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论文摘要： 目的 建立同时测定甘草中甘草酸、甘草苷和异甘草素含量的方法。方法 采用高效液相色谱法对甘草粉末的67%甲醇提取物进行分析。用C18反相色谱柱，1%磷酸水-乙腈梯度洗脱，对不同色谱峰分别采用248、276、360、370 nm紫外波长检测。结果 甘草酸的回归方程为Y=1×106X+16 220，r2=1；甘草苷的回归方程为Y=2×106X+49 444，r2=0.999 5；异甘草素的回归方程为Y=1×107X+4.466 7，r2=1。甘草酸、甘草苷和异甘草素的加样回收率分别为98.01%、102.63%、98.18%。结论 本方法准确、稳定、可靠，可用于甘草中甘草酸、甘草苷和异甘草素3种成分的同时测定。
关键词： 甘草 含量测定
中图分类号：S567.7+1
在甘草质量研究中，建立稳定可靠的甘草多种成分含量测定非常必要。甘草酸、甘草苷、异甘草素是甘草中代表性成分，甘草酸是皂苷类代表，甘草苷是黄酮类代表，而异甘草素是一种异黄酮类成分。
1 仪器与试药
Agilent 1100型高效液相色谱仪（配有G1314A紫外检测器、1315B DAD检测器、G1311A四元梯度泵、G1322A在线脱气装置、G1316A柱温箱）；Agilent 1100化学工作站；Sartorius BS110S 1/万、BP211D 1/（10万）电子分析天平；KL3120D超声清洗机。
甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch. 3年生采自甘肃总寨，1～5年生采自内蒙古杭锦旗，由北京中医药大学王文全教授鉴定。60 ℃干燥过夜并粉碎。甘草酸、甘草苷、异甘草素对照品（批号分别为060520、061009、060801）由上海康九化工公司提供（供含量测定用）。乙腈为色谱纯；水为市售娃哈哈纯净水；甲醇、甲酸、磷酸、冰醋酸为分析纯。
2 方法与结果
2.1 检测波长的确定
分别称取甘草酸、甘草苷、异甘草素对照品适量，分别加甲醇配制成每1 mL约含0.1 mg的对照品溶液。以甲醇为空白，在波长190～400 nm范围内扫描，结果甘草酸的最大吸收波长为248 nm和360 nm，甘草苷的最大吸收波长为276 nm，而异甘草素的最大吸收波长为370 nm。
2.2 色谱条件
色谱柱：Agilent Zorbax Extend分析柱（4.6 mm×250 mm，
5 μm）；柱温：25 ℃；进行梯度洗脱，流动相A为1%磷酸水溶液，流动相B为乙腈；梯度程序、流速及检测波长变化见表1。进样量为10 μL。表1 流动相梯度条件及检测波长（略）
2.3 供试品溶液的制备
精密称取甘草粉末（过60目筛，60 ℃干燥12 h）0.1 g，置25 mL容量瓶中，加入20 mL 67%甲醇冷浸24 h，超声30 min，放至室温，加67%甲醇至刻度，摇匀，以0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液即得。
高效液相色谱法同时测定甘草中甘草酸、甘草苷、异甘草素的含量
2.4 工作曲线
称取甘草苷对照品6.28 mg、甘草酸对照品5.99 mg，分别用甲醇定容于25 mL容量瓶中，作为甘草苷和甘草酸对照品储备液。另取异甘草素对照品4.35 mg，置25 mL容量瓶中，以甲醇溶解并稀释至刻度，再精密吸取0.4 mL置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，即得异甘草素储备液。分别精密吸取甘草苷储备液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，甘草酸储备液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，异甘草素储备液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，置6个10 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，作为系列混合标准溶液。分别进样20 μL，记录甘草苷、甘草酸和异甘草素的峰面积。以峰面积对进样量（μg）进行回归，得回归方程。甘草酸：Y=1×106X+16 220，r2=1；甘草苷：Y=2×106X+49 444，r2=0.999 5；异甘草素：Y=1×107X+4.466 7，r2=1。色谱图见图1。甘草苷、甘草酸、异甘草素色谱峰理论塔板数分别为4万、14万和21万。
2.5 精密度试验
取上述混合标准溶液，连续进样6次，结果甘草酸、甘草苷、异甘草素的峰面积RSD分别为0.65%、0.35%、0.40%，表明精密度符合要求。
2.6 稳定性试验
