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摘要：为了有效而简便地对鱼类等水产品进行新鲜程度的评价，提出通过挥发胺/氧化三甲胺摩尔比值对大菱鲆的新鲜程度进行测定，验证此比值作为评价大菱鲆新鲜度指标的可行性。结果表明，单一的三甲胺（TMA）和氧化三甲胺（TMAO）很难准确地评价大菱鲆的新鲜程度；二甲胺（DMA）和甲醛（FA）是大菱鲆冻藏阶段的腐败产物，因而不能对各个贮藏阶段下的大菱鲆进行品质评价；挥发性盐基氮（TVB-N）在评价冷冻鱼品质时敏感度变差；菌落总数（TVC）很难反映冷冻贮藏样品的真实鲜度；参照感官评定，在3个贮藏条件下，当挥发胺/氧化三甲胺摩尔比值大于0.81时，大菱鲆就超出了安全食用范围。
关键词：大菱鲆；新鲜度；挥发胺/氧化三甲胺摩尔比值；挥发性盐基氮；菌落总数
中图分类号： S984.1文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）09-0297-05
随着物质生活水平的不断提高，人们对水产品的消费逐渐趋向于新鲜、卫生、安全。目前，我国的水产品大多以鲜活销售、冷藏或冷冻形式储藏。在常温和冷藏条件下，微生物通常是鱼体腐败的主要因素，TMAO通过微生物中的氧化三甲胺还原酶的作用还原为TMA[1]，除此之外，鱼体中的卵磷脂也可转变为TMA[2]。低温冷冻是一种常见的保藏方法，通常用来控制或减缓鱼肉的腐败进程。冷冻条件下，除了极少部分微生物作用于鱼产品外，TMAO还会被TMAOase分解为等量的DMA和FA[3]，这就造成了冷冻条件下鱼产品不同于冷藏条件的腐败机制，然而如何有效而快速地评价水产品的新鲜程度是目前迫切需要解决的问题，沿用传统的评价方法不一定能准确而快速的判断其真正的新鲜程度。无论在何种贮藏条件下，鱼体中具有鲜味特征的TMAO均在鱼体死亡后转变为具有腐败特征的挥发胺，有研究提出将鱼体中具有腐败特征的挥发胺与鲜味特征的TMAO构成比例来对鱼产品进行新鲜程度的评价[4-5]。
大菱鲆（Scophthalmus maximus）属于蝶形目鲆科，在中国称“多宝鱼”，原产于欧洲大西洋海域，是名贵的低温经济鱼类。应用挥发胺/氧化三甲胺摩尔比值对大菱鲆进行鲜度检测还未见报道，本研究以大菱鲆作为试验对象，分别将0、5 ℃作为冷藏条件，30 ℃作为常温条件，-18 ℃作为冷冻条件，分别模拟冷藏、常温和冷冻贮藏过程，将挥发胺/氧化三甲胺摩尔比值分成TMA/TMAO摩尔比值和（TMA DMA）/TMAO摩尔比值2种形式，分别对冷藏常温贮藏条件下的样品和冷冻保藏的样品进行品质评价，研究鱼肉中TMA/TMAO摩尔比值和（TMA DMA）/TMAO摩尔比值在贮藏过程中的变化规律；同时对样品中的TMAO、TMA、DMA、FA、TVB-N和TVC进行检测，分析各指标作为大菱鲆鲜度评价指标的可行性。
1材料与方法
1.1试验材料
大菱鲆采购于本地农贸市场，尾质量为（0.5±0.2） kg。
1.2贮藏试验
将样品活鱼用冰水致休克后，再击头致死。根据贮藏条件的不同将样品鱼分成4组，第1组将样品鱼放入带有漏水孔的泡沫箱中，泡沫箱中为层鱼层冰结构，再将泡沫箱放入 3 ℃ 的培养箱中，适时换冰，此为0 ℃；第2组放入5 ℃冰箱冷藏室中；第3组放置在温度为30 ℃的恒温培养箱内，作为常温条件；最后1组将样品放入-18 ℃的冰箱冷冻室内中贮藏，作为冷冻环境。
1.3样品处理
按照SC/T 3016—2004《水产品抽样方法》中方法[6]取样，除去鱼鳞、鱼皮，取背部和腹部肌肉，将鱼肉绞碎后，称量并分装进经杀菌后的自封袋中，定时取出，对样品中的各项指标进行测定。留出整鱼进行感官评定。每次检测做3个平行试验，取其平均值。
