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摘要：对全鳞型黄金鲫和线鳞型黄金鲫的mtDNA D-loop及其邻近区段进行PCR扩增并测序，并检测了两种类型黄金鲫肌肉的GPI和LDH同工酶。1尾黄金鲫（全鳞型）获得了碱基排列顺序清晰的1348 bp的片段，2尾黄金鲫（全鳞型）尾为1351 bp，3尾黄金鲫（均为线鳞型）为1349 bp。应用MEGA6.0软件与GenBank上的3个鲤鱼（KC292935、KC292936和X61010.1）和3个鲫鱼（KC292946、KC292947和KC292948）相应区段比较结果表明，6尾黄金鲫与鲤鱼和鲫鱼的遗传距分别为0.011和0.095，鲤鱼与鲫鱼的遗传距为0.097。GPI与LDH两种同工酶谱显示两种类型黄金鲫均具有来自鲤鲫双方的遗传物质。结果表明，全鳞型与线鳞型黄金鲫均符合母本为鲤鱼、父本为鲫鱼的遗传特征，推测线鳞型黄金鲫母本鳞被的基因型应为SSNn、SsNn或ssNn，父本应为SSnn，线鳞型黄金鲫鳞被的基因型应为SSNn或SsNn。
关键词：黄金鲫；鳞被；基因型；mtDNA；碱基序列；同工酶
黄金鲫为国家级天津市换新水产良种场培育的以框鳞镜鲤为母本、红鲫为父本的杂交种，2007年被国家认定为养殖新品种（品种登记号：GS02-001-2007）。鱼体背部及两侧呈浅黄色，腹部银灰色，体被全鳞，鳞片中等大小，侧线鳞31～34枚[1-2]。2013年11月份在天津市两个养殖场养殖的黄金鲫中发现有线鳞型个体（90尾中有6尾线鳞型个体，占6.67%）。
鲤鱼中依据鳞被特征可以分为鳞鲤（scaled carp）、线鳞镜鲤（linear mirror carp）、散鳞镜鲤（scattered mirror carp）和革鲤（leather carp）或裸鲤（nude carp）共四种类型，其中线鳞镜鲤和裸鲤均含有N基因，而楼允东认为在我国用于杂交的鲤鱼品种不包括线鳞镜鲤和革鲤[3-4]。至今在我国鲤鲫杂交子代中没有关于线鳞型个体的报导。mtDNA为母性遗传，其D-loop以及COⅠ等区段的序列分析可以作为种类鉴别的DNA条形码[5-10]。同工酶可以有效鉴别鲤鲫杂交种[11-14]。
为探讨线鳞型个体是否属于黄金鲫，是否具有黄金鲫的遗传结构，鳞被遗传特点如何，本研究以3尾全鳞型黄金鲫以及3尾线鳞型个体（以下也称为黄金鲫）为实验材料进行了mtDNA D-loop及其邻近区段的PCR扩增和序列测定，与GenBank上的鲤鱼、鲫鱼的相应区段进行了序列比较。同时检测了两种类型黄金鲫肌肉的GPI和LDH同工酶。以期为黄金鲫的种质鉴定以及鲤、鲫鱼遗传育种工作提供依据。
1材料与方法
1.1试验鱼
于2013年11月从天津市某鱼类养殖场采集3尾全鳞型黄金鲫以及3尾线鳞型黄金鲫（图1、表1）。鲜活状态下剪取大小约1.0 cm×0.5 cm的鳍条用于DNA提取，-20 ℃冷冻保存鱼体用于同工酶的检测。
1.2DNA的提取、mtDNA D-loop及邻近区段PCR扩增
用苯酚-氯仿抽提法从鳍条提取总基因组DNA，4 ℃下保存备用[15]。以提取的DNA为模板，使用L15923和H1067引物对每尾试验鱼的mtDNA D-loop及其邻近区段进行扩增，两个引物的结合位点分别位于tRNAThr和12S rRNA 编码区上。将PCR产物委托深圳华大基因科技有限公司纯化并测序，得到的序列依据峰图进行确认[9]。
