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摘要：目的：对五味子水溶性多糖提取纯化及生物活性进行分析研究。方法：选取3种溶剂提取五味子多糖，通过超氧自由基和羟自由基抑制实验来确定多糖的抗氧化作用，通过抑菌圈实验测试其抑菌效果。结果：醇碱提取法提取的五味子多糖的抗氧化效果显著优于水提法和碱水法（P均<0.05），三者在抑菌效果方面无显著性差异（P>0.05），无统计学意义。结论：醇碱法提取的多糖抗氧化效果和抑菌效果较好，是提取五味子多糖的首选方法。
关键词：提取纯化；水溶性多糖；生物活性；五味子
五味子具有益气强阴等功效[1]，近年来，多项研究证实[2]，活性多糖具有抗病毒、抗肿瘤、增强免疫力等功效，其作用也逐渐受到人们重视。本文选择3种溶剂提取五味子多糖，通过超氧自由基和羟自由基抑制实验来确定多糖的抗氧化作用，通过抑菌圈实验测试其抑菌效果，对五味子水溶性多糖生物活性进行分析研究，现总结如下。
1资料与方法
1.1一般资料
五味子果实、青霉素钠（国药准字H20103379瑞阳制药有限公司）、实验菌种包括：枯草杆菌、白色念珠菌、大肠杆菌、肺炎白氏克雷菌、金黄色葡萄球菌，由湖南中医药大学实验室提供。
仪器：F-160别中药粉碎机（青岛德瑞特粉体技术设备有限公司），752犁紫—外可见分光光度计（上海元析仪器有限公司），MP120—1型电子天枰(上海恒平仪器厂)，DZKW-6别电子恒温水浴锅（杭州大卫科教仪器有限公司），KQ-S1800DY型超声波清洗仪（杭州艾普仪器设备有限公司），ALPHA1-2冻干机（北京博劢行仪器有限公司）。
1.2方法
1.2.1样品提取：①纯水提取：采用温度为100℃实验室蒸馏水，料液比为1:25，按提取工艺提取2次[3]，每次2小时；②碱水提取：采用pH值为8的Na2CO3蒸馏水溶液，料液比1:30，提取温度100℃，按提取工艺提取2次，每次1.5小时；③醇碱提取：采用乙醇与Na2CO3的混合溶液，溶剂pH值为8、乙醇浓度为5%，料液比为1:25，提取温度为100℃，按提取工艺提取2次，每次1.5小时。
1.2.2 试样准备：中和提取液至pH为7，经过真空抽滤，加入95%乙醇，4℃静置过夜，离心得到多糖。采用无水乙醇、丙酮、无水乙醚依次洗涤沉淀，冻干，收藏至干燥器中备用。
1.2.3 抗氧化活性对比试验：在6mmol/L的邻苯三酚中加入水提[4]、碱水提、醇碱水提多糖作为被测液，用蒸馏水做对照，在0.7mol/L、pH8.2的磷酸缓冲液中每隔30秒测一次光吸收值A，测定多糖对超氧自由基的抑制率。其中抑制率=(△A对照-△A样品)/△A对照×100%；用FeSO4和H2O2反应产生羟自由基，以羟自由基氧化水杨酸钠所得产物的光吸收值来测量羟自由基的量[5-6]。配制3mL反应液，其中含6mmol/LH2O2，0.15mol/LFeSO4，2mmol/L水杨酸钠及三种溶剂提取的多糖，加入H2O2开始反应，以蒸馏水为对照，在37℃的环境中反应1小时。测量510nm处的光吸收值A。测试3种溶液的羟自由基抑制率。其中抑制率=（A对照-A样品）/A对照×100%。
1.2.3制备菌液：将斜面菌种接入液体培养基[7-9]，30℃活化24小时，以1%体积分数接入液体培养基，30℃培养6小时，将菌液稀释后涂于平板，30℃中倒置培养24小时，计算菌落形成单位；将计数后的菌液稀释，取100μL涂于平板。将直径为6mm的滤纸片浸入0.08mg/m L药液中，经24小时浸泡放在涂布微生物的平板上，每种溶液做5次，37℃恒温箱中倒置培养18～20小时，测量抑菌圈直径，以青霉素钠蒸馏水溶液作阳性对照，蒸馏水作阴性对照。
1.3统计学方法
数据资料采用统计学软件SPSS17.0进行处理，计量资料采用(±s)表示，使用t检验，P<0.05，差异有统计学意义。
2结果
3种方法提取的五味子多糖对超氧自由基、羟自由基均有一定的清除作用，纯水提、碱水提多糖清除率基本相同，相同糖浓度下，醇碱提取法提取的五味子多糖超氧自由基、羟自由基的清除率明显高于水提法和碱水法（P均<0.05）。
3种溶剂提取的多糖对几种菌种的生长均有不同程度的抑制作用，其中对枯草杆菌、金黄色葡萄球菌的抑制作用较强，蒸馏水对几种菌种均无抑制作用，青霉素钠对大肠杆菌的抑制作用优于多糖，3种溶剂提取的多糖在抑菌效果方面无显著性差异（P>0.05），见下表1。
图（1）抑菌实验菌群显微镜图
3讨论
五味子多糖对超氧自由基进而羟自由基均具有一定的抑制作用，醇碱法所得五味子多糖的抗氧化效果显著优于水提法和碱提法所得多糖，分析其原因，可能与乙醇对抗氧化性功能基团的稳定性具有保护作用有关[10]，不同溶剂所提取的多糖抑菌效果基本相同，可证实提取溶剂对多糖的抑菌作用无影响，也可说明五味子多糖抗氧化机理与抑菌机理不同[11]。
参考文献：
[1] 王瑶,张彦飞,贡济宇等.五味子多糖质量浓度测定及生物活性研究[J].长春中医药大学学报,2013,29(4):733-734.
