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摘要介绍了目前几种主要的分子标记技术,包括RFLP、RAPD、AFLP、SSR、ISSR等在紫菜中的應用概况,并进行了评价,以为紫菜分子标记的研究提供参考。
关键词分子标记;紫菜;遗传多样性
中图分类号S336文献标识码A文章编号 1007-5739(2010)12-0037-02
ResearchDevelopmentofMolecularMarkerTechnologyinPorphyra
YU Yi
(Ocean University of China,Qingdao Shandong 266002)
AbstractIn this paper,the application situation of the main molecular marker technology(such as RFLP,RAPD,AFLP,SSR,ISSR)in Porphyra was introduced and evaluated. It can give reference for the research of molecular marker in Porphyra.
Key wordsmolecular marker;Porphyra;genetic diversity
紫菜作为我国最重要的经济海藻之一,具有重要的市场经济价值和食用保健价值。作为蓝色经济时代的重要产物,紫菜产业地位空前上升,显现出巨大的潜力,受到越来越多的关注。优良品种的选育是养殖和栽培产业的发展关键,近几年紫菜育种的主要目标是提高口感、高温耐受性和抗病能力,虽然传统的育种技术在紫菜良种选育中已经取得了比较大的成果,但依然无法满足整个社会和该产业大规模发展的需要,并且以往的育种工作是建立在表型筛选的基础上,以此为选择标记,需要经历较长的选育周期,并且由于这种表型性状较容易受到环境因素的影响,特征不稳定,不利于长期育种和保持优良性状[1],几十年的紫菜育种工作之后,品质开始下降,而分子标记技术可被应用于种质鉴定、绘制遗传图谱、遗传育种等方面。因此,开发新的分子标记对于扩大紫菜栽培规模和紫菜遗传育种研究是十分重要的。
1RFLP技术在紫菜中的应用
RFLP是最早被应用于遗传研究的基DNA-DNA杂交的DNA分子标记,并且于20世纪八九十年代就被应用到海藻遗传研究中[2]。Niwa等[3]取日本地区广泛栽培的24株紫菜丝状体进行RFLP分析,结果显示所有样品均属于条斑紫菜,未发现甘紫菜,由此认为日本周边生长的主要为条斑紫菜。West等[4]利用RFLP技术对新英格兰地区7种紫菜的rbcl进行分析,发现均为条斑紫菜。Brodie等[5]利用形态学和RFLP技术对紫红紫菜和裂缘紫菜进行分析,发现区别是由编码叶绿体rbcl间隔区的一个单核苷酸转换造成的。RFLP反应的是DNA一级结构水平上,涉及到内切酶位点变异而导致的多态性,但是一旦变异不发生在内切酶位点则很难检测到。并且该方法操作较为复杂,需要大量模板,且对内切酶的要求较高,还涉及到同位素的使用,使其应用受到一定限制。
2RAPD技术在紫菜中的应用
随着PCR技术不断成熟,有人发明了不必提前知道DNA序列信息即可进行核苷酸序列多态性检测的方法[6],即RAPD技术。20世纪90年代初期就有学者用该项技术对紫菜进行研究,如徐涤等[7]利用RAPD技术对条斑紫菜和坛紫菜的5个品系进行遗传多样性分析,得到21条随机引物后,建立系统树,将样品进行聚类,得到品系间的遗传距离;陈骁等[8]采用RAPD技术开发出27个有效引物对11个紫菜样品进行遗传多样性分析,结果显示出坛紫菜的种质资源丰富。王勇等利用RAPD技术筛选出10条随机引物,对6个坛紫菜品系进行研究,最终得到的聚类关系与传统地域和表型关系相符合。基本上可以说RAPD技术在检测遗传多样性和种质鉴定中可以发挥较大作用,缺点是RAPD呈显性遗传,很少为共显性,基本不能鉴别杂合子和纯合子。
3AFLP技术在紫菜中的应用
