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【摘要】目的 了解JAK2基因V617F突变在骨髓增生性肿瘤中的发生率。方法 收集骨髓增生性肿瘤共26例。其中PV组8例；ET组12例；CML组4例；PMF组2例。直接测序检测JAK2基因V617F突变。结果 PV组JAK2V617F阳性率为87.5%（7/8）；ET组阳性率为33.3%（4/12）；PMF组阳性率为50%（1/2）；AML、ALL、CML、CNL、CEL等恶性血液病患者及正常对照均为阴性。结论 检测JAK2基因V617F突变可作为一种分子标记对PV进行诊断，并对ET、PMF诊断提供帮助。
[Abstract] Objective To learn the incidence of JAK2 gene V617F mutation in the myeloproliferative disease （MPNs）. Methods Collected MPNs 26 cases with PV 8 cases， ET 12 cases and PMF 2 cases， then tested JAK2 gene V617F by sequences. Results The positive rate of JAK2 gene V617F mutation was 87.5% （7/8） in PV and 33.3%（4/12） in ET and 50%（1/2） in PMF. However all the cases in AML、ALL、CML、CNL、CEL were negative. Conclusion JAK2 V617F mutation test might serve as a gene marker for diagnosis in PV， at the same time help to the diagnosis for ET and PMF.
【中图分类号】R4 【文献标识码】A 【文章编号】1671-8801（2015）03-0001-02
骨髓增殖性肿瘤（MPNs）是一类起源于多能造血干细胞，以一系或者多系分化相对较成熟的骨髓细胞克隆性增生异常为特点的一组疾病的统称。增生的细胞其细胞形态和功能相对正常，常表现为多能髓样造血干细胞所属的细胞系（包括红细胞系、血小板系、粒-单核细胞系）中的一系或多系细胞恶性增生。骨髓增生性肿瘤（MPNs）包括真性红细胞增多症（PV）、原发性血小板增多症（ET）、慢性髓细胞样白血病（CML）和原发性骨髓纤维化（IMF）。研究发现，JAK2 V617F突变发生在PV、ET、特发性骨髓纤维化、骨髓发育不良症候群、嗜酸细胞过多综合征、慢性骨髓单核细胞性白血病、慢性中性粒细胞性白血病、系统性肥大细胞增多症等疾病中。正是由于JAK2基因V617F突变在多种疾病中都有发现，检测人群该基因突变将会对进一步阐明其引发的广谱的血液病提供依据。
对于JAK2基因V617F突变进行分子诊断国内外的专家建立了数种方法，包括：直接测序、特异引物等位基因PCR法、酶切法、荧光PCR法等，本文用测序法对MPNs做了检测。
1.材料与方法
1.1试剂与仪器：Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0试剂盒购自大连宝生物公司， dNTP，Tag酶购自南京凯基，生物工程技术有限公司，荧光定量PCR仪为罗氏480，凝胶成像分析系统为美国UVP公司Imaging System。
1.2标本来源：收集重庆市儿童医院骨髓增生性肿瘤共26例。其中PV组8例；ET组12例；CML组4例；PMF组2例。
1.3 标本采集：采集静脉全血，EDTA-Na2抗凝，4℃保存备用。
1.4 DNA提取：采用大连宝生物Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0试剂盒提取DNA，操作按说明书进行，抽提好的DNA样品经紫外分光光度计检测1.62 1.5 引物设计及合成
1.5.1 根据Genbank提供的参考序列（Accession number：9944145），利用Primer5.0与Bioedit7.0自行设计引物探针
1.5.2 引物序列
上游引物：5’- AGCATTTGGTTTTAAATTATGGAGTATATT-3’
下游引物5’-CTGAATAGTCCTACAGTGTTTTCAGTTTCA-3’
1.6 扩增体系及条件