1.3DNA序列分析
使用MEGA6.0软件对6个黄金鲫序列、GenBank上的3个鲤鱼序列（KC292935、KC292936和X61010.1）和3个鲫鱼序列（KC292946、KC292947和KC292948）进行比对分析，计算6尾黄金鲫与鲤鱼、鲫鱼的遗传距，构建NJ树[16]。
1.4同工酶电泳
使用水平式淀粉凝胶电泳法（缓冲液为C-APM）检测试验鱼背部肌肉的葡萄糖磷酸异构酶（GPI）和乳酸脱氢酶（LDH），并与鲤、鲫对照。电泳及染色同鲍迪等采用的方法[14]。
2结果
2.1mtDNA D-loop 及其邻近区段的PCR扩增
对6尾黄金鲫的mtDNA D-loop及其邻近区段进行PCR扩增，经1%的琼脂糖凝胶电泳均得到长度大约为1600bp的DNA片段（图2）。
2.2黄金鲫序列与GenBank中的鲤鱼序列（KC292936）的比较
PCR产物经纯化、测序、峰图确认，获得了碱基排列顺序清晰的1348bp-1351 bp 的片段。与GenBank中的鲤鱼序列（KC292936）进行BLAST比对，有碱基插入现象，所得片段位于KC292936中的100至1447之间，包含部分tRNAThr、全部D-loop和部分tRNAPhe。6尾黄金鲫中1号和3号为1种单倍型、片段长度为1351bp，2号为1种单倍型、片段长度为1348bp，4号、5号和6号为1种单倍型、片段长度为1349bp（表2）。
2.3黄金鲫与鲤、鲫的遗传距离和系统树
使用MEGA6.0对6尾黄金鲫和GenBank上的3个鲤鱼序列和3个鲫鱼序列进行分析。6尾黄金鲫个体间、鲤鱼3个序列间和鲫鱼3个序列间的遗传距分别为0.006、0.018和0.001。3尾全鳞型黄金鲫与3尾线鳞型黄金鲫、鲤及鲫的遗传距分别为0.009、0.012和0.094，3尾线鳞型黄金鲫与鲤、鲫的遗传距分别为0.010和0.096，鲤、鲫之间的遗传距为0.097。12个序列间的NJ树见图3。
2.4同工酶
同工酶电泳分析结果表明全鳞型、线鳞型的GPI和LDH两种同工酶均由来自于鲤、鲫双方的遗传物质所支配（图4）。
3讨论 3.1线鳞型黄金鲫父母本的推测
线粒体DNA（mtDNA）为母性遗传，其一些区段的RFLP或碱基序列可以用于物种的遗传多样性分析，也可以作为DNA条形码进行物种鉴定[4-11]。本研究中得到的包含部分tRNAThr、全部D-loop和部分tRNAPhe 的DNA片段，3尾全鳞型黄金鲫与3尾线鳞型黄金鲫之间的遗传距为0.009，3尾全鳞型黄金鲫和3尾线鳞型黄金鲫与GenBank中3个鲤鱼序列的遗传距分别为0.012和0.010，均小于2%，符合种内遗传特征[7-8，10]。由此可以认为无论是全鳞型黄金鲫还是线鳞型黄金鲫，其母本均为鲤鱼。同工酶是杂交种鉴别的有效手段之一[11-14]。全鳞型黄金鲫和线鳞型黄金鲫的葡萄糖磷酸变位酶（GPI）和乳酸脱氢酶（LDH）均具有鲤鲫双方的遗传物质，符合鲤鲫杂交种的特性[11-12，14]。
3.2线鳞型黄金鲫鳞被基因型的推测
