【摘 要】
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【背景】猪繁殖和呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus， PRRSV）可以造成怀孕母猪的繁殖障碍及仔猪的呼吸系统疾病，近年来，NADC30-Like谱系PRRSV已成为国内的优势流行毒株。【目的】研制针对NADC30-Like谱系PRRSV的病毒样颗粒（VLPs）疫苗。【方法】将PRRSV NADC30-Like毒株的
【基金项目】
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国家重点研发计划（2018YFD0500104，2018YFD0500803）；
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【背景】猪繁殖和呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus， PRRSV）可以造成怀孕母猪的繁殖障碍及仔猪的呼吸系统疾病，近年来，NADC30-Like谱系PRRSV已成为国内的优势流行毒株。【目的】研制针对NADC30-Like谱系PRRSV的病毒样颗粒（VLPs）疫苗。【方法】将PRRSV NADC30-Like毒株的ORF5（编码GP5蛋白）、ORF6（编码M蛋白）分别连接至pFastBacTM Dual载体P10和PH启动子下游多克隆位点，获得穿梭质粒pFB-30-ORF5及pFB-30-ORF6，酶切鉴定后，将ORF6基因插入到穿梭质粒pFB-30-ORF5 PH启动子下游，构建穿梭质粒pFB-30-ORF5-OPF6。将上述三种穿梭质粒分别转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，通过蓝白斑筛选及PCR鉴定重组杆粒。再将获得的重组杆粒转染至Sf9 昆虫细胞，发现细胞病变后收获病毒液，继续盲传三代，在透射电镜下观察是否有病毒样颗粒。用第三代病毒液感染Sf9细胞后，分别用GP5蛋白、His-tag、Flag-tag单克隆抗体作为一抗，通过免疫电镜、间接免疫荧光、Western blot鉴定重组蛋白。【结果】成功构建了3种穿梭质粒pFB-30-ORF5、pFB-30-ORF6和pFB-30-ORF5-OPF6，酶切鉴定正确。通过蓝白斑筛选及PCR验证后获得重组杆粒，分别命名为Bacmind-30-ORF5、Bacmind-30-ORF6和Bacmind-30-ORF5-ORF6。重组杆粒感染Sf9细胞120h时出现明显的细胞病变，收获病毒液后，在透射电子显微镜可观察到大小为50 nm左右呈现球形结构的VLPs。免疫电镜可以观察到胶体金颗粒结合在VLPs周围；IFA结果显示实验组均出现了明显绿色的特异性荧光灶；Western blot结果表明，3种VLPs均出现特异性条带，并与预期大小一致。【结论】制备了3种NADC30-Like谱系PRRSV的病毒样颗粒，为针对PRRSV新谱系流行株疫苗的研发奠定了基础。
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