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【摘要】 目的 观察重组人p53腺病毒注射液(rAd-p53)配合放疗治疗鼻咽癌的临床疗效，探讨治疗前后血清p53蛋白水平的变化和临床意义。方法 18例鼻咽癌患者随机分为rAd-p53联合放疗组(治疗组，9例)和单纯放疗组(对照组，9例)。行至少一个疗程以上的治疗，治疗结束一个月后评价疗效；采用ELSIA检测患者治疗前后血清p53蛋白水平。结果 治疗组的缓解率优于对照组(p<0.05)，患者的生存质量明显改善；治疗组rAd-p53主要副作用为自限性低热；两组患者治疗后的血清p53蛋白水平均有所提高，治疗组表现为明显提高(p<0.05)。结论 rAd-p53联合放疗具有较好疗效和较轻的不良反应，临床使用安全；治疗前后血清p53蛋白水平的动态变化可能是预测rAd-p53治疗鼻咽癌疗效的潜在价值指标，可能对rAd-p53的临床应用具有一定的指导作用。
【关键词】 重组人p53腺病毒；鼻咽肿瘤；p53蛋白
鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)系我国南方及亚洲中国人种的高发头颈部肿瘤[1]。据美国国立癌症研究院(NCI)统计全世界每年新增病例64 798，而其中80%分存在中国南部和南亚，香港发病率每年仍维持30/10万。放疗手段是鼻咽癌的基本治疗手段，但其治疗中晚期NPC病例5~l0年生存率仅有40%左右，且伴随较高的局部区域复发和远处转移等问题[2-4]。因此，如何降低鼻咽癌远处转移率，提高局控率和生存率已成为目前国内外研究的热点。
1 材料与方法
1.1 试验材料 重组人p53腺病毒注射液，由深圳赛百诺基因技术有限公司生产，规格1.0×1012VP/支；人p53蛋白ELSIA检测试剂盒，美国US CNLIFE公司；酶标仪，美国热电公司。
1.2 临床对象资料 初治鼻咽癌患者18例，其中男性14例，女性4例，年龄35~68 (52.6±24.5) 岁。严格按照入选和剔除标准，将患者随机分为基因治疗rAd-p53瘤内注射联合放疗组(治疗组，GTRT组)和单纯放疗组(对照组，RT组)，各9例。两组性别、年龄、放疗剂量均衡性、病灶大小等均无显著性差异(p>0.05)。同时选正常体检者10例检测血清p53蛋白水平，作为空白对照。入选病例均完成一个疗程以上治疗。
1.3 治疗方案 GTRT组：rAd-p53药物置-20ｏC条件下贮存，用前室温静置融化(30min内)，采用瘤内注射的方法多点注射给药，每次剂量1.0×1012VP，一周1次，连续治疗6~8周为一疗程。联合放疗均在rAd-p53注射48h后进行，放疗采用肿瘤病灶区常规或三维适形体外照射，60~70Gy/35次/6~8周。
1.4 血清p53蛋白浓度水平测定 血清p53蛋白浓度测：采用双抗体夹心ELSIA法进行检测，操作步骤按照试剂盒说明执行。详细如下：预先包被鼠抗p53单克隆抗体，每孔先加100?l各标准液和待测血清样品，37ｏC条件下孵育1.5h；再加入100?l兔抗p53单克隆抗体，37ｏC再行孵育2h；洗涤5次；再加100?l HRP标记的二抗，37ｏC孵育1h；洗涤5次；加入TMB底物，37ｏC避光显色10min后，终止反应。于450nm条件下，酶标仪中测定OD值，由当日标准曲线计算所测血清中p53蛋白的浓度。
2 结果
2.1 治疗后两组的肿瘤抑制率比较 rAd-p53联合放疗的治疗组和单纯放疗的对照组分别完成了6~8周的疗程试验。1个月后(第12周)两组患者的肿瘤均明显缩小，两组肿瘤平均缩小率经t检验， P值<0.05。说明GTRT组肿瘤缩小的程度明显高于RT组，GTRT组疗效显著优于RT组。结果表明，rAd-p53联合放疗疗法具有一定的增效作用。
表1 GTRT和RT组肿瘤平均缩小率比较(%,x±s)
备注：增效倍数=GTRT组肿瘤平均缩小率/RT组肿瘤平均缩小率(*为P<0.05)