取甘肃总寨甘草样品1份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，室温放置并于0、2、4、6、8、10 h进样，记录色谱图，代表性色谱图如图2。故以甘草酸、甘草苷和异甘草素三者的峰面积计算10 h的稳定性。结果甘草酸、甘草苷、异甘草素峰面积RSD分别为0.29%、0.49%、0.85%，表明甘草供试品在10 h内稳定。
2.7 重复性试验
取甘肃总寨甘草样品6份，每份0.1 g，精密称定，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，依法测定，结果甘草酸、甘草苷和异甘草素的峰面积RSD分别为2.15%、2.10%、2.63%，表明本法重复性好。
2.8 加样回收率试验
称取甘草苷对照品适量，加甲醇制备成每1 mL含0.663 mg的对照品溶液；称取甘草酸对照品适量，加甲醇制备成每1 mL含0.611 5 mg的对照品溶液；取甘肃总寨甘草样品6份，每份0.05 g，精密称定，分别置6个25 mL容量瓶内，分别加入上述甘草苷对照品溶液2 mL、甘草酸对照品溶液4 mL、“2.3”项中的异甘草素储备液1 mL，再分别按照“2.3”项下方法制备得供试品溶液，依法试验，记录甘草苷、甘草酸和异甘草素的峰面积，并计算加样回收率，结果加样回收率符合规定。结果见表2。表2 甘草酸、甘草苷、异甘草素的加样回收率试验结果（略）
2.9 样品测定
按上述色谱条件，依法测定了内蒙古杭锦旗1～5年生栽培甘草样本中甘草酸、甘草苷和异甘草素的含量，结果见表3。表3 杭锦旗栽培甘草不同年限3种成分的含量测定结果（略）
3 讨论
由以上试验结果可知，本法线性良好，精密度、稳定性好，重复性和加样回收符合规定，可以作为甘草中甘草苷、甘草酸和异甘草素同时测定的方法。
前期在提取溶剂的选择过程中考察过80%氨性甲醇、80%氨性甲醇提取并酸化后定容、80%甲醇（大部分测定甘草黄酮文献采用的提取溶剂）、67%甲醇[2005年版《中华人民共和国药典》（一部）测定甘草酸的基本提取溶剂]、甲醇-0.2 mo1/L醋酸铵-冰醋酸（67∶33∶1）[2005年版《中华人民共和国药典》（一部）测定甘草酸的提取溶剂]、70%乙醇[2005年版《中华人民共和国药典》（一部）测定甘草苷的提取溶剂]、50%乙醇（日本、美国药典测定甘草酸的提取溶剂）。结果表明，除2种氨性甲醇系统外，5种溶剂对各共有成分提取效果近似，综合考虑甘草苷、甘草酸和几个主要共有成分，67%甲醇综合提取效果相对略好，且对甘草苷、甘草酸提取效果分别好于药典相应提取条件[2]。
以本法测定内蒙古杭锦旗甘草样品显示，不同年限甘草中甘草酸、甘草苷、异甘草素存在着一定的差异。
参考文献：
1、.陈云华，赵晓霞，王文全，段天璇 ， 高效液相色谱法同时测定甘草中甘草酸、甘草苷、异甘草素的含量，论文网，2011，05
关键词： 甘草 含量测定
中图分类号：S567.7+1
在甘草质量研究中，建立稳定可靠的甘草多种成分含量测定非常必要。甘草酸、甘草苷、异甘草素是甘草中代表性成分，甘草酸是皂苷类代表，甘草苷是黄酮类代表，而异甘草素是一种异黄酮类成分。
1 仪器与试药
Agilent 1100型高效液相色谱仪（配有G1314A紫外检测器、1315B DAD检测器、G1311A四元梯度泵、G1322A在线脱气装置、G1316A柱温箱）；Agilent 1100化学工作站；Sartorius BS110S 1/万、BP211D 1/（10万）电子分析天平；KL3120D超声清洗机。
甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch. 3年生采自甘肃总寨，1～5年生采自内蒙古杭锦旗，由北京中医药大学王文全教授鉴定。60 ℃干燥过夜并粉碎。甘草酸、甘草苷、异甘草素对照品（批号分别为060520、061009、060801）由上海康九化工公司提供（供含量测定用）。乙腈为色谱纯；水为市售娃哈哈纯净水；甲醇、甲酸、磷酸、冰醋酸为分析纯。
2 方法与结果
2.1 检测波长的确定
分别称取甘草酸、甘草苷、异甘草素对照品适量，分别加甲醇配制成每1 mL约含0.1 mg的对照品溶液。以甲醇为空白，在波长190～400 nm范围内扫描，结果甘草酸的最大吸收波长为248 nm和360 nm，甘草苷的最大吸收波长为276 nm，而异甘草素的最大吸收波长为370 nm。
2.2 色谱条件
色谱柱：Agilent Zorbax Extend分析柱（4.6 mm×250 mm，
5 μm）；柱温：25 ℃；进行梯度洗脱，流动相A为1%磷酸水溶液，流动相B为乙腈；梯度程序、流速及检测波长变化见表1。进样量为10 μL。表1 流动相梯度条件及检测波长（略）
2.3 供试品溶液的制备