1.4试验仪器与设备
DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器（河南巩义市予华仪器公司）；LD4-2型低速离心机（北京医用离心机厂）；PHS-25CW微机型pH/mV；UV-2012PC型紫外可见分光光度计[尤尼柯（上海）仪器有限公司]；SPX-250B-Z型生化培养箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；LRH-250A生化培养箱（广东省医疗器械厂）；ZFD-A5040A型全自动新型鼓风干燥箱（上海智城分析仪器制造有限公司）；JJ200型电子天平（江苏省常熟市双杰测试仪器厂）；半微量凯氏定氮蒸馏器；冰箱。
1.5测定方法
1.5.1感官评价由7名感官评定人员进行感官评价试验，冷藏和常温条件下的感官评定方法参照崔正翠等的感官评定标准[7]并稍作修改，具体的评定标准见表1；冷冻条件下，样品从-18 ℃冷冻环境内取出，立即放入5 ℃的冷藏环境内解冻后，再进行感官评定，感官评分标准见表2[8]。表1冷藏和常温鱼类感官评价标准
指标一级新鲜（E）二级新鲜（A）货架期（B）腐败中期（C）体表黏液透明，体色鲜艳黏液乳白色，体色轻微消失黏液稍发暗，体表无光泽黏液不透明，体色消失很严重气味
较强的海腥味，蒸后有明显清香味很弱的海腥味，蒸后有轻微清香味轻微的酸臭和腐败味，蒸后有轻微异味很重的酸臭和腐臭味，蒸后有明显的异味鳃
鲜红色，没有异味，鳃丝完全分离暗红色，没有异味，鳃丝黏附在一起稍白色，鱼腥气，鳃丝粘附在一起黄灰色，较强的氨臭味，鳃丝完全粘附肌肉
处于僵硬期或其部分消失，蒸后肉质紧致白嫩坚硬，有弹性，压痕完全迅速消失，蒸后肉质弹性稍差弹性显著减弱，有机械印痕，然后肉有糜感，肉色较暗由于外力影响有较重的形变，蒸后肉质松软糜烂，色泽偏黄肉味较强的海腥味很弱的海腥味轻微的酸和腐臭味较重的酸和腐臭味
1.5.2TVB-N值的测定参照水产行业标准SC/T 3032—2007《水产品中挥发性盐基氮的测定》。
1.5.3菌落总数的测定参照GB 4789.2—2010《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》。 1.5.4TMA/TMAO摩尔比值的测定应用苦味酸比色法对大菱鲆鱼肉中的TMA和TMAO同时进行测定，该方法依靠Fe-EDTA将样品中的TMAO全部还原成TMA，此时，被还原的样品中包含固有的TMA和TMAO还原的TMA两部分，样品中TMAO含量是由TMA总量与样品中原有的TMA的量的差值换算得出。因此，该方法在测定样品TMAO的同时也将TMA含量同时测出。具体方法参照李丰所用方法[9]并稍作修改。本研究提出的TMA/TMAO摩尔比值表达式如下：TMA/TMAO摩尔比值=n（TMA）/n（TMAO）。式中：n（TMA） 为1 g样品中所含三甲胺物质的量，单位为mol；n（TMAO） 为1 g样品中所含氧化三甲胺物质的量，单位为mol。
1.5.5（TMA DMA）/TMAO摩尔比值的测定采用比色法对大菱鲆鱼肉中的DMA含量进行测定，本研究提出的（TMA DMA）/TMAO摩尔比值公式表达式为：（TMA DMA）/TMAO摩尔比值=[n（TMA） n（DMA）]/n（TMAO）。式中：n（TMA）为1 g样品中所含三甲胺物质的量，单位为mol；n（DMA）为1 g样品中所含二甲胺物质的量，单位为mol；n（TMAO）为1 g样品中所含氧化三甲胺物质的量，单位为mol。
2结果与分析
2.1冷藏和常温条件下大菱鲆各项指标的分析