鲤鱼鳞被是由S-s和N-n两对基因控制，可分为四种类型，分别为鳞鲤（全鳞）（S-nn）、线鳞镜鲤（S-Nn）、散鳞镜鲤（ssnn）和革鲤（ssNn），NN个体不能存活[3-4]。欧鲫、丁鱥和鲤鱼具有位于同源染色体上的同源基因，欧鲫与革鲤的杂交的子代中几乎一半是全鳞型、一半是线鳞型，线鳞型鲤鲫杂种外形颇似线鳞镜鲤[3]。由于鲤鱼中NN个体不能存活，所以推测本研究中线鳞型黄金鲫母本鳞被的基因型应为SSNn、SsNn或ssNn，这样的母本与红鲫杂交，理论上一半子代应为全鳞型个体（SSnn或Ssnn）、另一半应为线鳞型个体（SSNn或SsNn）。
参考文献：
[1]金万昆.淡水鱼类远缘杂交实验报告[M].北京：中国农业科学技术出版社，2009：127-140
[2] 金万昆，付连君.黄金鲫养殖技术[J].河南水产，2010（4）：24-25
[3] 张兴忠，仇潜如，陈曾龙，等.鱼类遗传与鱼种[M].北京：农业出版社，1988：93-99
[4] 楼允东.鱼类育种学[M].北京：中国农业出版社，1999：305-313
[5] 肖武汉，张亚平.鱼类线粒体DNA的遗传与进化[J].水生生物学报，2000，24（4）：384-391
[6] 周延清，杨清香，张改娜.生物遗传标记与应用[M].北京：化学工业出版社，2008：119-132
[7] Hebert P D N，Ratnasingham S，deWaard J R.Barcoding animal life： cytochrome c oxidase subunit 1 divergences among closely related species[J].Proceedings of the Royal Society B，2003，270：96-99
[8] Hebert P D N，Cywinska A，Ball S L， et al.Biological identifications through DNA barcodes[J].Proceedings of the Royal Society B，2003，270：313-321
[9] 郝君，杨蔷，鲍迪，等.6种鱼mtDNA D-loop及其邻近区段的序列比较分析[J].大连海洋大学学报，2013，28（2）：160-165
[10] 张大莉，董仕，白俊杰，等.大口黑鲈北方亚种和佛罗里达亚种mtDNACOⅠ序列的分析[J].大连海洋大学学报，2014，29（3）：212-216
[11] Dong S， Taniguchi N.Allozyme， morphology and growth autotriploids and allotriploids in common carp[J].Suisanzoshoku，1993，41（1）：35-43
[12] 董仕，王茜，孟宪军.湘云鲫红细胞大小及同工酶分析[C].2001年中国水产学会学术年会论文集（中国水产学会编），北京：海洋出版社，2002：61-65
[13]丁立云，曹义虎，贺刚，等.同工酶分析技术及其在水产动物研究中的应用[J].江西水产科技，2013（3）：31-35
[14] 鲍迪，梁爱军，董莹，等.鲤鲫杂交子代的同工酶分析[J].水产科学，2012，31（5）：283-287.