[2] 陈荣华.五味子醇提药渣中粗多糖的提取及生物活性研究[D].江苏大学,2008.03(01):698-601.
[3] 赵婷.五味子多糖的分离纯化、结构表征及其活性研究[D].江苏大学,2009.14(3):258-251.
[4] 姜帆.五味子多糖的提取纯化及其对肠道免疫功能的影响[D].东北农业大学,2013.11(13):723-725.
[5] 韩伟,黄兮,张玲玲等.中药多糖的提取、分离纯化及分析方法的研究进展[J].机电信息,2012,(14):19-25.
[6] 郑晓艳,林艺华.中药多糖的提取、分离纯化及其含量测定方法概述[J].福建分析测试,2013,22(4):58-62.
[7] 周丽丽,王启荣,伊木清等.耐力训练及补充中药多糖提取物对大鼠白细胞介素2及受体水平的影响[J].中国运动医学杂志,2005,24(3):302-306.
[8] 张洪波,葛利江,杨宏军等.单味中药多糖对奶牛子宫内膜炎病原菌体外抑菌作用[J].西南农业学报,2009,22(3):798-801.
[9] 周丽丽,王启荣,伊木清等.耐力训练及补充中药多糖对大鼠PBMC分泌细胞因子和血清中细胞因子含量的影响[J].中国免疫学杂志,2006,22(12):1119-1123.
[10]姜波，孙静，刘春，范圣第.五昧子水溶性多糖提取及纯化工艺的优化[J].时珍国医国药，2013，20(10):2614-2616.
[11]李晓光，高勤，翁文，等.五味子有效部位及其药理作用研究进展[J]中草药，2011，28(2)：15.
关键词：提取纯化；水溶性多糖；生物活性；五味子
五味子具有益气强阴等功效[1]，近年来，多项研究证实[2]，活性多糖具有抗病毒、抗肿瘤、增强免疫力等功效，其作用也逐渐受到人们重视。本文选择3种溶剂提取五味子多糖，通过超氧自由基和羟自由基抑制实验来确定多糖的抗氧化作用，通过抑菌圈实验测试其抑菌效果，对五味子水溶性多糖生物活性进行分析研究，现总结如下。
1资料与方法
1.1一般资料
五味子果实、青霉素钠（国药准字H20103379瑞阳制药有限公司）、实验菌种包括：枯草杆菌、白色念珠菌、大肠杆菌、肺炎白氏克雷菌、金黄色葡萄球菌，由湖南中医药大学实验室提供。
仪器：F-160别中药粉碎机（青岛德瑞特粉体技术设备有限公司），752犁紫—外可见分光光度计（上海元析仪器有限公司），MP120—1型电子天枰(上海恒平仪器厂)，DZKW-6别电子恒温水浴锅（杭州大卫科教仪器有限公司），KQ-S1800DY型超声波清洗仪（杭州艾普仪器设备有限公司），ALPHA1-2冻干机（北京博劢行仪器有限公司）。
1.2方法
1.2.1样品提取：①纯水提取：采用温度为100℃实验室蒸馏水，料液比为1:25，按提取工艺提取2次[3]，每次2小时；②碱水提取：采用pH值为8的Na2CO3蒸馏水溶液，料液比1:30，提取温度100℃，按提取工艺提取2次，每次1.5小时；③醇碱提取：采用乙醇与Na2CO3的混合溶液，溶剂pH值为8、乙醇浓度为5%，料液比为1:25，提取温度为100℃，按提取工艺提取2次，每次1.5小时。
1.2.2 试样准备：中和提取液至pH为7，经过真空抽滤，加入95%乙醇，4℃静置过夜，离心得到多糖。采用无水乙醇、丙酮、无水乙醚依次洗涤沉淀，冻干，收藏至干燥器中备用。
1.2.3 抗氧化活性对比试验：在6mmol/L的邻苯三酚中加入水提[4]、碱水提、醇碱水提多糖作为被测液，用蒸馏水做对照，在0.7mol/L、pH8.2的磷酸缓冲液中每隔30秒测一次光吸收值A，测定多糖对超氧自由基的抑制率。其中抑制率=(△A对照-△A样品)/△A对照×100%；用FeSO4和H2O2反应产生羟自由基，以羟自由基氧化水杨酸钠所得产物的光吸收值来测量羟自由基的量[5-6]。配制3mL反应液，其中含6mmol/LH2O2，0.15mol/LFeSO4，2mmol/L水杨酸钠及三种溶剂提取的多糖，加入H2O2开始反应，以蒸馏水为对照，在37℃的环境中反应1小时。测量510nm处的光吸收值A。测试3种溶液的羟自由基抑制率。其中抑制率=（A对照-A样品）/A对照×100%。