2.1.1冷藏和常温条件下大菱鲆随贮藏时间的感官变化由表3可知，新鲜的大菱鲆鱼体僵直、完整、无破肚，具有鲜鱼固有色泽并且肉质紧密。大菱鲆在0 ℃和5 ℃贮藏条件下，分别在贮藏192、48 h到达二级新鲜，影响感官评价的因素主要是鱼鳃的颜色和气味的变化；分别在贮藏288、120 h时开始腐败，此时为大菱鲆的货架期，从此时起2个贮藏温度下的样品腐败速度加快；分别在贮藏336、144 h时进入腐败中期。崔正翠等也曾对大菱鲆贮藏过程中的感官变化进行评价，得出鱼鳃为感官评价走低的主因[7]。
较高的贮藏温度有利于微生物的繁殖与生长，造成生鲜鱼类在常温条件下迅速发生腐败。由表4可知，在常温条件下，大菱鲆初始阶段感官评定为一级新鲜；大菱鲆贮存6 h到达二级新鲜，鱼体开始出现腐败的气味；贮存10 h时到达货架期，到达货架期时的大菱鲆出现较明显的腐败气味。
2.1.2冷藏和常温条件下大菱鲆TMA和TMAO随贮藏时间的变化从图1可以看出，在3个温度条件下TMA含量在贮藏过程中整体上呈持续上升的趋势。鲜活的大菱鲆鱼肉中表3冷藏条件下大菱鲆的感官评价结果
评价项目5 ℃0 ℃0 h24 h48 h72 h96 h120 h144 h192 h240 h288 h336 h体表EEAAABCAABC气味EAAABBCAABC鳃EAABBBCABBC肌肉EEAAABCABBC肉味EAAABBCAABC
表4常温条件下大菱鲆的感官评价结果
评价项目评价结果 0 h2 h4 h6 h8 h10 h12 h体表EEAABBC气味EAAABBC鳃EEAABBC肌肉EEEAABC肉味EAAABBC
TMA含量为0。感官评价0、5、30 ℃贮藏条件下大菱鲆达到二级新鲜终点时TMA含量分别达到0.018、0.044、0.050 mg/g；感官评价0、5、30 ℃贮藏条件下大菱鲆达到货架期时TMA含量分别达到0.057、0.082、0.069 mg/g。因此可利用TMA稳定变化的趋势对大菱鲆进行腐败程度的评价，但是仅凭单一的TMA指标只能了解到大菱鲆的腐败趋势，而不能确切地知道大菱鲆在任意时刻的新鲜程度。
由图2所示，随着贮藏时间延长，30 ℃贮藏条件下的TMAO比0 、5 ℃条件下分解速度快，这是因为某些微生物的活性随贮藏温度的降低而被抑制，从而导致较低温度下TMAO的分解代谢速度下降。在3个贮藏温度下，TMAO含量下降的过程中分别也出现了回升的现象，这可能是因为大菱鲆的体内同样存在着一条TMAO合成路径。感官评价0、5、30 ℃贮藏条件下大菱鲆达到二级新鲜终点时TMAO含量分别达到0.076、0.072、0.110 mg/g；感官评价0、5、30 ℃贮藏条件下大菱鲆达到货架期时TMAO含量分别达到0.050、0070、0.078 mg/g。因为在不同温度条件下的货架期时测得的TMAO含量变化范围较大，因此可以看出仅由TMAO测定值的大小很难对大菱鲆进行鲜度评价。
2.1.3冷藏和常温条件下大菱鲆TMA/TMAO摩尔比值随贮藏时间的变化大菱鲆在0、5、30 ℃贮藏条件下，随着贮藏时间延长，TMA/TMAO摩尔比值呈持续的上升状态（图3）；TMA/TMAO摩尔比值分别在0.70、0.77、0.58时，感官评价为到达二级新鲜；比值分别在1.14、1.48、1.12时，感官评价
到达货架期，这3个点为贮藏过程中比值的拐点。比值在货架期所测得的数值均大于1.12，由此可以看出在常温和冷藏条件下，当大菱鲆中比值小于1.12的时候为安全食用范围，并且其比值越小，大菱鲆就越新鲜。