[15] Perez-Enriquze R，Taniguchi N.Genetic structure of red sea bream（Pagrus major） population of Japan and the Southwest Pacific，using Microsatellite DNA Markers[J].Fisheries Science，1999，65（1）：23-30
[16] Tamura K，Stecher G，Peterson D，et al.MEGA6：molecular evolutionary genetics analysis version 6.0[J].Molecular Biology and Evolution，2013，30（12） ：2725-2729
（收稿日期：2015-05-26）
关键词：黄金鲫；鳞被；基因型；mtDNA；碱基序列；同工酶
黄金鲫为国家级天津市换新水产良种场培育的以框鳞镜鲤为母本、红鲫为父本的杂交种，2007年被国家认定为养殖新品种（品种登记号：GS02-001-2007）。鱼体背部及两侧呈浅黄色，腹部银灰色，体被全鳞，鳞片中等大小，侧线鳞31～34枚[1-2]。2013年11月份在天津市两个养殖场养殖的黄金鲫中发现有线鳞型个体（90尾中有6尾线鳞型个体，占6.67%）。
鲤鱼中依据鳞被特征可以分为鳞鲤（scaled carp）、线鳞镜鲤（linear mirror carp）、散鳞镜鲤（scattered mirror carp）和革鲤（leather carp）或裸鲤（nude carp）共四种类型，其中线鳞镜鲤和裸鲤均含有N基因，而楼允东认为在我国用于杂交的鲤鱼品种不包括线鳞镜鲤和革鲤[3-4]。至今在我国鲤鲫杂交子代中没有关于线鳞型个体的报导。mtDNA为母性遗传，其D-loop以及COⅠ等区段的序列分析可以作为种类鉴别的DNA条形码[5-10]。同工酶可以有效鉴别鲤鲫杂交种[11-14]。
为探讨线鳞型个体是否属于黄金鲫，是否具有黄金鲫的遗传结构，鳞被遗传特点如何，本研究以3尾全鳞型黄金鲫以及3尾线鳞型个体（以下也称为黄金鲫）为实验材料进行了mtDNA D-loop及其邻近区段的PCR扩增和序列测定，与GenBank上的鲤鱼、鲫鱼的相应区段进行了序列比较。同时检测了两种类型黄金鲫肌肉的GPI和LDH同工酶。以期为黄金鲫的种质鉴定以及鲤、鲫鱼遗传育种工作提供依据。
1材料与方法
1.1试验鱼
于2013年11月从天津市某鱼类养殖场采集3尾全鳞型黄金鲫以及3尾线鳞型黄金鲫（图1、表1）。鲜活状态下剪取大小约1.0 cm×0.5 cm的鳍条用于DNA提取，-20 ℃冷冻保存鱼体用于同工酶的检测。
1.2DNA的提取、mtDNA D-loop及邻近区段PCR扩增
用苯酚-氯仿抽提法从鳍条提取总基因组DNA，4 ℃下保存备用[15]。以提取的DNA为模板，使用L15923和H1067引物对每尾试验鱼的mtDNA D-loop及其邻近区段进行扩增，两个引物的结合位点分别位于tRNAThr和12S rRNA 编码区上。将PCR产物委托深圳华大基因科技有限公司纯化并测序，得到的序列依据峰图进行确认[9]。
1.3DNA序列分析
使用MEGA6.0软件对6个黄金鲫序列、GenBank上的3个鲤鱼序列（KC292935、KC292936和X61010.1）和3个鲫鱼序列（KC292946、KC292947和KC292948）进行比对分析，计算6尾黄金鲫与鲤鱼、鲫鱼的遗传距，构建NJ树[16]。
1.4同工酶电泳
使用水平式淀粉凝胶电泳法（缓冲液为C-APM）检测试验鱼背部肌肉的葡萄糖磷酸异构酶（GPI）和乳酸脱氢酶（LDH），并与鲤、鲫对照。电泳及染色同鲍迪等采用的方法[14]。
2结果
2.1mtDNA D-loop 及其邻近区段的PCR扩增
对6尾黄金鲫的mtDNA D-loop及其邻近区段进行PCR扩增，经1%的琼脂糖凝胶电泳均得到长度大约为1600bp的DNA片段（图2）。
2.2黄金鲫序列与GenBank中的鲤鱼序列（KC292936）的比较
