【摘 要】
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目的 将腺病毒Ad5/F11p造血细胞靶向和甲病毒复制子载体目的基因高效转录的特点相结合,构建腺病毒-甲病毒杂合载体,以提高目的 基因在造血细胞的表达水平.方法 基本实验过程
【机 构】
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军事医学科学院放射与辐射医学研究所,北京,100850;中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所,北京,100052
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目的 将腺病毒Ad5/F11p造血细胞靶向和甲病毒复制子载体目的基因高效转录的特点相结合,构建腺病毒-甲病毒杂合载体,以提高目的 基因在造血细胞的表达水平.方法 基本实验过程包括骨架质粒构建,穿梭质粒构建,同源重组产生杂合病毒基因组,杂合病毒在包装细胞的拯救和扩增,以及杂合病毒对造血细胞基因转移效率的初步评价.具体步骤如下:利用重叠延伸PCR技术将pFiber5/11p质粒上Ad5的E4区部分删除产生骨架质粒pAdEasy/F11pDE4orf3.在 pShuttle质粒的多克隆位点处分别插入造血细胞特异性启动子(CD11a promoter, CD11Ap)、甲病毒载体元件(nsP)、目的 基因(GFP)、PolyA加尾信号构建杂合穿梭质粒pSh-SFV-GFP.骨架质粒与穿梭质粒在大肠杆菌BJ5183菌株中同源重组产生杂合病毒质粒pAd5/F11p-SFV-GFP,经与辅助病毒质粒Ad5/f11p-HV共转染293细胞后拯救出杂合病毒Ad5/F11p-SFV-GFP,经CsCl密度梯度离心法纯化,得到的病毒滴度为3×1010 pfu/ml.与对照病毒Ad5-GFP相同感染复数(100MOI)分别感染U937细胞,利用流式细胞术检测GFP+细胞比例.结果 pAdEasy-1/F11p-E4orf3和pSh-SFV-GFP经相应酶切和测序鉴定,与预期设计一致;CsCl密度梯度离心纯化得到杂合病毒;100MOI Ad5/F11p-SFV-GFP感染U937细胞2 d后,GFP+细胞比例为55.79%,而对照病毒Ad5-GFP的感染效率为2.42%.结论 成功构建了腺病毒-甲病毒杂合载体,为进一步评价其对造血细胞的基因转移效率奠定了基础.
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