2.1.4冷藏和常温条件下大菱鲆TVB-N测定值的分析在0、5 ℃温度条件下，贮藏前期TVB-N含量呈平稳上升趋势。因此，TVB-N常作为评价鱼产品的腐败指标[10]。由图4所示，在0、5、30 ℃贮藏条件下，大菱鲆二级新鲜时的TVB-N分别是16.42、16.53、14.69 mg/100 g，货架期时的TVB-N含量分别为20.47、20.07、25.99 mg/100 g。根据GB/T 18108—2008《鲜海水鱼》，海水鱼类的TVB-N值不得超过 30 mg/100 g，本试验所得货架期终点TVB-N结果未超出界限值，并且此判定结果与感官评定结果相一致。
2.1.5冷藏和常温条件下大菱鲆TVC测定值的分析通常冷藏温度下贮藏水产品腐败由微生物的污染引起，而温度和贮藏时间又是影响腐败微生物生长的主要因素。因此，菌落总数（TVC）常被用来判定食品被污染程度，是食品卫生指示性指标。如图5所示，在5、30 ℃贮藏条件下，微生物的生长没有明显的延滞期，而是直接进入了对数期，这是因为较高的温度可以促进细菌生长繁殖。2个贮藏条件下的初始菌落总数不同，这是由鱼类的生存环境和捕捞方式的差异造成的。由冷藏和常温条件下TVC的稳定变化趋势可知，TVC可以表征该条件下大菱鲆被微生物污染的程度。 2.2冷冻条件下大菱鲆各项指标的分析
2.2.1冷冻条件下大菱鲆随贮藏时间的感官变化与常温和冷藏保存阶段不同，肌肉品质是样品冷冻阶段发生品质变化的主要因素，鲜活状态的大菱鲆鱼肉柔韧有弹性，随着冷冻时间延长，鱼肉品质逐渐下降，鱼肉弹性下降，肉质出现糜感，鱼肉出现脱水现象，这是由多方面原因引起的：首先，冷冻状况下鱼肉中的水分形成冰晶，分布在鱼肉组织的细胞内或细胞间，冰晶的存在造成了细胞壁的物理性损伤，导致细胞原生质外溢，细胞变形，从而造成鱼肉肌肉品质的下降；其次，冰晶的形成破坏了结合水和蛋白质分子的结合态，并且冰晶间的相互挤压破坏了部分化学键，部分化学键又发生重组，因此蛋白质分子内的化学键的断裂与重组导致蛋白变性[11-14]；最后，鱼类体内所存在的TMAOase催化TMAO生成DMA与FA，醛化引起的蛋白质分子的交联作用也可引起蛋白质变性。同冷藏和常温贮藏条件一样，冷冻条件下大菱鲆鱼鳃变化最为明显，颜色逐渐加深。当样品贮存到7 d时，感官评定为二级新鲜；贮藏到105 d时，感官评定为货架期；当大菱鲆贮藏期为165 d时，感官评定为腐败中期（表5）。
表5冷冻条件下大菱鲆的感官评价结果
评价
指标感官评价结果0 d4 d7 d14 d21 d28 d45 d75 d105 d135 d165 d体表EAAAAAAABBC肌肉EEAAAABBBCC眼睛EEAAAAAABCC鳃EAAAABBBBCC气味EEAAAAABBBC
2.2.2冷冻条件下大菱鲆TMA随贮藏时间的变化大菱鲆在冷冻条件下TMA含量水平变化幅度较冷藏和常温下变化幅度变小，贮藏初期TMA的增长速度较快；之后TMA含量变化缓慢，并且该条件下货架期时所测得的TMA含量为 0.033 mg/g（图6），这与冷藏条件下的测得值相比差别较大。由于冷冻条件下肌肉品质等其他因素主导着鱼类的品质，使TMA作为冷冻大菱鲆的腐败指标较不灵敏，因此在冷冻条件下TMA很难对大菱鲆的品质做出评价。
2.2.3冷冻条件下大菱鲆TMAO、DMA和FA随贮藏时间的变化在冷冻过程中，大菱鲆TMAO含量水平整体呈下降趋势（图7），与常温和冷藏条件相同，在大菱鲆冷冻条件下TMAO在下降的过程中同样出现了回升的现象。因此单一应用TMAO指标很难对大菱鲆进行鲜度评价。由图7还可以看出，FA和DMA存在着相类似的变化趋势，冷冻条件下大菱鲆的FA和DMA含量大体上呈上升趋势，可以作为评价冷冻大菱鲆腐败程度的指标。但是，FA和DMA是冷冻条件下的腐败成分，这就决定了应用FA和DMA作为大菱鲆新鲜程度的局限性。