PCR产物经纯化、测序、峰图确认，获得了碱基排列顺序清晰的1348bp-1351 bp 的片段。与GenBank中的鲤鱼序列（KC292936）进行BLAST比对，有碱基插入现象，所得片段位于KC292936中的100至1447之间，包含部分tRNAThr、全部D-loop和部分tRNAPhe。6尾黄金鲫中1号和3号为1种单倍型、片段长度为1351bp，2号为1种单倍型、片段长度为1348bp，4号、5号和6号为1种单倍型、片段长度为1349bp（表2）。
2.3黄金鲫与鲤、鲫的遗传距离和系统树
使用MEGA6.0对6尾黄金鲫和GenBank上的3个鲤鱼序列和3个鲫鱼序列进行分析。6尾黄金鲫个体间、鲤鱼3个序列间和鲫鱼3个序列间的遗传距分别为0.006、0.018和0.001。3尾全鳞型黄金鲫与3尾线鳞型黄金鲫、鲤及鲫的遗传距分别为0.009、0.012和0.094，3尾线鳞型黄金鲫与鲤、鲫的遗传距分别为0.010和0.096，鲤、鲫之间的遗传距为0.097。12个序列间的NJ树见图3。
2.4同工酶
同工酶电泳分析结果表明全鳞型、线鳞型的GPI和LDH两种同工酶均由来自于鲤、鲫双方的遗传物质所支配（图4）。
3讨论 3.1线鳞型黄金鲫父母本的推测
线粒体DNA（mtDNA）为母性遗传，其一些区段的RFLP或碱基序列可以用于物种的遗传多样性分析，也可以作为DNA条形码进行物种鉴定[4-11]。本研究中得到的包含部分tRNAThr、全部D-loop和部分tRNAPhe 的DNA片段，3尾全鳞型黄金鲫与3尾线鳞型黄金鲫之间的遗传距为0.009，3尾全鳞型黄金鲫和3尾线鳞型黄金鲫与GenBank中3个鲤鱼序列的遗传距分别为0.012和0.010，均小于2%，符合种内遗传特征[7-8，10]。由此可以认为无论是全鳞型黄金鲫还是线鳞型黄金鲫，其母本均为鲤鱼。同工酶是杂交种鉴别的有效手段之一[11-14]。全鳞型黄金鲫和线鳞型黄金鲫的葡萄糖磷酸变位酶（GPI）和乳酸脱氢酶（LDH）均具有鲤鲫双方的遗传物质，符合鲤鲫杂交种的特性[11-12，14]。
3.2线鳞型黄金鲫鳞被基因型的推测
鲤鱼鳞被是由S-s和N-n两对基因控制，可分为四种类型，分别为鳞鲤（全鳞）（S-nn）、线鳞镜鲤（S-Nn）、散鳞镜鲤（ssnn）和革鲤（ssNn），NN个体不能存活[3-4]。欧鲫、丁鱥和鲤鱼具有位于同源染色体上的同源基因，欧鲫与革鲤的杂交的子代中几乎一半是全鳞型、一半是线鳞型，线鳞型鲤鲫杂种外形颇似线鳞镜鲤[3]。由于鲤鱼中NN个体不能存活，所以推测本研究中线鳞型黄金鲫母本鳞被的基因型应为SSNn、SsNn或ssNn，这样的母本与红鲫杂交，理论上一半子代应为全鳞型个体（SSnn或Ssnn）、另一半应为线鳞型个体（SSNn或SsNn）。
参考文献：
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[9] 郝君，杨蔷，鲍迪，等.6种鱼mtDNA D-loop及其邻近区段的序列比较分析[J].大连海洋大学学报，2013，28（2）：160-165
[10] 张大莉，董仕，白俊杰，等.大口黑鲈北方亚种和佛罗里达亚种mtDNACOⅠ序列的分析[J].大连海洋大学学报，2014，29（3）：212-216
[11] Dong S， Taniguchi N.Allozyme， morphology and growth autotriploids and allotriploids in common carp[J].Suisanzoshoku，1993，41（1）：35-43
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[16] Tamura K，Stecher G，Peterson D，et al.MEGA6：molecular evolutionary genetics analysis version 6.0[J].Molecular Biology and Evolution，2013，30（12） ：2725-2729
（收稿日期：2015-05-26）