反应体系为50ul，包括10×PCR缓冲液10ul；10umol/L dNTP 1ul；5U/ul Taq酶1ul；模板2ul；10pmol/L上、下引物各1ul；ddH2o 34ul。扩增条件：95℃ 8分钟预变性。然后94℃ 60秒，54℃ 60秒，72℃ 90秒，共35个循环。最后72℃延伸10分钟，4℃保存备用。
4.8.4 测序，将7.1制备的扩增产物
2 测序结果
2.1. JAK2V617F突变在恶性血液疾病中的表达情况
PV组JAK2V617F阳性率为87.5%（7/8）；ET组阳性率为33.3%（4/12）；PMF组阳性率为50%（1/2）；AML、ALL、CML、CNL、CEL等恶性血液病患者及正常对照均为阴性。JAK2V617F基因突变在PV、ET、PMF患者中的阳性率有显著性差异（X2=47.799，P<0.05）
2.2. 测序结果图
用bioedit7.0生物软件显示1849位碱其G突变为T，且突变位点出现套峰，如图7所示。
图5 JAK2基因1849位碱基正常测序图 3.讲论
骨髓增殖性肿瘤（MPNs）是一类起源于多能造血干细胞，以一系或者多系分化相对较成熟的骨髓细胞克隆性增生异常为特点的一组疾病的统称[1]。增生的细胞其细胞形态和功能相对正常，常表现为多能髓样造血干细胞所属的细胞系（包括红细胞系、血小板系、粒-单核细胞系）中的一系或多系细胞恶性增生；而细胞形态和功能相对正常。常伴有肝脾肿大等外周器官浸润。正由于其具有肿瘤性疾病的特征，在2008年新修订的WHO慢性髓系肿瘤分类中将既往沿用多年的“慢性骨髓增殖性疾病”旧称更名为“骨髓增殖性肿瘤”。MPNs包括4种经典的MPNs以及非典型的MPNs，前者包括慢性髓性白血病（CML）、真性红细胞增多症（PV）、原发性血小板增多症（ET）和原发性骨髓纤维化（PMF），后者包括慢性中性粒细胞白血病（CNL）、肥大细胞疾病（MCD）、慢性嗜酸粒细胞白血病（CEL）和不能分类的MPNs。
研究发现，90%的PV患者中存在JAK2基因V617F突变，进一步研究阐明了其机理：JAK2基因14号外显子第1849位核酸上发生点突变（G>T）使得JH2区域的第617位缬氨酸突变为苯丙氨酸（V>F）。正常情况下，JH2区域抑制JAK2激酶活性，发生突变后抑制作用减弱，从而使JAK2激酶活性明显增强。
迄今为止，临床主要依靠其临床表现、血常规、血清EPO水平、NAP积分、骨髓细胞形态或骨髓活检等进行诊断，而且必须排除继发性因素，但有时仍难以与有相似症状或血象表现的其他疾病相鉴别，例如继发性红细胞增多症，反应性血小板增多，类白血病反应，MDS等，给我们的诊断造成一定的困难，因此对该类疾病找到一种可靠的基因标记将对临床诊断提供很大的帮助。James[2]首先报道了在PV患者中发现JAK2V617F点突变，其后在MPNs的其他亚型中也陆续发现了该突变的存在，但阳性率高低不一。本实验研究发现JAK2V617F点突变在PV患者中阳性率最高，其次为PMF、ET患者，在AML、ALL、CML中为阴性，与国际上报道相符[3]。本实验还发现ET患者中JAK2V617F突变与血红蛋白量、血小板数量无关。但国外有报道[4][5]ET患者中JAK2V617F点突变阳性者血红蛋白量较高、血小板计数较低，故我们的实验还有待增加病例总数以便作进一步分析。PV患者阴性例数较少，未做比较。PV和ET阳性患者白细胞计数显著高于阴性患者。国外研究亦发现阳性患者中白细胞计数高，且可以作为独立的危险因素与血栓形成及骨髓纤维化成正相关[6]。
参考文献：
[1]Tefferi A，Vardiman JW. Classification and diagnosis of myelopro-liferative neoplasms：the 2008 World Health Organizat-
ion criteria and point-of-care diagnostic algorithms[J]. Leukemia，2008， 22（1）：14-22；
[2]James C，U go V，Couedic JPL，et al.A unique clonal JAK2 mutation leading to constitutive signaling causes polycythaemia vera[J].N ature，2005，434（7037）：1144～1148.
[3]Kannim S，Thongnoppakhun W，Auewarakul CU.Two-round
allele specific-polymerase chain reaction：a simple and highly sensitive method for JAK2-V617F mutation detection[J].Clin Chim Acta，2009，401（1～2）：148～151.
