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摘要：目的 观察地黄益智方对Aβ1-40所致老年性痴呆模型大鼠细胞周期蛋白异常表达的影响，并探讨其机制。方法 120只SD雄性大鼠随机分为空白组、模型组及地黄益智方小、中、大剂量组。采用大鼠双侧海马CA1区注射Aβ1-40复制老年性痴呆模型，造模24 h后开始灌胃给药，地黄益智方小、中、大剂量组给药量分别为0.12、0.24、0.48 g浸膏/（100 g·d），空白组和模型组给予等体积的蒸馏水，连续4周。免疫组化法动态检测各组大鼠大脑皮层及海马cyclin D1、cyclin E、p16、CDK6的表达变化。结果 Aβ1-40造模后24 h可见cyclin D1、CDK6表达升高，造模后2周时cyclin E表达升高，造模后4周时p16表达升高；小、中、大剂量地黄益智方可改善Aβ1-40诱导cyclin D1、cyclin E、p16以及CDK6异常表达。结论 老年性痴呆模型大鼠早期存在脑细胞周期蛋白异常表达现象，地黄益智方对异常表达的cyclin D1、cyclin E、p16及CDK6有一定改善作用。
关键词：地黄益智方；老年性痴呆；细胞周期蛋白；大鼠
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2012）01-0047-03
随着我国人口老龄化的日益严重，老年性痴呆（AD）已成为一个严重的社会问题。本研究在证实地黄益智方对Aβ1-40所致老年性痴呆模型大鼠行为学及病理学有明确作用的基础上，进一步从脑细胞周期蛋白异常表达的角度揭示其作用机制。
1 实验材料
1.1 动物
SD大鼠120只，雄性，体质量（200±20）g，SPF级，中国科学
基金项目：国家自然科学基金（81072789）；上海市教委创新项目（10YZ58）；上海市科委中药现代化项目（10DZ1971200）
院上海斯莱克实验动物有限公司提供，许可证号：SCXK（沪） 2008-0016。
1.2 药物
地黄益智方由熟地黄、龟甲胶等药物组成，上海中医药大学附属龙华医院药剂科提供原药材，并进行提取制备成浸膏粉，每克浸膏粉含原药材4.57 g，4 ℃保存备用。
1.3 试剂
Aβ1-40购自美国Sigma公司；盐酸氯胺酮注射液为江苏恒瑞医药股份有限公司产品。小鼠抗大鼠cyclin D1单克隆抗体、兔抗大鼠Cyclin E多克隆抗体、兔抗大鼠p16多克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司。兔抗大鼠CDK6单克隆抗体为美国Santa Cruze公司产品。ABC试剂盒为Vector公司产品。DAB试剂盒为中衫金桥公司产品。
1.4 仪器
2 实验方法
2.1 分组、造模及给药
120只雄性SD大鼠分别称重标记，随机分为空白组、模型组及地黄益智方小、中、大剂量组，每组24只。适应性喂养1周后，除空白组外，其余大鼠参考文献[1-2]复制模型：用盐酸氯胺酮注射液（2 mg/kg）通过腹腔注射方式麻醉大鼠，然后固定于大鼠脑立体定向仪上，头顶部去毛，常规备皮消毒，大鼠脑立体定位图谱前囟定位（AP-3.5 mm，ML2.0 mm，DV2.7 mm）。每侧海马CA1区注射Aβ1-40 5 ?g（注射前用生理盐水孵育1周），缓慢注射，每侧5 min，留针5 min后缓慢退出，局部消毒，缝合皮肤。各组动物于造模24 h后开始给药，每日早8时开始，小、中、大剂量组按0.12、0.24、0.48 g浸膏粉/（100 g·d）给药，灌胃量：1 mL/（100 g·d），空白组和模型组给予等体积的蒸馏水。连续给药4周。分别于造模后24 h和2、4周，每组分别取4只大鼠脑组织行冰冻冠状切片。
3 图像处理及统计学方法
5 讨论
AD作为一种衰老相关疾病，是人体全面衰老的表现，以脑的记忆、思维、精神、情志、感知、运动等功能衰退及异常为主要表现的一种整体性的身心疾病。我们认为随增龄而发生的肾精亏损，肾气不足，脑髓不充，元神失于髓之荣贯穿于AD的始终[3]。基于中医学“肾虚衰老”、“肾藏精，生髓通于脑”的传统理论，在总结名老中医学术经验的基础上，我们提出了老年性痴呆补肾生髓，佐以活血化痰、醒脑开窍的治则治法，在此基础上确立了地黄益智方（由熟地黄、龟甲胶等组成）。
目前AD的各种发病学说均未能全面解释AD的病变过程。AD细胞周期假说为AD研究提供了新的线索和思路。研究发现异常细胞周期在AD发病中起重要作用，细胞周期异常早于AD典型病理表现，AD病理发展及相关细胞凋亡是神经元重新进入细胞周期分裂失败的结果。神经元是终末分化细胞，处于细胞周期静止状态即G0 期，神经元在Aβ蛋白等因素作用下可以进入细胞周期，但由于细胞周期调控机制的失败，最终导致神经元凋亡，引发神经元退变，导致AD等疾病发生[4-5]，即细胞周期相关凋亡（cell cycle-associated apoptosis）[6]。
