“DNA的粗提取与鉴定”简单的方法

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  高中《生物》新教材从试验修定本到2002年审查通过本第二册都开设有“DNA的粗提取与鉴定”的实验教学(DNA的粗提取还是新课程标准下八年级上学期生物教材要求的活动)。此实验在操作过程中有如下问题:
  (1)成功率低;
  (2)操作步骤多、复杂、所用时间长,在一节课45 min内无法完成;
  (3)所用药品多、量大、花费太高、且购买不便;
  (4)材料难取;
  (5)由于所提取的DNA量少,二苯胺试剂用量过多(二苯胺试剂毒性很强),严重危害了学生和是实验教师的身心健康,对环境污染较大。
  基于上述原因,本人在实践中不断探索,不断进取,总结出了一种DNA的粗提取与鉴定的简单易行的方法——“一钵一杯”法,避免了上述不足,达到了实验目的,现将其介绍如下。
  
  1、实验的改进
  
  1.1 改进方向
  根据教学发现教材实验中的不足,对如下方面进行了改进。
  
  1.1.1 实验材料的改进
  虽然各种生物细胞中都含有DNA,但是并不是每一种生物组织都适合做提取DNA的原材料。较好的实验材料应满足以下条件:
  ①细胞核中的染色体数目多,因为提取的主要是细胞核中的DNA,能适合大量提取;
  ②实验材料易获取,价格低;
  ③实验中所用试剂少,避免对DNA产生影响;
  ④实验材料的颜色应与DNA相近,可缩短实验步骤,避免对DNA观察的影响(教材中选用红色的鸡血,用繁琐的步骤来除去红色,导致大量DNA被破坏和损失,是实验成功率低的主要原因);
  ⑤可操作性强,适合于中学实验室学生实验。
  正确的选材是成功的保证,正如孟德尔选择了豌豆一样。查阅资料知道可用于DNA的粗提取与鉴定的实验材料除鸡血外,还有很多,如植物材料:菜花、蒜黄、菠菜、洋葱鳞片;动物材料:猪的肝脏、猪的胰腺、鲤鱼的精巢。
  但由于猪的肝脏、猪的胰腺、蒜黄、菠菜价格较高及菜花不易采集(会破坏生产)和本身颜色较深,都不适合于学生分组实验。现选取鲤鱼的精巢、洋葱鳞片进行探索。
  鲤鱼的精巢易获取、价格极低、含DNA特别丰富、不需特殊的器材、试剂,效果明显,成功率高,最适合于做DNA的粗提取与鉴定的实验材料(草鱼、鲫鱼的精巢为材料也行:草鱼有50条染色体,用草鱼精巢为材料所得DNA量较少;鲫鱼有100条染色体数,但个体小,精巢也就少)。
  
  1.1.2方法步骤的改进
  根据不同的资料显示,用不同的材料来提取DNA,其步骤都具有相同之处,大致可分为3个步骤:
  (1)将DNA溶解在氯化钠溶液中;
  (2)用酒精来提取较纯的DNA;
  (3)用二苯胺来鉴定DNA。
  其中(2)、(3)两步是相同的,不同的是(1)步。在取材很少、研磨充分时能否将材料直接溶解在氯化钠溶液中而完成(1)呢?经过多次实验证明是可以的。
  
  1.1.3 酒精的改进
  在实验中用得最多的是95%的酒精,其价格昂贵,用费最高,并且要在冰箱中冷藏,一般的中学实验室都没配置冰箱,影响实验的开展。能否用室温下的燃料酒精(酒精灯所用酒精)来代替呢?
  用不同温度的燃料酒精来提取含杂质较少的DNA,所得DNA的量都是很多的,并且实验效果都很明显,该实验可用室温燃料酒精来代替95%的冷酒精。
  
  1.1.4蒸馏水的改进
  在农村中学蒸馏水不易购买,本实验是一个定性的实验,能否用自来水来代替呢?经过对比,自来水不会影响实验结果,可用自来水代替蒸馏水。
  
  1.1.5 二苯胺试剂用量的改进
  “芳香胺很毒而且容易渗入皮肤,无论吸人它的蒸汽,或皮肤与之接触都能引起中毒”。二苯胺属于芳香胺,也有上述性质。在使用过程中会挥发出刺激性的有毒蒸汽,实验后的废液对环境的污染很大,并且持续时间也很长。所以在不影响实验效果的情况下,二苯胺试剂能少用就尽量少用。在实验中进行了如下比较。
  1mL二苯胺试剂足以和DNA反应产生很明显的实验现象,0.015 mol/L的NaCl溶液与二苯胺试剂各用1mL是理想的组合。
  
  1.2改进后的具体方法步骤
  现将用鲤鱼的精巢为实验材料的具体方法步骤介绍。
  该方法第一步、第二步主要只用了1个研钵、1个烧杯,姑且就叫它“一钵一杯”法。
  本实验要注意的事项:
  (1)第一步必须要得到凝胶状的DNA(此时NaCl溶液的浓度为1~2mol/L),如果得不到凝胶状的DNA,第二步则不能析出DNA;
  (2)二苯胺不能接触到皮肤;
  (3)实验结束应将废液及时收集于废液缸并加盖,然后处理掉,并确保实验室的通风良好。
  本实验改进后:降低了成本,少用了实验用具,简化了操作步骤,节省了药品和宝贵时间,降低了对环境的污染,取得了明显的实验效果,达到了实验的目的,适合于中学实验室学生实验。
  
  2、二苯胺试剂的配制和使用
  
  根据教学进度,做本实验时绝大多数地区的气温很低,冰醋酸遇空气立刻结冰,给二苯胺试剂的配制和使用带来了不便,同时也直接影响实验现象的观察,用下列方法可解决上述问题。
  A液:取7.5二苯胺于500mL棕色瓶装冰醋酸中,再加7.mL浓硫酸混合均匀,放入35℃的恒温箱中备用(如室温较高,不结冰,可以不放恒温箱)。
  B液:取40%的乙醛(如出现分层,将其混合均匀后再取)1mL于199mL水中即成0.2%的乙醛,倒入棕色瓶中备用。
  二苯胺试剂:取1滴B液于1mLA液中,混合均匀后使用(现配现用)。
  A液、B液用棕色瓶分装密封可长期保存,不影响实验效果(用时混合均匀后再取)。
  
  3、实验的拓展
  
  在实验步骤1②所获得的凝胶状(蛋清状)物质成分的探究:通过上述实验已证明了该凝胶状(蛋清状)物质含有DNA,其中是否含有蛋白质呢?请根据所学知识和原理设计实验完成探究。
  
  实验结果:1号变紫、2号不变紫。
  结论:凝胶状(蛋清状)物质含有蛋白质。
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