[4]Szpurka H，Tiu R，Murugesan G，et al.Refractory anemia with ringed sideroblasts associated with marked thrombocytosis
（RARS-T），another myeloproliferative condition characterized by JAK2V617F mutation[J].Blood，2006，108（7）：2173～2173.
[5] Steensma DP，Dewald GW，Lasho TL. The JAK2 V617F activating tyrosine kinase mutation is an infrequent event in both "atypical" myeloproliferative disorders and myelodysplastic syndro
mes[J].Blood，2005.1207-9.
[6] Levine RL，Loriaux M，Huntly BJ. The JAK2V617F activating mutation occurs in chronic myelomonocytic leukemia and acute myeloid leukemia，but not in acute lymphoblastic leukemia or chronic lymphocytic leukemia[J].Blood，2005.3377-9.
[7] Beer PA，Campbell P J，Scott LM. MPL mutations in myeloproliferative disorders：analysis of the PT-1 coho rt[J]. Blood，2008.141-9.
[8]Heller PG，Lev PR，Salini JP，et al.JAK2V617F mutation in plate-lets from essential thrombocy themia：corretation with clinical features and analysis of STAT3 phosphorylation status[J].Eur JHaematol，2006，77（3）：210～216.
[9] Baxter E J，Scott LM，Campbell PJ. Acquired mutation of the tyrosine kinase JAK2 in human myeloproliferative disorders[J].
The Lancet，2005.1054-61.
[10] Kralovics R，Passamonti F，Buser AS. A gain-of-function mutation of JAK2 in myeloproliferative disorders[J].New England Journal of Medicine，2005， （17）：1779-90.doi：10.1056/NEJM oa
051113.
[11] Levine RL，Belisle C，Wadleigh M. X-inactivation-based clonality analysis and quantitative JAK2V617F assessment reveal a strong association between clonality and JAK2V617F in PV but not ET/MMM，and identifies a subset of JAK2V617F-negative ET and MMM patients with clonal hematopoiesis[J].Blood，2006. 4139
-41.
[12]Barosi G，Rosti V.Novel strategies for patients with chronic my-eloproliferative disorders[J].Curr Opin Hematol，2009 Mar，16（2）：129～134.
[13]徐媛媛，李惠民?骨髓增殖性疾病JAK2V617F研究进展?中国实验血液学杂志2009；17（1）：238-242；
[14]Baxter EJ，Scolt LM，Campbell PJ，et al.Acqurired mutation of the tyrosine Kinase JAK2 in human myeloproliferative disorder[J].Lancet，2005，365（9464）：1054～1061.
[15] Dameshek W. Some speculations on the myeloprolif
erative syndromes[J].Blood，1951.372-5.
[16]Levine RL，Wadleigh M，Cools J. Activating mutation in the tyrosine kinase JAK2 in polycythemia vera，essential thrombocythemia，and myeloid metaplasia with myelo fibrosis
[J].Cancer Cell，2005，（4）：387-97.doi：10.1016/j.ccr.2005.03.023.
[17] Jones AV，Kreil S，Zoi K. Widespread occurrence of the JAK2 V617F mutation in chronic myeloproliferative disord ers
[J].Blood，2005.2162-8.doi：10.1182/blood-2005-03-1320.
[18] James C，Ugo V，Le Couédic JP. A unique clonal JAK2 mutation leading to constitutive signalling causes polycythaemia vera[J].Nature，2005.1144-8.doi：10.1038/nature03546.
[19] Lippert E，Boissinot M，Kralovics R. The JAK2-V617F mutation is frequently present at diagnosis in patients with essential thrombocythemia and polycythemia vera[J]. Blood， 2006.
1865-7.
[20] Nelson ME，Steensma DP. JAK2 V617F in myeloid disorders：what do we know now，and where are we headed[J]. Leu-
kemia and Lymphoma，2006.177-94.
[21] McClure R，Mai M，Lasho T. Validation of two clinically useful assays for evaluation of JAK2 V617F mutation in chronic myeloproliferative disorders[J].Leukemia：Official Journal of the Leukemia Society of America，Leukemia Research Fund，U.K， 2006.
