞等产生，可通过促进MHC-II类分子的表达从而增强APC细胞的抗原呈递能力;还可通过促进MHC-I类分子表达以增强CTL细胞的杀伤活性，此外还可辅助刺激IL-2、TNF等细胞因子的产生[6]。提示SMM黄酮类提取物可以显著上调肿瘤环境下正调控细胞因子的分泌以达到抗肿瘤免疫效应。
综上所述，SMM黄酮类提取物能够改善和恢复机体免疫功能，间接达到抗肿瘤的作用。促进正向细胞因子的分泌，从而抑制杀死肿瘤并促进肿瘤局部新生血管的形成。值得今后进一步深入研究。
参考文献：
[1] 崔益雯，王杰，陈腾.中药调节肿瘤免疫应答的研究进展[J].肿瘤，2019，39（08）：674-679.
[2] 宋磊， 张岚， 唐敏， 等. 中医药在恶性肿瘤整合医学疗法中的运用[J].中医学报， 2018， 33（5）：23-26.
[3] 达娃卓玛.西藏产雪莲花的化学和药理研究进展[J].中国民族民间医药，2015，24（12）：25-31.
[4] 杨璐铭，陈虎彪，郭乔如，等.雪莲的化学成分及药理作用研究进展[J].药学学报，2020，55（07）：1466-1477.
[5] Conlon KC， Miljkovic MD， Waldmann TA. Cytokines in the Treatment of Cancer[J]. J Interferon Cytokine Res. 2019 Jan;39（1）：6-21.
[6] Schoenborn JR， Wilson CB. Regulation of interferon-gamma during innate and adaptive immune responses[J]. Adv Immunol. 2007;96：41-101.
基金项目：国家自然科学基金资助项目（81860719）;西藏自治区自然科学基金资助项目（XZ2017ZRG-59，XZ2018ZRG-72）;西藏民族大学新冠肺炎疫情应急项目（XZMDYJ04）;西藏自治区科技厅自然基金（2021年）。
作者简介：张燕丽（1988-），女，硕士，讲师，主要从事藏药抗肿瘤免疫研究
通讯作者：张敏（1971-），女，博士，教授，主要从事抗肿瘤免疫研究
（西藏民族大学医学部 自治区生命科学基础实验室 陕西 咸阳 712082）