2.2 两组即刻疗效比较 两组分别治疗结束1个月后，GTRT组肿瘤完全缓解率CR(66.7%)明显优于RT组CR(22.2%)(P<0.05)；两组PR之间没有显著性优势，GTRT组总体即刻有效缓解率(CR+PR)88.9%与RT组(CR+PR)66.6%相比较有明显优势(P<0.05)。结果表明，rAd-p53联合放疗疗法在治疗鼻咽肿瘤方面具有很好的效果，是一种有前景的基因治疗途径。
表2 治疗1个月后GTRT和RT两组有效率比较 例/(%)
2.3 血清p53蛋白水平与近期疗效的关系探讨 10例正常体检者经ELSIA检测血清p53蛋白水平的均值为(101.5±11.5)pg/ml，此与文献报道也相一致。假设以健康人血清p53蛋白平均水平为试验临界点，高于则为阳性，低于则为阴性。
9例GTRT组患者中治疗前p53蛋白阳性者为5例，阴性4例，阳性和阴性率分为55.5%和44.4%。经治疗疗程结束1个月后，具体疗效为CR 6例、PR 2例、SD 1例和PD 0例。结果表明，治疗的总体反应率RR(CR+PR)分别为100%和75.0%，p53蛋白阳性患者的治疗反应率与阴性患者相比具有明显优势(P<0.05);两者的总体疾病稳定率DCR(CR+PR+PD)均为100%，差异性无统计学意义(P>0.05);GTRT组经治疗后，近期疗效未出现PD患者，整体肿瘤控制率为100%。
表3 治疗前GTRT组血清p53蛋白水平与近期疗效检测
2.4 治疗前后患者血清p53蛋白水平变化与疗效的关系研究 结果显示，可能由于鼻咽癌患者通过瘤内多点注射rAd-p53的方式，rAd-p53将野生型p53基因介导入肿瘤细胞，进而表达出野生型p53蛋白，成功诱导肿瘤细胞凋亡，后经放疗治疗，肿瘤细胞崩解释放出p53蛋白入血液，从而导致疗后血清中p53蛋白浓度水平显著升高。但p53蛋白的表达量效以及如何调控恢复至正常人表达水平等等，还有待于进一步研究。
表4 治疗前后GTRT组血清p53蛋白水平变化(pg/ml)
2.5 生存质量和不良反应 生存质量方面，治疗结束后，全部GTRT组患者自觉均浑身乏力感减轻、体力明显有所改善、疼痛感缓解、食欲和体重明显增加，整体表现为精神状态明显好转。卡氏评分增加值≥10分。6例RT组患者自觉精神状态有所好转、体力有所提升、厌食和疼痛感有所改善，体重增加不明显。4例患者卡氏评分增加值≥10分，未出现改善下降的患者。整体比较，rAd-p53联合放疗疗法有助于改善鼻咽肿瘤患者的生存质量。
不良反应方面，GTRT组和RT组全部患者血、尿、便常规检查、血生化指标和心电图等均在正常范围内，变化差异性无统计学意义(P>0.05)。9例GTRT组患者共接受72例人次瘤内注射治疗，主要不良反应为发热，少数伴随注射部位疼痛等不适反应。其中I度发热(<38ｏC)23人次，发生频率31.9%；II度发热(38ｏC ~40ｏC)38人次，发生频率52.8%；III度发热(>40ｏC)11人次，发生频率15.3%。
3 讨论
鼻咽肿瘤是一种顽劣的癌症，其发生、发展与基因的突变、畸形有关。目前放、化疗疗法是鼻咽癌的基本治疗手段，但仍具有很大的局限性，而以肿瘤基因治疗为代表的肿瘤生物治疗将有望成为人类最终攻克癌症的治疗手段。本研究结果显示，rAd-p53联合放疗疗法在治疗NPC方面取得了较好的效果，完全缓解率明显优于单纯放射治疗疗法，并表现出一种明显的增效作用和患者的生存状态改善。联合治疗过程中患者除出现自限性发热症状外，并未出现严重的不良发应。发热反应可能与rAd-p53瘤内注射后瘤灶内的免疫反应有关，也可能与致病性弱、遗传毒性低的腺病毒有关。本研究结果也与一些文献报道相一致。综合结果进一步提示，rAd-p53联合同步放疗在治疗NPC方面可取得更好的肿瘤局控率，临床用药相对安全，具有一定的临床优势。
综上所述，本研究结果可表明重组人p53腺病毒联合同步放疗手段是一种有潜质的NPC肿瘤基因治疗途径，而治疗前后血清p53蛋白变化及其与临床疗效的关系探讨，为进一步指导p53基因治疗的个性化临床用药方案提供可能依据。
参考文献
[1] 欧阳学农,涂华.鼻咽癌免疫治疗及基因治疗进展[J].肿瘤学杂志,2008,14(1):38-41.
[2] 郎锦义,李涛,林冰.鼻咽癌综合治疗研究现状与展望[J].中国肿瘤,2006,15(12):826-831.
[3] 刘海.鼻咽癌治疗的进展[J].川北医学院学报,2009,24(5):417-420.