168-71.doi：10.1038/sj.leu.2404007.
[22] Pikman Y，Lee BH，Mercher T. MPLW515L is a novel somatic activating mutation in myelofibrosis with myeloid metapl
asia[J].PLOS MEDICINE，2006.e270.doi：10.1371/journal.pmed.
0030270.
[Abstract] Objective To learn the incidence of JAK2 gene V617F mutation in the myeloproliferative disease （MPNs）. Methods Collected MPNs 26 cases with PV 8 cases， ET 12 cases and PMF 2 cases， then tested JAK2 gene V617F by sequences. Results The positive rate of JAK2 gene V617F mutation was 87.5% （7/8） in PV and 33.3%（4/12） in ET and 50%（1/2） in PMF. However all the cases in AML、ALL、CML、CNL、CEL were negative. Conclusion JAK2 V617F mutation test might serve as a gene marker for diagnosis in PV， at the same time help to the diagnosis for ET and PMF.
【中图分类号】R4 【文献标识码】A 【文章编号】1671-8801（2015）03-0001-02
骨髓增殖性肿瘤（MPNs）是一类起源于多能造血干细胞，以一系或者多系分化相对较成熟的骨髓细胞克隆性增生异常为特点的一组疾病的统称。增生的细胞其细胞形态和功能相对正常，常表现为多能髓样造血干细胞所属的细胞系（包括红细胞系、血小板系、粒-单核细胞系）中的一系或多系细胞恶性增生。骨髓增生性肿瘤（MPNs）包括真性红细胞增多症（PV）、原发性血小板增多症（ET）、慢性髓细胞样白血病（CML）和原发性骨髓纤维化（IMF）。研究发现，JAK2 V617F突变发生在PV、ET、特发性骨髓纤维化、骨髓发育不良症候群、嗜酸细胞过多综合征、慢性骨髓单核细胞性白血病、慢性中性粒细胞性白血病、系统性肥大细胞增多症等疾病中。正是由于JAK2基因V617F突变在多种疾病中都有发现，检测人群该基因突变将会对进一步阐明其引发的广谱的血液病提供依据。
对于JAK2基因V617F突变进行分子诊断国内外的专家建立了数种方法，包括：直接测序、特异引物等位基因PCR法、酶切法、荧光PCR法等，本文用测序法对MPNs做了检测。
1.材料与方法
1.1试剂与仪器：Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0试剂盒购自大连宝生物公司， dNTP，Tag酶购自南京凯基，生物工程技术有限公司，荧光定量PCR仪为罗氏480，凝胶成像分析系统为美国UVP公司Imaging System。
1.2标本来源：收集重庆市儿童医院骨髓增生性肿瘤共26例。其中PV组8例；ET组12例；CML组4例；PMF组2例。
1.3 标本采集：采集静脉全血，EDTA-Na2抗凝，4℃保存备用。
1.4 DNA提取：采用大连宝生物Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0试剂盒提取DNA，操作按说明书进行，抽提好的DNA样品经紫外分光光度计检测1.62
1.5.1 根据Genbank提供的参考序列（Accession number：9944145），利用Primer5.0与Bioedit7.0自行设计引物探针
1.5.2 引物序列
上游引物：5’- AGCATTTGGTTTTAAATTATGGAGTATATT-3’
下游引物5’-CTGAATAGTCCTACAGTGTTTTCAGTTTCA-3’
1.6 扩增体系及条件
反应体系为50ul，包括10×PCR缓冲液10ul；10umol/L dNTP 1ul；5U/ul Taq酶1ul；模板2ul；10pmol/L上、下引物各1ul；ddH2o 34ul。扩增条件：95℃ 8分钟预变性。然后94℃ 60秒，54℃ 60秒，72℃ 90秒，共35个循环。最后72℃延伸10分钟，4℃保存备用。
4.8.4 测序，将7.1制备的扩增产物
2 测序结果
2.1. JAK2V617F突变在恶性血液疾病中的表达情况