精密称取甘草粉末（过60目筛，60 ℃干燥12 h）0.1 g，置25 mL容量瓶中，加入20 mL 67%甲醇冷浸24 h，超声30 min，放至室温，加67%甲醇至刻度，摇匀，以0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液即得。
高效液相色谱法同时测定甘草中甘草酸、甘草苷、异甘草素的含量
2.4 工作曲线
称取甘草苷对照品6.28 mg、甘草酸对照品5.99 mg，分别用甲醇定容于25 mL容量瓶中，作为甘草苷和甘草酸对照品储备液。另取异甘草素对照品4.35 mg，置25 mL容量瓶中，以甲醇溶解并稀释至刻度，再精密吸取0.4 mL置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，即得异甘草素储备液。分别精密吸取甘草苷储备液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，甘草酸储备液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，异甘草素储备液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，置6个10 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，作为系列混合标准溶液。分别进样20 μL，记录甘草苷、甘草酸和异甘草素的峰面积。以峰面积对进样量（μg）进行回归，得回归方程。甘草酸：Y=1×106X+16 220，r2=1；甘草苷：Y=2×106X+49 444，r2=0.999 5；异甘草素：Y=1×107X+4.466 7，r2=1。色谱图见图1。甘草苷、甘草酸、异甘草素色谱峰理论塔板数分别为4万、14万和21万。
2.5 精密度试验
取上述混合标准溶液，连续进样6次，结果甘草酸、甘草苷、异甘草素的峰面积RSD分别为0.65%、0.35%、0.40%，表明精密度符合要求。
2.6 稳定性试验
取甘肃总寨甘草样品1份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，室温放置并于0、2、4、6、8、10 h进样，记录色谱图，代表性色谱图如图2。故以甘草酸、甘草苷和异甘草素三者的峰面积计算10 h的稳定性。结果甘草酸、甘草苷、异甘草素峰面积RSD分别为0.29%、0.49%、0.85%，表明甘草供试品在10 h内稳定。
2.7 重复性试验
取甘肃总寨甘草样品6份，每份0.1 g，精密称定，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，依法测定，结果甘草酸、甘草苷和异甘草素的峰面积RSD分别为2.15%、2.10%、2.63%，表明本法重复性好。
2.8 加样回收率试验
称取甘草苷对照品适量，加甲醇制备成每1 mL含0.663 mg的对照品溶液；称取甘草酸对照品适量，加甲醇制备成每1 mL含0.611 5 mg的对照品溶液；取甘肃总寨甘草样品6份，每份0.05 g，精密称定，分别置6个25 mL容量瓶内，分别加入上述甘草苷对照品溶液2 mL、甘草酸对照品溶液4 mL、“2.3”项中的异甘草素储备液1 mL，再分别按照“2.3”项下方法制备得供试品溶液，依法试验，记录甘草苷、甘草酸和异甘草素的峰面积，并计算加样回收率，结果加样回收率符合规定。结果见表2。表2 甘草酸、甘草苷、异甘草素的加样回收率试验结果（略）
2.9 样品测定
按上述色谱条件，依法测定了内蒙古杭锦旗1～5年生栽培甘草样本中甘草酸、甘草苷和异甘草素的含量，结果见表3。表3 杭锦旗栽培甘草不同年限3种成分的含量测定结果（略）
3 讨论
由以上试验结果可知，本法线性良好，精密度、稳定性好，重复性和加样回收符合规定，可以作为甘草中甘草苷、甘草酸和异甘草素同时测定的方法。
前期在提取溶剂的选择过程中考察过80%氨性甲醇、80%氨性甲醇提取并酸化后定容、80%甲醇（大部分测定甘草黄酮文献采用的提取溶剂）、67%甲醇[2005年版《中华人民共和国药典》（一部）测定甘草酸的基本提取溶剂]、甲醇-0.2 mo1/L醋酸铵-冰醋酸（67∶33∶1）[2005年版《中华人民共和国药典》（一部）测定甘草酸的提取溶剂]、70%乙醇[2005年版《中华人民共和国药典》（一部）测定甘草苷的提取溶剂]、50%乙醇（日本、美国药典测定甘草酸的提取溶剂）。结果表明，除2种氨性甲醇系统外，5种溶剂对各共有成分提取效果近似，综合考虑甘草苷、甘草酸和几个主要共有成分，67%甲醇综合提取效果相对略好，且对甘草苷、甘草酸提取效果分别好于药典相应提取条件[2]。
以本法测定内蒙古杭锦旗甘草样品显示，不同年限甘草中甘草酸、甘草苷、异甘草素存在着一定的差异。
参考文献：
1、.陈云华，赵晓霞，王文全，段天璇 ， 高效液相色谱法同时测定甘草中甘草酸、甘草苷、异甘草素的含量，论文网，2011，05