论文部分内容阅读
摘要 [目的]以拟南芥为材料克隆CDR6基因，构建CDR6基因的过量表达载体并筛选鉴定获得过表达植株。[方法]提取拟南芥mRNA，反转录成cDNA，并以此为模板克隆CDR6基因CDS全长，通过限制性内切酶切割、T4 DNA连接酶连接，将CDR6基因CDS全长连接到带有35S强启动子的pXB094载体上；然后转化至Trans1T1感受态细胞中，菌落PCR鉴定阳性单克隆并测序确认。将重组质粒转化至根瘤农杆菌GV3101菌株，通过浸花法侵染拟南芥野生型植株，通过抗性筛选和鉴定获得预期的转基因植株。[结果]菌落PCR鉴定和测序结果表明CDR6基因已成功构建至pXB094载体；通过抗性筛选并鉴定获得了过量表达阳性植株。[结论]筛选和鉴定获得的过量表达植株为研究CDR6基因的分子功能奠定了基础。
关键词 拟南芥；CDR6基因；过量表达载体；转基因植株
中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）13-063-02
Abstract [Objective] To build up the carrier of Arabidopsis CDR6 gene overexpression and isolate corresponding transgenic lines. [Method] Total RNA was extracted from Arabidopsis seedlings and reverse transcribed as PCR template. CDS fragments of CDR6 gene were amplified through RT PCR. Using the restriction endonuclease and T4 DNA ligase， CDS fragments were subsequently cloned into pXB094 vector， and then were transformed into TransT1 phage resistant competent cells. Bacterial colony PCR and DNA sequencing were performed to confirm that CDS of the Arabidopsis CDR6 gene was successfully cloned. The recombinant plasmids were transformed into Agrobacterium GV3101 cells. Wild type plants were transformed using floraldip method and screened to obtain the desired transgenic plants. [Result] Bacterial colony PCR and DNA sequencing were performed and recombinant plasmids were confirmed. Stably transgenic lines of CDR6 overexpression were obtained through antibiotic screening， and verified through genetic methods. [Conclusion] Construction of Arabidopsis CDR6 gene overexpression and screening of transgenic plants laid the foundation for functional analysis of CDR6.
Key words Arabidopsis thaliana； CDR6； Overexpression carrier； Transgenic plant
擬南芥CDR6基因cDNA全长1 120 bp，编码一种含有NC结构域的功能未知蛋白[1-3]，目前对其生物学功能研究尚未见报道。笔者通过功能缺失型突变体筛选，获得cdr6-1突变体，发现该突变体种子具有耐铅的特性，后来经过PCR克隆出CDR6基因。为进一步研究该基因的功能，笔者构建了
35S┊CDR6
过量表达载体，然后利用基因工程技术通过转基因、筛选、鉴定，获得了过量表达的转基因植株，为进一步揭示拟南芥对重金属耐受的分子机理[4-5]奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验材料。哥伦比亚野生型拟南芥WT，购于美国拟南芥种质资源中心，由合肥工业大学生物与与食品工程学院分子生物学实验室自行繁衍保存。
1.1.2 主要试剂。
EazyTaq DNA Polymerase（TransGen）、RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa）；TIANGel MiDi Purification Kit、T4 DNA 连接酶、TIANprep MiniPlasmid kit、TIANquick MiDi Purification Kit（TIANGEN公司）；XhoI 和HindIII限制性内切酶（NEB公司）。
1.1.3 宿主菌和载体。平末端载体感受态细胞Trans1T1、农杆菌GV3101、pXB094载体（改造后带有35S强启动子和NOS转录终止子）。