2.2.4冷冻条件下大菱鲆（TMA DMA）/TMAO摩尔比值随贮藏时间的变化同样的，和冷藏贮藏条件比较，冷冻贮藏条件下大菱鲆没有在腐败中期出现明显的拐点，这是因为低温条件下样品的腐败过程变得更加缓慢。（TMA DMA）/TMAO摩尔比值在前20 d内增长较为快速（图8），比值为049时，感观评价为二级新鲜；比值为1.02时，感观评价到达货架期；比值在1.40时，感官评价为腐败中期。冷冻大菱鲆的（TMA DMA）/TMAO摩尔比值随贮藏时间延长逐渐增大，在货架期所测得的比值为0.81，因此当比值小于0.81时为安全食用范围，并且在安全食用范围之内比值越小，大菱鲆就越新鲜。
2.2.5冷冻条件下大菱鲆TVB-N测定值的分析冷冻条件下大菱鲆中的TVB-N含量随时间延长逐渐增加并且30 d后TVB-N变化趋于平稳（图9）。与较高温度条件下贮藏样品产生恶臭而达到腐败中期不同，冷冻条件下鱼肉品质的变化不明显，本试验在腐败中期时所测得的大菱鲆中的TVB-N含量为21.14 mg/100 g，其仍然在GB 2733—2005《鲜、冻动物性水产品卫生标准》所划定的30 mg/100 g的安全范围之内，由此可看出应用TVB-N对于冷冻大菱鲆的新鲜程度评价有一定的局限性。
2.2.6冷冻条件下大菱鲆TVC测定值的分析冷冻条件下大菱鲆TVC值整体上呈下降趋势（图10），长时间的冷冻环境不能使样品达到完全灭菌效果，只是抑制了微生物的生理机能，并且冷冻之前新鲜状态的样品的TVC值比贮藏之后的要高。由此可以看出冷冻大菱鲆的新鲜程度绝大程度取决于冷冻之前，经过长时间冷冻样品的TVC值不能指示鱼类的真实鲜度。
3结论
大菱鲆中TMA和TMAO受到贮藏条件和样品差异性的影响，使不同贮藏条件下货架期时TMA和TMAO含量产生较大差异。如0、5、30 ℃贮藏条件下大菱鲆达到货架期时TMA
的含量分别达到0.057、0.082、0.069 mg/g，而冷冻条件下TMA的含量为0.033 mg/g；0、5、30 ℃贮藏条件下大菱鲆达到货架期时TMAO的含量分别达到0.05、0.07、0.078 mg/g，而冷冻条件下TMAO含量为0.07 mg/g，所以单一的TMA和TMAO很难准确评价大菱鲆的新鲜程度。由于DMA和FA是大菱鲆冻藏阶段的腐败产物，因此其不能为各个贮藏阶段下的大菱鲆进行品质评价。
大菱鲆冷藏和常温条件下的TMA/TMAO摩尔比值和冷冻（TMA DMA）/TMAO摩尔比值在贮藏过程中变化稳定，挥发胺/氧化三甲胺摩尔比值可以反映出样品中腐败成分TMA、DMA与鲜味成分TMAO物质的量的比例关系，从而避免了单一的TMAO、DMA和TMA只能对样品进行腐败趋势分析的局限性。在3个贮藏条件下，挥发胺/氧化三甲胺摩尔比值在货架期所测得的数值大于0.81，因此当大菱鲆中挥发胺/氧化三甲胺摩尔比值小于0.81时在安全食用范围，并且在安全食用范围之内摩尔比值越小，大菱鲆就越新鲜。
在冷藏和常温条件下大菱鲆鱼肉中的TVB-N和TVC变化趋势稳定，因此TVB-N和TVC适用于该条件下的品质评价；但是在冷冻条件下TVB-N的变化较为缓慢，以至于TVB-N在评价冷冻鱼品质时敏感度变差，同时TVC在贮藏过程中逐渐减少，导致TVC很难反映冷冻贮藏样品的真实鲜度。 分析以上结果可知，挥发胺/氧化三甲胺摩尔比值可以作为判定大菱鲆新鲜度的指标。但是，要使挥发胺/氧化三甲胺摩尔比值能够作为检测大菱鲆以至于更多种水产品的鲜度指标，还需要大批量的、多种温度条件下的试验。
参考文献：
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关键词：大菱鲆；新鲜度；挥发胺/氧化三甲胺摩尔比值；挥发性盐基氮；菌落总数
中图分类号： S984.1文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）09-0297-05