AFLP是建立在RFLP和RAPD基础上,结合二者优点而逐渐发展起来的一种分子标记技术,既有RFLP的可靠性又有RAPD的方便快捷。AFLP可检测出较高的多态性,DNA用量少但对质量要求较纯,在亲缘关系或表型分化研究中应用广泛。如杨锐等[9]用AFLP技术开发了16对引物来分析11个条斑紫菜品系,发现各品系间的遗传距离和地理间距呈正相关,还对7种坛紫菜进行了分析,发现环境因素是造成其遗传变异的主要因素;陈奕欣等利用AFLP技术分析了福建省主要的坛紫菜栽培品系,采用11对引物进行扩增,得到78.3%的多态条带,计算了不同样品间的遗传距离和相似系数。
4SSR技术在紫菜中的应用
微卫星标记具有丰富多态性、高度重复性、共显性、稳定等优点,且一旦开发就可永久使用,并能在不同实验室之间共享,在构建遗传图谱上发挥重要作用,它目前已经是应用最为广泛的分子标记之一。姚继承[10]筛选了5对微卫星引物对7个坛紫菜样品和2个条斑紫菜样品进行遗传多样性分析;Kong等[11]利用EST-SSR标记对8个不同来源坛紫菜叶状体进行遗传多样性分析,并检测到了多态位点,说明在坛紫菜EST-SSR可以在遗传多样性分析中进行应用;张鹏等[12]运用7对SSR引物对9个坛紫菜不同品系的丝状体进行亲缘关系的研究,并成功区分了2个优良品系;吴亚亚等利用SSR标记对坛紫菜的2个优良品系和1个野生种群进行了遗传多样性分析,得到了能区分具有特异性状紫菜的差异性条带。SSR是目前应用最为广泛的分子标记之一,且在紫菜研究中发展迅速。
5ISSR技术在紫菜中的应用
ISSR技术建立在SSR技术上,不需要知道侧翼序列,直接用锚定特定碱基的重复序列随机扩增,可减少工作量,提高效率,在紫菜中已成功应用。袁昭岚等[13]利用ISSR-PCR方法筛选了23个引物对5个条斑紫菜进行了遗传相似性分析,构建了分子树状图;陈昌生等[14]采用ISSR技术开发出15条引物对3个坛紫菜种群共60个个体进行遗传多样性分析,发现种群间差异小于种群内的个体间;崔灵英等[15]利用22个ISSR引物对条斑紫菜、半叶紫菜、少精紫菜和坛紫菜叶状体进行分析,多态性条带比例很高,可见ISSR分子标记完全可以应用到紫菜遗传多样性和亲缘关系及分类研究等领域中。
作为一种理想的分子标记需要满足:①遍布整个基因组的高多态性;②检测方法容易,成本经济,易于后续使用;③没有基因多效性;④便于实验室之间进行数据交换;⑤表现形式为DNA,并且不受外界环境影响,可以在各个生长阶段检测。⑥表现为共显性,能鉴别纯合子和杂合子[16]。但现今还未发现一种分子标记可以满足所有要求,因此要求研究者根据自己的具体情况来选择特定方法进行分析,尤其是在海藻,如紫菜中,人们对其基因组的特性了解不够全面,遗传图谱尚未构建,即可用、价值高的分子标记数量依然较少,在面对不同技术分析相同样品出现不同结果的情况时,启发研究者需要从多态性形成机制考虑,然后选择对应的技术来进行应用,避免走弯路。
6参考文献
[1] 方宣钧,吴为人,唐纪良.作物DNA标记辅助育种[M].北京:科学出版社,2001:l-9.
[2] SCHOLFIELD C,GACESA P,PRICE J.Restriction fragment length polymorphisms of enzymically-amplified small-subunit rRNA-coding regions from Gracilaria and Gracilariopsis(Rhodophyta)a rapid method for assessing species limits[J].Journal of Applied Phycology,1991(3):329-334.
[3] NIWA K,KIKUCHI N,ARUGA Y.MORPHOLOGICAL AND MOLE-CULAR ANALYSIS OF THE ENDANGERED SPECIES PORPHYRA TENERA(BANGIALES,RHODOPHYTA)[J].Journal of Phycology,2005(41):294-304.