1.2 方法
1.2.1 拟南芥平板培养。用25%次氯酸钠浸洗种子2 min，再用无菌水洗涤4～5 次，将种子转移到滤纸上晾干后，播于1/2MS固体培养基中，置于4 ℃冰箱春化3 d后置于培养室[培养条件为温度23 ℃、光照强度100 μmol/（m2· s）、光照时间18 h/d]培养14 d。 1.2.2 拟南芥植株总RNA提取并反转录成cDNA。将研钵洗净，于干燥箱中高温杀菌3 h，然后冷却至室温。取约100 mg拟南芥材料置于研钵中，加入液氮将植株磨碎后，加入1 ml Trizol裂解液，继续研磨至材料融化，将溶液转移至1.5 ml EP管；然后向其中加入200 μl氯仿（预冷），强烈振荡15 s，室温静置5 min，然后于4 ℃、12 000 r/min离心15 min。将上清液转移至新的EP管中，向其中加入500 μl异丙醇（预冷），颠倒混匀，室温静置10 min，然后于 4 ℃、12 000 r/min离心15 min，弃上清。加入1 ml 75%乙醇（750 μl无水乙醇+250 μl DEPC处理水），温和颠倒离心管，然后于4 ℃、8 000 r/min离心5 min，弃上清，室温晾晒5～10 min，让乙醇挥发完全，最后向离心管中加入30～50 μl DEPC处理水溶解RNA（可于58 ℃水浴10 min）；检测其浓度及含量。为防止降解，立即将RNA按反转录试剂盒说明合成cDNA。
1.2.3 CDR6基因扩增。用Oligo7.0软件设计引物：正向引物FP1：NNNCTCGAGATGGGTCTTCTCTCCAACAGA；反向引物RP1：NNNAAGCTTACTCGTGCTTGGTAAAGCTATG。鉴定阳性植株所用PCR扩增引物为：正向引物FP2：NNNCTCGAGATGGGTCTTCTCTCCAACAGA； 反向引物RP2：GAACTTCAGGGTCAGCTTGC。以cDNA为模板进行PCR扩增。
1.2.4 酶切、连接、转化和测序。用限制性内切酶XhoI和 HindIII同时酶切CDR6基因片段与载体pXB094，并回收纯化。用T4连接酶连接酶切片段，并将其转化至Trans1T1感受态，用含有壮观霉素的LB固体培养基筛选阳性克隆，并进行菌落 PCR 验证，将验证正确的克隆接种于含壮观霉素的LB液体培养基中，37 ℃培养12 h，提取质粒并电泳检测，送上海生工生物工程股份有限公司测序。
1.2.5 浸花法侵染拟南芥植株。将重组质粒电击转化至GV3101农杆菌，挑取单菌落进行菌落PCR验证。将验证无误的阳性克隆接种于含壮观霉素和庆大霉素的LB培养基中，28 ℃培养至OD600为1.2左右；将菌液转移至离心管中，4 ℃、6 000 r/min离心10 min，弃上清；用渗透缓冲液（1/2 MS 培养基+5%蔗糖）重悬至OD600=0.8～1.0，加入终浓度为0.03% Silwet-L77，混匀；事先将待侵染植株的果荚去除，用渗透缓冲液侵染花序10～15 s，侵染完成后，将植株用保鲜膜包裹好，放入纸箱避光培养24 h后取下保鲜膜，放入培养室中培养。
2 结果与分析
2.1 CDR6基因的克隆
以cDNA为模板扩增CDR6基因，将PCR产物电泳检测结果见图1a。CDR6基因CDS序列长780 bp，条带大小与目的片段大小一致，说明成功克隆出CDR6基因。另外对pXB094质粒进行电泳检测，结果见图1b。
2.2 CDR6基因过量表达载体构建 用限制性内切酶 XhoI和HindIII同时对基因CDR6和pXB094载体进行双酶切，切胶回收后，电泳检测结果见图2。用含壮观霉素的LB平板筛选阳性单克隆，菌落PCR验证，电泳检测结果见图3，扩增出的条带大小正确。对测序结果进行比对，发现序列100%比对，说明CDR6过表达载体构建完成。
2.3 转基因阳性植株的筛选 植株侵染后，收取T0代种子。用含有卡那霉素的1/2MS培养基筛選种子，筛选结果见图4，箭头所指幼苗很绿可以存活的为阳性株，将其移栽至土壤中进行培养，待幼苗长大后，提取野生型和转基因植株的基因组DNA，并以此为模板进行PCR鉴定。所用引物扩增出的PCR产物总长度为1 000 bp左右，对照植株无条带，阳性植株有条带（图5中1～8号株系），说明鉴定出的转基因植株为阳性植株。
3 结论与讨论
重金属造成的土壤和水源污染已对全球的食品安全、人类身体健康、生态环境和农业可持续发展构成严重威胁。目前已克隆出一些植物抗重金属基因并对其抗逆机理进行了深入研究，这种将外源抗逆基因导入植物基因组的基因工程技术，在提高植物抗逆性、改良植物遗传性状及改善土壤重金属污染问题等方面具有广阔的应用前景[7-9] 。前期研究结果显示，功能缺失型突变体cdr61在铅胁迫下与WT相比表现出更为耐受的特性，另外CDR6基因还会被铅诱导表达。这表明CDR6基因可能会参与铅胁迫响应。CDR6基因过量表达植株的获得将有利于研究植物对重金属的响应机制，为改善土壤重金属污染提供理论依据[10]。
参考文献
[1]VANNINI C，LOCATELLI F，BRACALE M，et al.Overexpession of the rice OsMYB4 gene increases chilling and freezing tolerance of arabidopsis thaliana plants[J].Plant Journal，2001，37：115-127.