cyclin D表达是终末分化神经元进入细胞周期的关键标志物，神经元在异常生长信号的刺激下，G1期cyclin D表达，并与CDK4、CDK6结合，使下游的蛋白质如Rb磷酸化，磷酸化的Rb释放出转录因子E2F，促进许多基因的转录，如编码cyclinE、A和CDK1的基因；在G1-S期，cyclin E与CDK2结合，促进细胞通过G1/S限制点而进入S期；Herna?ndez-Ortega等[7]研究证实cyclin D、cyclinE、CDK2、CDK6等细胞周期相关蛋白与AD海马神经元损伤直接相关。cyclin D1在神经元中积聚也可促使其进入细胞周期，进而出现细胞凋亡[8]。AD患者脑组织可见p16、CDKs、cyclin等细胞周期蛋白的异常表达，并与神经元凋亡相关；异常细胞周期事件是AD主要的神经病理特征，并早于老年斑、神经元纤维缠结等特征出现，CDKs、细胞周期蛋白Pin1等参与异常神经元细胞周期[9]。转基因模型证实Alzheimer病异常神经细胞周期事件与Aβ直接相关[10]。当前在国外以细胞周期为靶点的抗AD病药物正在积极研发之中[11]，国内起步较晚，华中科技大学同济医学院附属同济医院王伟已在开展相关研究[12]，中医药领域尚未见研究报道。 我们的研究表明，0、2、4周模型组cyclin D1、CDK6光密度值升高，推测在0周时神经元细胞启动进入周期，以G1期为主。2周时cyclin E光密度值升高，说明细胞周期在G1-S期为多，另外cyclin E 可能与AD早期病理变化有关。p16 是细胞周期的负调节因子，0、2周无变化，4周模型组升高，说明4周细胞周期有可能开始被阻断，最终导致神经元凋亡，引发神经元退变。此外，本研究中p53、CDK2在0、2、4周均未检测到改变。
上述研究初步证明AD模型大鼠早期存在脑细胞周期蛋白异常表达现象，地黄益智方对Aβ1-40所致老年性痴呆模型大鼠脑细胞周期蛋白异常表达有一定调控作用。
参考文献：
[1] 姚柏春，袁华，黄翔，等.绞股蓝对海马注射Aβ1-40大鼠脑内细胞周期蛋白表达和钙稳定变化的影响[J].中国病理生理杂志，2006，22（8）：1618-1622.
[2] 牛英才，董妙先，兴桂华，等.Aβ1-40脑内注射对大鼠海马AchE和NOS1表达的影响及加减地黄饮子的干预作用[J].中药药理与临床，2007， 23（5）：149-151.
[3] 安红梅，胡兵，靳淼，等.顾明昌教授从虚论治神经精神系统疾病经验[J].中国中医急症，2006，15（10）：1119-1120.
[4] Neve RL， McPhie DL. The cell cycle as a therapeutic target for Alzheimer's disease[J]. Pharmacol Ther，2006，111（1）：99-113.
[5] Copani A， Guccione S， Giurato L， et al. The cell cycle molecules behind neurodegeneration in Alzheimer's disease：perspectives for drug development[J]. Curr Med Chem，2008， 15（24）：2420-2432.
[6] Malik B， Currais A， Soriano S. Cell cycle-driven neuronal apoptosis specifically linked to amyloid peptide Abeta1-42 exposure is not exacerbated in a mouse model of presenilin-1 familial Alzheimer's disease[J]. J Neurochem，2008，106（2）：912-916.
[7] Hernández-Ortega K， Ferrera P， Arias C. Sequential expression of cell-cycle regulators and Alzheimer's disease-related proteins in entorhinal cortex after hippocampal excitotoxic damage[J]. J Neurosci Res，2007，85（8）：1744-1751.
[8] Malik B， Currais A， Andres A， et al. Loss of neuronal cell cycle control as a mechanism of neurodegeneration in the presenilin-1 Alzheimer's disease brain[J]. Cell Cycle，2008，7（5）：637-646.
[9] Neve RL， McPhie DL. The cell cycle as a therapeutic target for Alzheimer's disease[J]. Pharmacol Ther，2006，111（1）：99-113.