[4] WEST A,MATHIESON A,KLEIN A,et al. Molecular ecological studies of New England species of Porphyra(Rhodophyta,Bangiales)[J].Nova Hedwigia,2005,80(1):1-24.
[5] BRODIE J,HAYES P,BARKER G. Molecular and morphological characters distinguishing two Porphyra species(Rhodophyta:Bangiop-hycidae)[J].European Journal of Phycology,1996(31):303-308.
[6] WILLIAMS J,KUBELIK A,LIVAK K,et al.DNA polymorphisms amp-lified by arbitrary primers are useful as genetic markers[J].Nucleic Acids Research,1990(18):65-71.
[7] 徐涤,宋林生.五个紫菜品系间遗传差异的RAPD分析[J].高技术通讯,2001(11):1-3.
[8] 陈骁,左正宏,姚继承,等.几种紫菜种质资源遗传多样性的RAPD分析[J].海洋科学,2005(29):76-80.
[9] 杨锐,刘必谦,骆其君.利用AFLP技术研究条斑紫菜的遗传变异[J].海洋学报,2005(27):159-162.
[10] 姚继承.坛紫菜微卫星的分离及其在紫菜遗传多样性研究中的应用[D].厦门:厦门大学,2004.
[11] KONG F,MAO Y,YANG H,et al.Genetic Analysis of Porphyra yezoensis Using Microsatellite Markers[J].Plant Molecular Biology Reporter,2009(27):496-502.
[12] 张鹏,张源,王铁杆,等.坛紫菜不同品系亲缘关系的SSR标记分析[J].Journal of Fishery Sciences of China,2009(16):842-849.
[13] 袁昭嵐,黄鹤忠,沈颂东,等.条斑紫菜5个栽培品系的ISSR分析[J].海洋科学,2006(30):9-14.
[14] 陈昌生,谢潮添,纪德华,等.野生坛紫菜种群遗传多样性的ISSR分析[J].水产学报,2008(32):717-724.
[15] 崔灵英,许璞,朱建一,等.4种紫菜叶状体的ISSR分子标记分析[J].中国水产科学,2006(13):371-377.
[16] 刘明,王继华,王同昌.DNA分子标记技术[J].东北林业大学学报,2003,31(6):65-67.
关键词分子标记;紫菜;遗传多样性
中图分类号S336文献标识码A文章编号 1007-5739(2010)12-0037-02
ResearchDevelopmentofMolecularMarkerTechnologyinPorphyra
YU Yi
(Ocean University of China,Qingdao Shandong 266002)
AbstractIn this paper,the application situation of the main molecular marker technology(such as RFLP,RAPD,AFLP,SSR,ISSR)in Porphyra was introduced and evaluated. It can give reference for the research of molecular marker in Porphyra.
Key wordsmolecular marker;Porphyra;genetic diversity
紫菜作为我国最重要的经济海藻之一,具有重要的市场经济价值和食用保健价值。作为蓝色经济时代的重要产物,紫菜产业地位空前上升,显现出巨大的潜力,受到越来越多的关注。优良品种的选育是养殖和栽培产业的发展关键,近几年紫菜育种的主要目标是提高口感、高温耐受性和抗病能力,虽然传统的育种技术在紫菜良种选育中已经取得了比较大的成果,但依然无法满足整个社会和该产业大规模发展的需要,并且以往的育种工作是建立在表型筛选的基础上,以此为选择标记,需要经历较长的选育周期,并且由于这种表型性状较容易受到环境因素的影响,特征不稳定,不利于长期育种和保持优良性状[1],几十年的紫菜育种工作之后,品质开始下降,而分子标记技术可被应用于种质鉴定、绘制遗传图谱、遗传育种等方面。因此,开发新的分子标记对于扩大紫菜栽培规模和紫菜遗传育种研究是十分重要的。