随着物质生活水平的不断提高，人们对水产品的消费逐渐趋向于新鲜、卫生、安全。目前，我国的水产品大多以鲜活销售、冷藏或冷冻形式储藏。在常温和冷藏条件下，微生物通常是鱼体腐败的主要因素，TMAO通过微生物中的氧化三甲胺还原酶的作用还原为TMA[1]，除此之外，鱼体中的卵磷脂也可转变为TMA[2]。低温冷冻是一种常见的保藏方法，通常用来控制或减缓鱼肉的腐败进程。冷冻条件下，除了极少部分微生物作用于鱼产品外，TMAO还会被TMAOase分解为等量的DMA和FA[3]，这就造成了冷冻条件下鱼产品不同于冷藏条件的腐败机制，然而如何有效而快速地评价水产品的新鲜程度是目前迫切需要解决的问题，沿用传统的评价方法不一定能准确而快速的判断其真正的新鲜程度。无论在何种贮藏条件下，鱼体中具有鲜味特征的TMAO均在鱼体死亡后转变为具有腐败特征的挥发胺，有研究提出将鱼体中具有腐败特征的挥发胺与鲜味特征的TMAO构成比例来对鱼产品进行新鲜程度的评价[4-5]。
大菱鲆（Scophthalmus maximus）属于蝶形目鲆科，在中国称“多宝鱼”，原产于欧洲大西洋海域，是名贵的低温经济鱼类。应用挥发胺/氧化三甲胺摩尔比值对大菱鲆进行鲜度检测还未见报道，本研究以大菱鲆作为试验对象，分别将0、5 ℃作为冷藏条件，30 ℃作为常温条件，-18 ℃作为冷冻条件，分别模拟冷藏、常温和冷冻贮藏过程，将挥发胺/氧化三甲胺摩尔比值分成TMA/TMAO摩尔比值和（TMA DMA）/TMAO摩尔比值2种形式，分别对冷藏常温贮藏条件下的样品和冷冻保藏的样品进行品质评价，研究鱼肉中TMA/TMAO摩尔比值和（TMA DMA）/TMAO摩尔比值在贮藏过程中的变化规律；同时对样品中的TMAO、TMA、DMA、FA、TVB-N和TVC进行检测，分析各指标作为大菱鲆鲜度评价指标的可行性。
1材料与方法
1.1试验材料
大菱鲆采购于本地农贸市场，尾质量为（0.5±0.2） kg。
1.2贮藏试验
将样品活鱼用冰水致休克后，再击头致死。根据贮藏条件的不同将样品鱼分成4组，第1组将样品鱼放入带有漏水孔的泡沫箱中，泡沫箱中为层鱼层冰结构，再将泡沫箱放入 3 ℃ 的培养箱中，适时换冰，此为0 ℃；第2组放入5 ℃冰箱冷藏室中；第3组放置在温度为30 ℃的恒温培养箱内，作为常温条件；最后1组将样品放入-18 ℃的冰箱冷冻室内中贮藏，作为冷冻环境。
1.3样品处理
按照SC/T 3016—2004《水产品抽样方法》中方法[6]取样，除去鱼鳞、鱼皮，取背部和腹部肌肉，将鱼肉绞碎后，称量并分装进经杀菌后的自封袋中，定时取出，对样品中的各项指标进行测定。留出整鱼进行感官评定。每次检测做3个平行试验，取其平均值。
1.4试验仪器与设备
DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器（河南巩义市予华仪器公司）；LD4-2型低速离心机（北京医用离心机厂）；PHS-25CW微机型pH/mV；UV-2012PC型紫外可见分光光度计[尤尼柯（上海）仪器有限公司]；SPX-250B-Z型生化培养箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；LRH-250A生化培养箱（广东省医疗器械厂）；ZFD-A5040A型全自动新型鼓风干燥箱（上海智城分析仪器制造有限公司）；JJ200型电子天平（江苏省常熟市双杰测试仪器厂）；半微量凯氏定氮蒸馏器；冰箱。
1.5测定方法
1.5.1感官评价由7名感官评定人员进行感官评价试验，冷藏和常温条件下的感官评定方法参照崔正翠等的感官评定标准[7]并稍作修改，具体的评定标准见表1；冷冻条件下，样品从-18 ℃冷冻环境内取出，立即放入5 ℃的冷藏环境内解冻后，再进行感官评定，感官评分标准见表2[8]。表1冷藏和常温鱼类感官评价标准