[10] Varvel NH， Bhaskar K， Patil AR， et al. Aβoligomers induce neuronal cell cycle events in Alzheimer's disease[J]. J Neurosci， 2008，28（43）：10786-10793.
[11] Woods J， Snape M， Smith MA. The cell cycle hypothesis of Alzheimer's disease：suggestions for drug development[J]. Biochem Biophys Acta，2007，1772（4）：503-508.
[12] Wang W， Bu B， Xie M， et al. Neural cell cycle dysregulation and central nervous system diseases[J]. Prog Neurobiol，2009， 89（1）：1-17.
（收稿日期：2011-06-03，编辑：华强）
关键词：地黄益智方；老年性痴呆；细胞周期蛋白；大鼠
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2012）01-0047-03
随着我国人口老龄化的日益严重，老年性痴呆（AD）已成为一个严重的社会问题。本研究在证实地黄益智方对Aβ1-40所致老年性痴呆模型大鼠行为学及病理学有明确作用的基础上，进一步从脑细胞周期蛋白异常表达的角度揭示其作用机制。
1 实验材料
1.1 动物
SD大鼠120只，雄性，体质量（200±20）g，SPF级，中国科学
基金项目：国家自然科学基金（81072789）；上海市教委创新项目（10YZ58）；上海市科委中药现代化项目（10DZ1971200）
院上海斯莱克实验动物有限公司提供，许可证号：SCXK（沪） 2008-0016。
1.2 药物
地黄益智方由熟地黄、龟甲胶等药物组成，上海中医药大学附属龙华医院药剂科提供原药材，并进行提取制备成浸膏粉，每克浸膏粉含原药材4.57 g，4 ℃保存备用。
1.3 试剂
Aβ1-40购自美国Sigma公司；盐酸氯胺酮注射液为江苏恒瑞医药股份有限公司产品。小鼠抗大鼠cyclin D1单克隆抗体、兔抗大鼠Cyclin E多克隆抗体、兔抗大鼠p16多克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司。兔抗大鼠CDK6单克隆抗体为美国Santa Cruze公司产品。ABC试剂盒为Vector公司产品。DAB试剂盒为中衫金桥公司产品。
1.4 仪器
2 实验方法
2.1 分组、造模及给药
120只雄性SD大鼠分别称重标记，随机分为空白组、模型组及地黄益智方小、中、大剂量组，每组24只。适应性喂养1周后，除空白组外，其余大鼠参考文献[1-2]复制模型：用盐酸氯胺酮注射液（2 mg/kg）通过腹腔注射方式麻醉大鼠，然后固定于大鼠脑立体定向仪上，头顶部去毛，常规备皮消毒，大鼠脑立体定位图谱前囟定位（AP-3.5 mm，ML2.0 mm，DV2.7 mm）。每侧海马CA1区注射Aβ1-40 5 ?g（注射前用生理盐水孵育1周），缓慢注射，每侧5 min，留针5 min后缓慢退出，局部消毒，缝合皮肤。各组动物于造模24 h后开始给药，每日早8时开始，小、中、大剂量组按0.12、0.24、0.48 g浸膏粉/（100 g·d）给药，灌胃量：1 mL/（100 g·d），空白组和模型组给予等体积的蒸馏水。连续给药4周。分别于造模后24 h和2、4周，每组分别取4只大鼠脑组织行冰冻冠状切片。
3 图像处理及统计学方法
5 讨论
AD作为一种衰老相关疾病，是人体全面衰老的表现，以脑的记忆、思维、精神、情志、感知、运动等功能衰退及异常为主要表现的一种整体性的身心疾病。我们认为随增龄而发生的肾精亏损，肾气不足，脑髓不充，元神失于髓之荣贯穿于AD的始终[3]。基于中医学“肾虚衰老”、“肾藏精，生髓通于脑”的传统理论，在总结名老中医学术经验的基础上，我们提出了老年性痴呆补肾生髓，佐以活血化痰、醒脑开窍的治则治法，在此基础上确立了地黄益智方（由熟地黄、龟甲胶等组成）。
目前AD的各种发病学说均未能全面解释AD的病变过程。AD细胞周期假说为AD研究提供了新的线索和思路。研究发现异常细胞周期在AD发病中起重要作用，细胞周期异常早于AD典型病理表现，AD病理发展及相关细胞凋亡是神经元重新进入细胞周期分裂失败的结果。神经元是终末分化细胞，处于细胞周期静止状态即G0 期，神经元在Aβ蛋白等因素作用下可以进入细胞周期，但由于细胞周期调控机制的失败，最终导致神经元凋亡，引发神经元退变，导致AD等疾病发生[4-5]，即细胞周期相关凋亡（cell cycle-associated apoptosis）[6]。