1RFLP技术在紫菜中的应用
RFLP是最早被应用于遗传研究的基DNA-DNA杂交的DNA分子标记,并且于20世纪八九十年代就被应用到海藻遗传研究中[2]。Niwa等[3]取日本地区广泛栽培的24株紫菜丝状体进行RFLP分析,结果显示所有样品均属于条斑紫菜,未发现甘紫菜,由此认为日本周边生长的主要为条斑紫菜。West等[4]利用RFLP技术对新英格兰地区7种紫菜的rbcl进行分析,发现均为条斑紫菜。Brodie等[5]利用形态学和RFLP技术对紫红紫菜和裂缘紫菜进行分析,发现区别是由编码叶绿体rbcl间隔区的一个单核苷酸转换造成的。RFLP反应的是DNA一级结构水平上,涉及到内切酶位点变异而导致的多态性,但是一旦变异不发生在内切酶位点则很难检测到。并且该方法操作较为复杂,需要大量模板,且对内切酶的要求较高,还涉及到同位素的使用,使其应用受到一定限制。
2RAPD技术在紫菜中的应用
随着PCR技术不断成熟,有人发明了不必提前知道DNA序列信息即可进行核苷酸序列多态性检测的方法[6],即RAPD技术。20世纪90年代初期就有学者用该项技术对紫菜进行研究,如徐涤等[7]利用RAPD技术对条斑紫菜和坛紫菜的5个品系进行遗传多样性分析,得到21条随机引物后,建立系统树,将样品进行聚类,得到品系间的遗传距离;陈骁等[8]采用RAPD技术开发出27个有效引物对11个紫菜样品进行遗传多样性分析,结果显示出坛紫菜的种质资源丰富。王勇等利用RAPD技术筛选出10条随机引物,对6个坛紫菜品系进行研究,最终得到的聚类关系与传统地域和表型关系相符合。基本上可以说RAPD技术在检测遗传多样性和种质鉴定中可以发挥较大作用,缺点是RAPD呈显性遗传,很少为共显性,基本不能鉴别杂合子和纯合子。
3AFLP技术在紫菜中的应用
AFLP是建立在RFLP和RAPD基础上,结合二者优点而逐渐发展起来的一种分子标记技术,既有RFLP的可靠性又有RAPD的方便快捷。AFLP可检测出较高的多态性,DNA用量少但对质量要求较纯,在亲缘关系或表型分化研究中应用广泛。如杨锐等[9]用AFLP技术开发了16对引物来分析11个条斑紫菜品系,发现各品系间的遗传距离和地理间距呈正相关,还对7种坛紫菜进行了分析,发现环境因素是造成其遗传变异的主要因素;陈奕欣等利用AFLP技术分析了福建省主要的坛紫菜栽培品系,采用11对引物进行扩增,得到78.3%的多态条带,计算了不同样品间的遗传距离和相似系数。
4SSR技术在紫菜中的应用
微卫星标记具有丰富多态性、高度重复性、共显性、稳定等优点,且一旦开发就可永久使用,并能在不同实验室之间共享,在构建遗传图谱上发挥重要作用,它目前已经是应用最为广泛的分子标记之一。姚继承[10]筛选了5对微卫星引物对7个坛紫菜样品和2个条斑紫菜样品进行遗传多样性分析;Kong等[11]利用EST-SSR标记对8个不同来源坛紫菜叶状体进行遗传多样性分析,并检测到了多态位点,说明在坛紫菜EST-SSR可以在遗传多样性分析中进行应用;张鹏等[12]运用7对SSR引物对9个坛紫菜不同品系的丝状体进行亲缘关系的研究,并成功区分了2个优良品系;吴亚亚等利用SSR标记对坛紫菜的2个优良品系和1个野生种群进行了遗传多样性分析,得到了能区分具有特异性状紫菜的差异性条带。SSR是目前应用最为广泛的分子标记之一,且在紫菜研究中发展迅速。
5ISSR技术在紫菜中的应用
ISSR技术建立在SSR技术上,不需要知道侧翼序列,直接用锚定特定碱基的重复序列随机扩增,可减少工作量,提高效率,在紫菜中已成功应用。袁昭岚等[13]利用ISSR-PCR方法筛选了23个引物对5个条斑紫菜进行了遗传相似性分析,构建了分子树状图;陈昌生等[14]采用ISSR技术开发出15条引物对3个坛紫菜种群共60个个体进行遗传多样性分析,发现种群间差异小于种群内的个体间;崔灵英等[15]利用22个ISSR引物对条斑紫菜、半叶紫菜、少精紫菜和坛紫菜叶状体进行分析,多态性条带比例很高,可见ISSR分子标记完全可以应用到紫菜遗传多样性和亲缘关系及分类研究等领域中。