[2] YONG X，NING T，HAO D，et al.Characterization of OsCDR6 as a key player of the basic leucine zipper transcription factor family for conferring abscisic acid sensitivity and salinity and drought tolerance in rice [J].Plant Physiology，2008，148（4）：1938-1952.
[3] ASSUNCO AG，HERREROA E.Arabidopsis thaliana transcription factors bZIP19 and bZIP23 regulate the adaptation to zinc deficiency [J].PNAS，2010，22：10296-10301.
[4] NIJHAWAN A，JAIN M，AKHILESH K，et al.Genomic survey and gene expression analysis of the basic leucine zipper transcription factor family in rice[J].Plant Physiology，2008，146（2）：333-350.
[5]CLEMENS S.Molecular mechanisms of plant metal tolerance and homeostasis[J].Planta，2011，212（4）：475-486.
[6] 柏晓娅，顾菊，陈光朗，等.拟南芥抗旱突变体csm1-1的鉴定及其基因克隆[J].合肥工业大学学报，2013，36（12）：1518-1522.
[7] 侯文胜，郭三堆，路明，等.利用转基因技术进行植物遗传改良[J].生物技术通报，2002（1）：10-15.
[8] 吴福彪.基因工程与植物的遗传改良[J].生物学通报，2010，45（5）：7-10.
[9] 曹斌，何松洁，夏建新.重金属污染现状分析及其对策研究[J].中央民族大学学报：自然科学版，2009，18（1）：30.
[10] 唐东民，伍钧，唐勇，等.重金属胁迫对植物的毒害及其抗性机理研究进展[J].四川环境，2008，27（5）：79-82.
关键词 拟南芥；CDR6基因；过量表达载体；转基因植株
中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）13-063-02
Abstract [Objective] To build up the carrier of Arabidopsis CDR6 gene overexpression and isolate corresponding transgenic lines. [Method] Total RNA was extracted from Arabidopsis seedlings and reverse transcribed as PCR template. CDS fragments of CDR6 gene were amplified through RT PCR. Using the restriction endonuclease and T4 DNA ligase， CDS fragments were subsequently cloned into pXB094 vector， and then were transformed into TransT1 phage resistant competent cells. Bacterial colony PCR and DNA sequencing were performed to confirm that CDS of the Arabidopsis CDR6 gene was successfully cloned. The recombinant plasmids were transformed into Agrobacterium GV3101 cells. Wild type plants were transformed using floraldip method and screened to obtain the desired transgenic plants. [Result] Bacterial colony PCR and DNA sequencing were performed and recombinant plasmids were confirmed. Stably transgenic lines of CDR6 overexpression were obtained through antibiotic screening， and verified through genetic methods. [Conclusion] Construction of Arabidopsis CDR6 gene overexpression and screening of transgenic plants laid the foundation for functional analysis of CDR6.