PV组JAK2V617F阳性率为87.5%（7/8）；ET组阳性率为33.3%（4/12）；PMF组阳性率为50%（1/2）；AML、ALL、CML、CNL、CEL等恶性血液病患者及正常对照均为阴性。JAK2V617F基因突变在PV、ET、PMF患者中的阳性率有显著性差异（X2=47.799，P<0.05）
2.2. 测序结果图
用bioedit7.0生物软件显示1849位碱其G突变为T，且突变位点出现套峰，如图7所示。
图5 JAK2基因1849位碱基正常测序图 3.讲论
骨髓增殖性肿瘤（MPNs）是一类起源于多能造血干细胞，以一系或者多系分化相对较成熟的骨髓细胞克隆性增生异常为特点的一组疾病的统称[1]。增生的细胞其细胞形态和功能相对正常，常表现为多能髓样造血干细胞所属的细胞系（包括红细胞系、血小板系、粒-单核细胞系）中的一系或多系细胞恶性增生；而细胞形态和功能相对正常。常伴有肝脾肿大等外周器官浸润。正由于其具有肿瘤性疾病的特征，在2008年新修订的WHO慢性髓系肿瘤分类中将既往沿用多年的“慢性骨髓增殖性疾病”旧称更名为“骨髓增殖性肿瘤”。MPNs包括4种经典的MPNs以及非典型的MPNs，前者包括慢性髓性白血病（CML）、真性红细胞增多症（PV）、原发性血小板增多症（ET）和原发性骨髓纤维化（PMF），后者包括慢性中性粒细胞白血病（CNL）、肥大细胞疾病（MCD）、慢性嗜酸粒细胞白血病（CEL）和不能分类的MPNs。
研究发现，90%的PV患者中存在JAK2基因V617F突变，进一步研究阐明了其机理：JAK2基因14号外显子第1849位核酸上发生点突变（G>T）使得JH2区域的第617位缬氨酸突变为苯丙氨酸（V>F）。正常情况下，JH2区域抑制JAK2激酶活性，发生突变后抑制作用减弱，从而使JAK2激酶活性明显增强。
迄今为止，临床主要依靠其临床表现、血常规、血清EPO水平、NAP积分、骨髓细胞形态或骨髓活检等进行诊断，而且必须排除继发性因素，但有时仍难以与有相似症状或血象表现的其他疾病相鉴别，例如继发性红细胞增多症，反应性血小板增多，类白血病反应，MDS等，给我们的诊断造成一定的困难，因此对该类疾病找到一种可靠的基因标记将对临床诊断提供很大的帮助。James[2]首先报道了在PV患者中发现JAK2V617F点突变，其后在MPNs的其他亚型中也陆续发现了该突变的存在，但阳性率高低不一。本实验研究发现JAK2V617F点突变在PV患者中阳性率最高，其次为PMF、ET患者，在AML、ALL、CML中为阴性，与国际上报道相符[3]。本实验还发现ET患者中JAK2V617F突变与血红蛋白量、血小板数量无关。但国外有报道[4][5]ET患者中JAK2V617F点突变阳性者血红蛋白量较高、血小板计数较低，故我们的实验还有待增加病例总数以便作进一步分析。PV患者阴性例数较少，未做比较。PV和ET阳性患者白细胞计数显著高于阴性患者。国外研究亦发现阳性患者中白细胞计数高，且可以作为独立的危险因素与血栓形成及骨髓纤维化成正相关[6]。
参考文献：
[1]Tefferi A，Vardiman JW. Classification and diagnosis of myelopro-liferative neoplasms：the 2008 World Health Organizat-
ion criteria and point-of-care diagnostic algorithms[J]. Leukemia，2008， 22（1）：14-22；
[2]James C，U go V，Couedic JPL，et al.A unique clonal JAK2 mutation leading to constitutive signaling causes polycythaemia vera[J].N ature，2005，434（7037）：1144～1148.
[3]Kannim S，Thongnoppakhun W，Auewarakul CU.Two-round
allele specific-polymerase chain reaction：a simple and highly sensitive method for JAK2-V617F mutation detection[J].Clin Chim Acta，2009，401（1～2）：148～151.
[4]Szpurka H，Tiu R，Murugesan G，et al.Refractory anemia with ringed sideroblasts associated with marked thrombocytosis
（RARS-T），another myeloproliferative condition characterized by JAK2V617F mutation[J].Blood，2006，108（7）：2173～2173.