[4] 胡新民.放疗与化疗的不同联合在中晚期鼻咽癌治疗中的应用[J].中国社区医师：医学专业,2011,(14):118-118.
[5] 敖敏,何刚.重组人p53腺病毒基因药物对人鼻咽癌细胞的抑制实验[J].西部医学,2010,22(9):1596-1560.
作者简介：
赵荣耀,男,(1965-)，主任，研究方向：医院药学专业二十余年.
通讯作者：李新甫，研究方向：医院药学研究
【关键词】 重组人p53腺病毒；鼻咽肿瘤；p53蛋白
鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)系我国南方及亚洲中国人种的高发头颈部肿瘤[1]。据美国国立癌症研究院(NCI)统计全世界每年新增病例64 798，而其中80%分存在中国南部和南亚，香港发病率每年仍维持30/10万。放疗手段是鼻咽癌的基本治疗手段，但其治疗中晚期NPC病例5~l0年生存率仅有40%左右，且伴随较高的局部区域复发和远处转移等问题[2-4]。因此，如何降低鼻咽癌远处转移率，提高局控率和生存率已成为目前国内外研究的热点。
1 材料与方法
1.1 试验材料 重组人p53腺病毒注射液，由深圳赛百诺基因技术有限公司生产，规格1.0×1012VP/支；人p53蛋白ELSIA检测试剂盒，美国US CNLIFE公司；酶标仪，美国热电公司。
1.2 临床对象资料 初治鼻咽癌患者18例，其中男性14例，女性4例，年龄35~68 (52.6±24.5) 岁。严格按照入选和剔除标准，将患者随机分为基因治疗rAd-p53瘤内注射联合放疗组(治疗组，GTRT组)和单纯放疗组(对照组，RT组)，各9例。两组性别、年龄、放疗剂量均衡性、病灶大小等均无显著性差异(p>0.05)。同时选正常体检者10例检测血清p53蛋白水平，作为空白对照。入选病例均完成一个疗程以上治疗。
1.3 治疗方案 GTRT组：rAd-p53药物置-20ｏC条件下贮存，用前室温静置融化(30min内)，采用瘤内注射的方法多点注射给药，每次剂量1.0×1012VP，一周1次，连续治疗6~8周为一疗程。联合放疗均在rAd-p53注射48h后进行，放疗采用肿瘤病灶区常规或三维适形体外照射，60~70Gy/35次/6~8周。
1.4 血清p53蛋白浓度水平测定 血清p53蛋白浓度测：采用双抗体夹心ELSIA法进行检测，操作步骤按照试剂盒说明执行。详细如下：预先包被鼠抗p53单克隆抗体，每孔先加100?l各标准液和待测血清样品，37ｏC条件下孵育1.5h；再加入100?l兔抗p53单克隆抗体，37ｏC再行孵育2h；洗涤5次；再加100?l HRP标记的二抗，37ｏC孵育1h；洗涤5次；加入TMB底物，37ｏC避光显色10min后，终止反应。于450nm条件下，酶标仪中测定OD值，由当日标准曲线计算所测血清中p53蛋白的浓度。
2 结果
2.1 治疗后两组的肿瘤抑制率比较 rAd-p53联合放疗的治疗组和单纯放疗的对照组分别完成了6~8周的疗程试验。1个月后(第12周)两组患者的肿瘤均明显缩小，两组肿瘤平均缩小率经t检验， P值<0.05。说明GTRT组肿瘤缩小的程度明显高于RT组，GTRT组疗效显著优于RT组。结果表明，rAd-p53联合放疗疗法具有一定的增效作用。
表1 GTRT和RT组肿瘤平均缩小率比较(%,x±s)
备注：增效倍数=GTRT组肿瘤平均缩小率/RT组肿瘤平均缩小率(*为P<0.05)
2.2 两组即刻疗效比较 两组分别治疗结束1个月后，GTRT组肿瘤完全缓解率CR(66.7%)明显优于RT组CR(22.2%)(P<0.05)；两组PR之间没有显著性优势，GTRT组总体即刻有效缓解率(CR+PR)88.9%与RT组(CR+PR)66.6%相比较有明显优势(P<0.05)。结果表明，rAd-p53联合放疗疗法在治疗鼻咽肿瘤方面具有很好的效果，是一种有前景的基因治疗途径。
表2 治疗1个月后GTRT和RT两组有效率比较 例/(%)
2.3 血清p53蛋白水平与近期疗效的关系探讨 10例正常体检者经ELSIA检测血清p53蛋白水平的均值为(101.5±11.5)pg/ml，此与文献报道也相一致。假设以健康人血清p53蛋白平均水平为试验临界点，高于则为阳性，低于则为阴性。