Key words Arabidopsis thaliana； CDR6； Overexpression carrier； Transgenic plant
擬南芥CDR6基因cDNA全长1 120 bp，编码一种含有NC结构域的功能未知蛋白[1-3]，目前对其生物学功能研究尚未见报道。笔者通过功能缺失型突变体筛选，获得cdr6-1突变体，发现该突变体种子具有耐铅的特性，后来经过PCR克隆出CDR6基因。为进一步研究该基因的功能，笔者构建了
35S┊CDR6
过量表达载体，然后利用基因工程技术通过转基因、筛选、鉴定，获得了过量表达的转基因植株，为进一步揭示拟南芥对重金属耐受的分子机理[4-5]奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验材料。哥伦比亚野生型拟南芥WT，购于美国拟南芥种质资源中心，由合肥工业大学生物与与食品工程学院分子生物学实验室自行繁衍保存。
1.1.2 主要试剂。
EazyTaq DNA Polymerase（TransGen）、RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa）；TIANGel MiDi Purification Kit、T4 DNA 连接酶、TIANprep MiniPlasmid kit、TIANquick MiDi Purification Kit（TIANGEN公司）；XhoI 和HindIII限制性内切酶（NEB公司）。
1.1.3 宿主菌和载体。平末端载体感受态细胞Trans1T1、农杆菌GV3101、pXB094载体（改造后带有35S强启动子和NOS转录终止子）。
1.2 方法
1.2.1 拟南芥平板培养。用25%次氯酸钠浸洗种子2 min，再用无菌水洗涤4～5 次，将种子转移到滤纸上晾干后，播于1/2MS固体培养基中，置于4 ℃冰箱春化3 d后置于培养室[培养条件为温度23 ℃、光照强度100 μmol/（m2· s）、光照时间18 h/d]培养14 d。 1.2.2 拟南芥植株总RNA提取并反转录成cDNA。将研钵洗净，于干燥箱中高温杀菌3 h，然后冷却至室温。取约100 mg拟南芥材料置于研钵中，加入液氮将植株磨碎后，加入1 ml Trizol裂解液，继续研磨至材料融化，将溶液转移至1.5 ml EP管；然后向其中加入200 μl氯仿（预冷），强烈振荡15 s，室温静置5 min，然后于4 ℃、12 000 r/min离心15 min。将上清液转移至新的EP管中，向其中加入500 μl异丙醇（预冷），颠倒混匀，室温静置10 min，然后于 4 ℃、12 000 r/min离心15 min，弃上清。加入1 ml 75%乙醇（750 μl无水乙醇+250 μl DEPC处理水），温和颠倒离心管，然后于4 ℃、8 000 r/min离心5 min，弃上清，室温晾晒5～10 min，让乙醇挥发完全，最后向离心管中加入30～50 μl DEPC处理水溶解RNA（可于58 ℃水浴10 min）；检测其浓度及含量。为防止降解，立即将RNA按反转录试剂盒说明合成cDNA。
1.2.3 CDR6基因扩增。用Oligo7.0软件设计引物：正向引物FP1：NNNCTCGAGATGGGTCTTCTCTCCAACAGA；反向引物RP1：NNNAAGCTTACTCGTGCTTGGTAAAGCTATG。鉴定阳性植株所用PCR扩增引物为：正向引物FP2：NNNCTCGAGATGGGTCTTCTCTCCAACAGA； 反向引物RP2：GAACTTCAGGGTCAGCTTGC。以cDNA为模板进行PCR扩增。
1.2.4 酶切、连接、转化和测序。用限制性内切酶XhoI和 HindIII同时酶切CDR6基因片段与载体pXB094，并回收纯化。用T4连接酶连接酶切片段，并将其转化至Trans1T1感受态，用含有壮观霉素的LB固体培养基筛选阳性克隆，并进行菌落 PCR 验证，将验证正确的克隆接种于含壮观霉素的LB液体培养基中，37 ℃培养12 h，提取质粒并电泳检测，送上海生工生物工程股份有限公司测序。
1.2.5 浸花法侵染拟南芥植株。将重组质粒电击转化至GV3101农杆菌，挑取单菌落进行菌落PCR验证。将验证无误的阳性克隆接种于含壮观霉素和庆大霉素的LB培养基中，28 ℃培养至OD600为1.2左右；将菌液转移至离心管中，4 ℃、6 000 r/min离心10 min，弃上清；用渗透缓冲液（1/2 MS 培养基+5%蔗糖）重悬至OD600=0.8～1.0，加入终浓度为0.03% Silwet-L77，混匀；事先将待侵染植株的果荚去除，用渗透缓冲液侵染花序10～15 s，侵染完成后，将植株用保鲜膜包裹好，放入纸箱避光培养24 h后取下保鲜膜，放入培养室中培养。