作为一种理想的分子标记需要满足:①遍布整个基因组的高多态性;②检测方法容易,成本经济,易于后续使用;③没有基因多效性;④便于实验室之间进行数据交换;⑤表现形式为DNA,并且不受外界环境影响,可以在各个生长阶段检测。⑥表现为共显性,能鉴别纯合子和杂合子[16]。但现今还未发现一种分子标记可以满足所有要求,因此要求研究者根据自己的具体情况来选择特定方法进行分析,尤其是在海藻,如紫菜中,人们对其基因组的特性了解不够全面,遗传图谱尚未构建,即可用、价值高的分子标记数量依然较少,在面对不同技术分析相同样品出现不同结果的情况时,启发研究者需要从多态性形成机制考虑,然后选择对应的技术来进行应用,避免走弯路。
6参考文献
[1] 方宣钧,吴为人,唐纪良.作物DNA标记辅助育种[M].北京:科学出版社,2001:l-9.
[2] SCHOLFIELD C,GACESA P,PRICE J.Restriction fragment length polymorphisms of enzymically-amplified small-subunit rRNA-coding regions from Gracilaria and Gracilariopsis(Rhodophyta)a rapid method for assessing species limits[J].Journal of Applied Phycology,1991(3):329-334.
[3] NIWA K,KIKUCHI N,ARUGA Y.MORPHOLOGICAL AND MOLE-CULAR ANALYSIS OF THE ENDANGERED SPECIES PORPHYRA TENERA(BANGIALES,RHODOPHYTA)[J].Journal of Phycology,2005(41):294-304.
[4] WEST A,MATHIESON A,KLEIN A,et al. Molecular ecological studies of New England species of Porphyra(Rhodophyta,Bangiales)[J].Nova Hedwigia,2005,80(1):1-24.
[5] BRODIE J,HAYES P,BARKER G. Molecular and morphological characters distinguishing two Porphyra species(Rhodophyta:Bangiop-hycidae)[J].European Journal of Phycology,1996(31):303-308.
[6] WILLIAMS J,KUBELIK A,LIVAK K,et al.DNA polymorphisms amp-lified by arbitrary primers are useful as genetic markers[J].Nucleic Acids Research,1990(18):65-71.
[7] 徐涤,宋林生.五个紫菜品系间遗传差异的RAPD分析[J].高技术通讯,2001(11):1-3.
[8] 陈骁,左正宏,姚继承,等.几种紫菜种质资源遗传多样性的RAPD分析[J].海洋科学,2005(29):76-80.
[9] 杨锐,刘必谦,骆其君.利用AFLP技术研究条斑紫菜的遗传变异[J].海洋学报,2005(27):159-162.
[10] 姚继承.坛紫菜微卫星的分离及其在紫菜遗传多样性研究中的应用[D].厦门:厦门大学,2004.
[11] KONG F,MAO Y,YANG H,et al.Genetic Analysis of Porphyra yezoensis Using Microsatellite Markers[J].Plant Molecular Biology Reporter,2009(27):496-502.
[12] 张鹏,张源,王铁杆,等.坛紫菜不同品系亲缘关系的SSR标记分析[J].Journal of Fishery Sciences of China,2009(16):842-849.
[13] 袁昭嵐,黄鹤忠,沈颂东,等.条斑紫菜5个栽培品系的ISSR分析[J].海洋科学,2006(30):9-14.
[14] 陈昌生,谢潮添,纪德华,等.野生坛紫菜种群遗传多样性的ISSR分析[J].水产学报,2008(32):717-724.
[15] 崔灵英,许璞,朱建一,等.4种紫菜叶状体的ISSR分子标记分析[J].中国水产科学,2006(13):371-377.
[16] 刘明,王继华,王同昌.DNA分子标记技术[J].东北林业大学学报,2003,31(6):65-67.