1.2.3制备菌液：将斜面菌种接入液体培养基[7-9]，30℃活化24小时，以1%体积分数接入液体培养基，30℃培养6小时，将菌液稀释后涂于平板，30℃中倒置培养24小时，计算菌落形成单位；将计数后的菌液稀释，取100μL涂于平板。将直径为6mm的滤纸片浸入0.08mg/m L药液中，经24小时浸泡放在涂布微生物的平板上，每种溶液做5次，37℃恒温箱中倒置培养18～20小时，测量抑菌圈直径，以青霉素钠蒸馏水溶液作阳性对照，蒸馏水作阴性对照。
1.3统计学方法
数据资料采用统计学软件SPSS17.0进行处理，计量资料采用(±s)表示，使用t检验，P<0.05，差异有统计学意义。
2结果
3种方法提取的五味子多糖对超氧自由基、羟自由基均有一定的清除作用，纯水提、碱水提多糖清除率基本相同，相同糖浓度下，醇碱提取法提取的五味子多糖超氧自由基、羟自由基的清除率明显高于水提法和碱水法（P均<0.05）。
3种溶剂提取的多糖对几种菌种的生长均有不同程度的抑制作用，其中对枯草杆菌、金黄色葡萄球菌的抑制作用较强，蒸馏水对几种菌种均无抑制作用，青霉素钠对大肠杆菌的抑制作用优于多糖，3种溶剂提取的多糖在抑菌效果方面无显著性差异（P>0.05），见下表1。
图（1）抑菌实验菌群显微镜图
3讨论
五味子多糖对超氧自由基进而羟自由基均具有一定的抑制作用，醇碱法所得五味子多糖的抗氧化效果显著优于水提法和碱提法所得多糖，分析其原因，可能与乙醇对抗氧化性功能基团的稳定性具有保护作用有关[10]，不同溶剂所提取的多糖抑菌效果基本相同，可证实提取溶剂对多糖的抑菌作用无影响，也可说明五味子多糖抗氧化机理与抑菌机理不同[11]。
参考文献：
[1] 王瑶,张彦飞,贡济宇等.五味子多糖质量浓度测定及生物活性研究[J].长春中医药大学学报,2013,29(4):733-734.
[2] 陈荣华.五味子醇提药渣中粗多糖的提取及生物活性研究[D].江苏大学,2008.03(01):698-601.
[3] 赵婷.五味子多糖的分离纯化、结构表征及其活性研究[D].江苏大学,2009.14(3):258-251.
[4] 姜帆.五味子多糖的提取纯化及其对肠道免疫功能的影响[D].东北农业大学,2013.11(13):723-725.
[5] 韩伟,黄兮,张玲玲等.中药多糖的提取、分离纯化及分析方法的研究进展[J].机电信息,2012,(14):19-25.
[6] 郑晓艳,林艺华.中药多糖的提取、分离纯化及其含量测定方法概述[J].福建分析测试,2013,22(4):58-62.
[7] 周丽丽,王启荣,伊木清等.耐力训练及补充中药多糖提取物对大鼠白细胞介素2及受体水平的影响[J].中国运动医学杂志,2005,24(3):302-306.
[8] 张洪波,葛利江,杨宏军等.单味中药多糖对奶牛子宫内膜炎病原菌体外抑菌作用[J].西南农业学报,2009,22(3):798-801.
[9] 周丽丽,王启荣,伊木清等.耐力训练及补充中药多糖对大鼠PBMC分泌细胞因子和血清中细胞因子含量的影响[J].中国免疫学杂志,2006,22(12):1119-1123.
[10]姜波，孙静，刘春，范圣第.五昧子水溶性多糖提取及纯化工艺的优化[J].时珍国医国药，2013，20(10):2614-2616.
[11]李晓光，高勤，翁文，等.五味子有效部位及其药理作用研究进展[J]中草药，2011，28(2)：15.