[5] Steensma DP，Dewald GW，Lasho TL. The JAK2 V617F activating tyrosine kinase mutation is an infrequent event in both "atypical" myeloproliferative disorders and myelodysplastic syndro
mes[J].Blood，2005.1207-9.
[6] Levine RL，Loriaux M，Huntly BJ. The JAK2V617F activating mutation occurs in chronic myelomonocytic leukemia and acute myeloid leukemia，but not in acute lymphoblastic leukemia or chronic lymphocytic leukemia[J].Blood，2005.3377-9.
[7] Beer PA，Campbell P J，Scott LM. MPL mutations in myeloproliferative disorders：analysis of the PT-1 coho rt[J]. Blood，2008.141-9.
[8]Heller PG，Lev PR，Salini JP，et al.JAK2V617F mutation in plate-lets from essential thrombocy themia：corretation with clinical features and analysis of STAT3 phosphorylation status[J].Eur JHaematol，2006，77（3）：210～216.
[9] Baxter E J，Scott LM，Campbell PJ. Acquired mutation of the tyrosine kinase JAK2 in human myeloproliferative disorders[J].
The Lancet，2005.1054-61.
[10] Kralovics R，Passamonti F，Buser AS. A gain-of-function mutation of JAK2 in myeloproliferative disorders[J].New England Journal of Medicine，2005， （17）：1779-90.doi：10.1056/NEJM oa
051113.
[11] Levine RL，Belisle C，Wadleigh M. X-inactivation-based clonality analysis and quantitative JAK2V617F assessment reveal a strong association between clonality and JAK2V617F in PV but not ET/MMM，and identifies a subset of JAK2V617F-negative ET and MMM patients with clonal hematopoiesis[J].Blood，2006. 4139
-41.
[12]Barosi G，Rosti V.Novel strategies for patients with chronic my-eloproliferative disorders[J].Curr Opin Hematol，2009 Mar，16（2）：129～134.
[13]徐媛媛，李惠民?骨髓增殖性疾病JAK2V617F研究进展?中国实验血液学杂志2009；17（1）：238-242；
[14]Baxter EJ，Scolt LM，Campbell PJ，et al.Acqurired mutation of the tyrosine Kinase JAK2 in human myeloproliferative disorder[J].Lancet，2005，365（9464）：1054～1061.
[15] Dameshek W. Some speculations on the myeloprolif
erative syndromes[J].Blood，1951.372-5.
[16]Levine RL，Wadleigh M，Cools J. Activating mutation in the tyrosine kinase JAK2 in polycythemia vera，essential thrombocythemia，and myeloid metaplasia with myelo fibrosis
[J].Cancer Cell，2005，（4）：387-97.doi：10.1016/j.ccr.2005.03.023.
[17] Jones AV，Kreil S，Zoi K. Widespread occurrence of the JAK2 V617F mutation in chronic myeloproliferative disord ers
[J].Blood，2005.2162-8.doi：10.1182/blood-2005-03-1320.
[18] James C，Ugo V，Le Couédic JP. A unique clonal JAK2 mutation leading to constitutive signalling causes polycythaemia vera[J].Nature，2005.1144-8.doi：10.1038/nature03546.
[19] Lippert E，Boissinot M，Kralovics R. The JAK2-V617F mutation is frequently present at diagnosis in patients with essential thrombocythemia and polycythemia vera[J]. Blood， 2006.
1865-7.
[20] Nelson ME，Steensma DP. JAK2 V617F in myeloid disorders：what do we know now，and where are we headed[J]. Leu-
kemia and Lymphoma，2006.177-94.
[21] McClure R，Mai M，Lasho T. Validation of two clinically useful assays for evaluation of JAK2 V617F mutation in chronic myeloproliferative disorders[J].Leukemia：Official Journal of the Leukemia Society of America，Leukemia Research Fund，U.K， 2006.
168-71.doi：10.1038/sj.leu.2404007.
[22] Pikman Y，Lee BH，Mercher T. MPLW515L is a novel somatic activating mutation in myelofibrosis with myeloid metapl
asia[J].PLOS MEDICINE，2006.e270.doi：10.1371/journal.pmed.
0030270.