2 结果与分析
2.1 CDR6基因的克隆
以cDNA为模板扩增CDR6基因，将PCR产物电泳检测结果见图1a。CDR6基因CDS序列长780 bp，条带大小与目的片段大小一致，说明成功克隆出CDR6基因。另外对pXB094质粒进行电泳检测，结果见图1b。
2.2 CDR6基因过量表达载体构建 用限制性内切酶 XhoI和HindIII同时对基因CDR6和pXB094载体进行双酶切，切胶回收后，电泳检测结果见图2。用含壮观霉素的LB平板筛选阳性单克隆，菌落PCR验证，电泳检测结果见图3，扩增出的条带大小正确。对测序结果进行比对，发现序列100%比对，说明CDR6过表达载体构建完成。
2.3 转基因阳性植株的筛选 植株侵染后，收取T0代种子。用含有卡那霉素的1/2MS培养基筛選种子，筛选结果见图4，箭头所指幼苗很绿可以存活的为阳性株，将其移栽至土壤中进行培养，待幼苗长大后，提取野生型和转基因植株的基因组DNA，并以此为模板进行PCR鉴定。所用引物扩增出的PCR产物总长度为1 000 bp左右，对照植株无条带，阳性植株有条带（图5中1～8号株系），说明鉴定出的转基因植株为阳性植株。
3 结论与讨论
重金属造成的土壤和水源污染已对全球的食品安全、人类身体健康、生态环境和农业可持续发展构成严重威胁。目前已克隆出一些植物抗重金属基因并对其抗逆机理进行了深入研究，这种将外源抗逆基因导入植物基因组的基因工程技术，在提高植物抗逆性、改良植物遗传性状及改善土壤重金属污染问题等方面具有广阔的应用前景[7-9] 。前期研究结果显示，功能缺失型突变体cdr61在铅胁迫下与WT相比表现出更为耐受的特性，另外CDR6基因还会被铅诱导表达。这表明CDR6基因可能会参与铅胁迫响应。CDR6基因过量表达植株的获得将有利于研究植物对重金属的响应机制，为改善土壤重金属污染提供理论依据[10]。
参考文献
[1]VANNINI C，LOCATELLI F，BRACALE M，et al.Overexpession of the rice OsMYB4 gene increases chilling and freezing tolerance of arabidopsis thaliana plants[J].Plant Journal，2001，37：115-127.
[2] YONG X，NING T，HAO D，et al.Characterization of OsCDR6 as a key player of the basic leucine zipper transcription factor family for conferring abscisic acid sensitivity and salinity and drought tolerance in rice [J].Plant Physiology，2008，148（4）：1938-1952.
[3] ASSUNCO AG，HERREROA E.Arabidopsis thaliana transcription factors bZIP19 and bZIP23 regulate the adaptation to zinc deficiency [J].PNAS，2010，22：10296-10301.
[4] NIJHAWAN A，JAIN M，AKHILESH K，et al.Genomic survey and gene expression analysis of the basic leucine zipper transcription factor family in rice[J].Plant Physiology，2008，146（2）：333-350.
[5]CLEMENS S.Molecular mechanisms of plant metal tolerance and homeostasis[J].Planta，2011，212（4）：475-486.
[6] 柏晓娅，顾菊，陈光朗，等.拟南芥抗旱突变体csm1-1的鉴定及其基因克隆[J].合肥工业大学学报，2013，36（12）：1518-1522.
[7] 侯文胜，郭三堆，路明，等.利用转基因技术进行植物遗传改良[J].生物技术通报，2002（1）：10-15.
[8] 吴福彪.基因工程与植物的遗传改良[J].生物学通报，2010，45（5）：7-10.
[9] 曹斌，何松洁，夏建新.重金属污染现状分析及其对策研究[J].中央民族大学学报：自然科学版，2009，18（1）：30.
[10] 唐东民，伍钧，唐勇，等.重金属胁迫对植物的毒害及其抗性机理研究进展[J].四川环境，2008，27（5）：79-82.