cyclin D表达是终末分化神经元进入细胞周期的关键标志物，神经元在异常生长信号的刺激下，G1期cyclin D表达，并与CDK4、CDK6结合，使下游的蛋白质如Rb磷酸化，磷酸化的Rb释放出转录因子E2F，促进许多基因的转录，如编码cyclinE、A和CDK1的基因；在G1-S期，cyclin E与CDK2结合，促进细胞通过G1/S限制点而进入S期；Herna?ndez-Ortega等[7]研究证实cyclin D、cyclinE、CDK2、CDK6等细胞周期相关蛋白与AD海马神经元损伤直接相关。cyclin D1在神经元中积聚也可促使其进入细胞周期，进而出现细胞凋亡[8]。AD患者脑组织可见p16、CDKs、cyclin等细胞周期蛋白的异常表达，并与神经元凋亡相关；异常细胞周期事件是AD主要的神经病理特征，并早于老年斑、神经元纤维缠结等特征出现，CDKs、细胞周期蛋白Pin1等参与异常神经元细胞周期[9]。转基因模型证实Alzheimer病异常神经细胞周期事件与Aβ直接相关[10]。当前在国外以细胞周期为靶点的抗AD病药物正在积极研发之中[11]，国内起步较晚，华中科技大学同济医学院附属同济医院王伟已在开展相关研究[12]，中医药领域尚未见研究报道。 我们的研究表明，0、2、4周模型组cyclin D1、CDK6光密度值升高，推测在0周时神经元细胞启动进入周期，以G1期为主。2周时cyclin E光密度值升高，说明细胞周期在G1-S期为多，另外cyclin E 可能与AD早期病理变化有关。p16 是细胞周期的负调节因子，0、2周无变化，4周模型组升高，说明4周细胞周期有可能开始被阻断，最终导致神经元凋亡，引发神经元退变。此外，本研究中p53、CDK2在0、2、4周均未检测到改变。
上述研究初步证明AD模型大鼠早期存在脑细胞周期蛋白异常表达现象，地黄益智方对Aβ1-40所致老年性痴呆模型大鼠脑细胞周期蛋白异常表达有一定调控作用。
参考文献：
[1] 姚柏春，袁华，黄翔，等.绞股蓝对海马注射Aβ1-40大鼠脑内细胞周期蛋白表达和钙稳定变化的影响[J].中国病理生理杂志，2006，22（8）：1618-1622.
[2] 牛英才，董妙先，兴桂华，等.Aβ1-40脑内注射对大鼠海马AchE和NOS1表达的影响及加减地黄饮子的干预作用[J].中药药理与临床，2007， 23（5）：149-151.
[3] 安红梅，胡兵，靳淼，等.顾明昌教授从虚论治神经精神系统疾病经验[J].中国中医急症，2006，15（10）：1119-1120.
[4] Neve RL， McPhie DL. The cell cycle as a therapeutic target for Alzheimer's disease[J]. Pharmacol Ther，2006，111（1）：99-113.
[5] Copani A， Guccione S， Giurato L， et al. The cell cycle molecules behind neurodegeneration in Alzheimer's disease：perspectives for drug development[J]. Curr Med Chem，2008， 15（24）：2420-2432.
[6] Malik B， Currais A， Soriano S. Cell cycle-driven neuronal apoptosis specifically linked to amyloid peptide Abeta1-42 exposure is not exacerbated in a mouse model of presenilin-1 familial Alzheimer's disease[J]. J Neurochem，2008，106（2）：912-916.
[7] Hernández-Ortega K， Ferrera P， Arias C. Sequential expression of cell-cycle regulators and Alzheimer's disease-related proteins in entorhinal cortex after hippocampal excitotoxic damage[J]. J Neurosci Res，2007，85（8）：1744-1751.
[8] Malik B， Currais A， Andres A， et al. Loss of neuronal cell cycle control as a mechanism of neurodegeneration in the presenilin-1 Alzheimer's disease brain[J]. Cell Cycle，2008，7（5）：637-646.
[9] Neve RL， McPhie DL. The cell cycle as a therapeutic target for Alzheimer's disease[J]. Pharmacol Ther，2006，111（1）：99-113.
[10] Varvel NH， Bhaskar K， Patil AR， et al. Aβoligomers induce neuronal cell cycle events in Alzheimer's disease[J]. J Neurosci， 2008，28（43）：10786-10793.
[11] Woods J， Snape M， Smith MA. The cell cycle hypothesis of Alzheimer's disease：suggestions for drug development[J]. Biochem Biophys Acta，2007，1772（4）：503-508.
[12] Wang W， Bu B， Xie M， et al. Neural cell cycle dysregulation and central nervous system diseases[J]. Prog Neurobiol，2009， 89（1）：1-17.
（收稿日期：2011-06-03，编辑：华强）