9例GTRT组患者中治疗前p53蛋白阳性者为5例，阴性4例，阳性和阴性率分为55.5%和44.4%。经治疗疗程结束1个月后，具体疗效为CR 6例、PR 2例、SD 1例和PD 0例。结果表明，治疗的总体反应率RR(CR+PR)分别为100%和75.0%，p53蛋白阳性患者的治疗反应率与阴性患者相比具有明显优势(P<0.05);两者的总体疾病稳定率DCR(CR+PR+PD)均为100%，差异性无统计学意义(P>0.05);GTRT组经治疗后，近期疗效未出现PD患者，整体肿瘤控制率为100%。
表3 治疗前GTRT组血清p53蛋白水平与近期疗效检测
2.4 治疗前后患者血清p53蛋白水平变化与疗效的关系研究 结果显示，可能由于鼻咽癌患者通过瘤内多点注射rAd-p53的方式，rAd-p53将野生型p53基因介导入肿瘤细胞，进而表达出野生型p53蛋白，成功诱导肿瘤细胞凋亡，后经放疗治疗，肿瘤细胞崩解释放出p53蛋白入血液，从而导致疗后血清中p53蛋白浓度水平显著升高。但p53蛋白的表达量效以及如何调控恢复至正常人表达水平等等，还有待于进一步研究。
表4 治疗前后GTRT组血清p53蛋白水平变化(pg/ml)
2.5 生存质量和不良反应 生存质量方面，治疗结束后，全部GTRT组患者自觉均浑身乏力感减轻、体力明显有所改善、疼痛感缓解、食欲和体重明显增加，整体表现为精神状态明显好转。卡氏评分增加值≥10分。6例RT组患者自觉精神状态有所好转、体力有所提升、厌食和疼痛感有所改善，体重增加不明显。4例患者卡氏评分增加值≥10分，未出现改善下降的患者。整体比较，rAd-p53联合放疗疗法有助于改善鼻咽肿瘤患者的生存质量。
不良反应方面，GTRT组和RT组全部患者血、尿、便常规检查、血生化指标和心电图等均在正常范围内，变化差异性无统计学意义(P>0.05)。9例GTRT组患者共接受72例人次瘤内注射治疗，主要不良反应为发热，少数伴随注射部位疼痛等不适反应。其中I度发热(<38ｏC)23人次，发生频率31.9%；II度发热(38ｏC ~40ｏC)38人次，发生频率52.8%；III度发热(>40ｏC)11人次，发生频率15.3%。
3 讨论
鼻咽肿瘤是一种顽劣的癌症，其发生、发展与基因的突变、畸形有关。目前放、化疗疗法是鼻咽癌的基本治疗手段，但仍具有很大的局限性，而以肿瘤基因治疗为代表的肿瘤生物治疗将有望成为人类最终攻克癌症的治疗手段。本研究结果显示，rAd-p53联合放疗疗法在治疗NPC方面取得了较好的效果，完全缓解率明显优于单纯放射治疗疗法，并表现出一种明显的增效作用和患者的生存状态改善。联合治疗过程中患者除出现自限性发热症状外，并未出现严重的不良发应。发热反应可能与rAd-p53瘤内注射后瘤灶内的免疫反应有关，也可能与致病性弱、遗传毒性低的腺病毒有关。本研究结果也与一些文献报道相一致。综合结果进一步提示，rAd-p53联合同步放疗在治疗NPC方面可取得更好的肿瘤局控率，临床用药相对安全，具有一定的临床优势。
综上所述，本研究结果可表明重组人p53腺病毒联合同步放疗手段是一种有潜质的NPC肿瘤基因治疗途径，而治疗前后血清p53蛋白变化及其与临床疗效的关系探讨，为进一步指导p53基因治疗的个性化临床用药方案提供可能依据。
参考文献
[1] 欧阳学农,涂华.鼻咽癌免疫治疗及基因治疗进展[J].肿瘤学杂志,2008,14(1):38-41.
[2] 郎锦义,李涛,林冰.鼻咽癌综合治疗研究现状与展望[J].中国肿瘤,2006,15(12):826-831.
[3] 刘海.鼻咽癌治疗的进展[J].川北医学院学报,2009,24(5):417-420.
[4] 胡新民.放疗与化疗的不同联合在中晚期鼻咽癌治疗中的应用[J].中国社区医师：医学专业,2011,(14):118-118.
[5] 敖敏,何刚.重组人p53腺病毒基因药物对人鼻咽癌细胞的抑制实验[J].西部医学,2010,22(9):1596-1560.
作者简介：
赵荣耀,男,(1965-)，主任，研究方向：医院药学专业二十余年.
通讯作者：李新甫，研究方向：医院药学研究