指标一级新鲜（E）二级新鲜（A）货架期（B）腐败中期（C）体表黏液透明，体色鲜艳黏液乳白色，体色轻微消失黏液稍发暗，体表无光泽黏液不透明，体色消失很严重气味
较强的海腥味，蒸后有明显清香味很弱的海腥味，蒸后有轻微清香味轻微的酸臭和腐败味，蒸后有轻微异味很重的酸臭和腐臭味，蒸后有明显的异味鳃
鲜红色，没有异味，鳃丝完全分离暗红色，没有异味，鳃丝黏附在一起稍白色，鱼腥气，鳃丝粘附在一起黄灰色，较强的氨臭味，鳃丝完全粘附肌肉
处于僵硬期或其部分消失，蒸后肉质紧致白嫩坚硬，有弹性，压痕完全迅速消失，蒸后肉质弹性稍差弹性显著减弱，有机械印痕，然后肉有糜感，肉色较暗由于外力影响有较重的形变，蒸后肉质松软糜烂，色泽偏黄肉味较强的海腥味很弱的海腥味轻微的酸和腐臭味较重的酸和腐臭味
1.5.2TVB-N值的测定参照水产行业标准SC/T 3032—2007《水产品中挥发性盐基氮的测定》。
1.5.3菌落总数的测定参照GB 4789.2—2010《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》。 1.5.4TMA/TMAO摩尔比值的测定应用苦味酸比色法对大菱鲆鱼肉中的TMA和TMAO同时进行测定，该方法依靠Fe-EDTA将样品中的TMAO全部还原成TMA，此时，被还原的样品中包含固有的TMA和TMAO还原的TMA两部分，样品中TMAO含量是由TMA总量与样品中原有的TMA的量的差值换算得出。因此，该方法在测定样品TMAO的同时也将TMA含量同时测出。具体方法参照李丰所用方法[9]并稍作修改。本研究提出的TMA/TMAO摩尔比值表达式如下：TMA/TMAO摩尔比值=n（TMA）/n（TMAO）。式中：n（TMA） 为1 g样品中所含三甲胺物质的量，单位为mol；n（TMAO） 为1 g样品中所含氧化三甲胺物质的量，单位为mol。
1.5.5（TMA DMA）/TMAO摩尔比值的测定采用比色法对大菱鲆鱼肉中的DMA含量进行测定，本研究提出的（TMA DMA）/TMAO摩尔比值公式表达式为：（TMA DMA）/TMAO摩尔比值=[n（TMA） n（DMA）]/n（TMAO）。式中：n（TMA）为1 g样品中所含三甲胺物质的量，单位为mol；n（DMA）为1 g样品中所含二甲胺物质的量，单位为mol；n（TMAO）为1 g样品中所含氧化三甲胺物质的量，单位为mol。
2结果与分析
2.1冷藏和常温条件下大菱鲆各项指标的分析
2.1.1冷藏和常温条件下大菱鲆随贮藏时间的感官变化由表3可知，新鲜的大菱鲆鱼体僵直、完整、无破肚，具有鲜鱼固有色泽并且肉质紧密。大菱鲆在0 ℃和5 ℃贮藏条件下，分别在贮藏192、48 h到达二级新鲜，影响感官评价的因素主要是鱼鳃的颜色和气味的变化；分别在贮藏288、120 h时开始腐败，此时为大菱鲆的货架期，从此时起2个贮藏温度下的样品腐败速度加快；分别在贮藏336、144 h时进入腐败中期。崔正翠等也曾对大菱鲆贮藏过程中的感官变化进行评价，得出鱼鳃为感官评价走低的主因[7]。
较高的贮藏温度有利于微生物的繁殖与生长，造成生鲜鱼类在常温条件下迅速发生腐败。由表4可知，在常温条件下，大菱鲆初始阶段感官评定为一级新鲜；大菱鲆贮存6 h到达二级新鲜，鱼体开始出现腐败的气味；贮存10 h时到达货架期，到达货架期时的大菱鲆出现较明显的腐败气味。
2.1.2冷藏和常温条件下大菱鲆TMA和TMAO随贮藏时间的变化从图1可以看出，在3个温度条件下TMA含量在贮藏过程中整体上呈持续上升的趋势。鲜活的大菱鲆鱼肉中表3冷藏条件下大菱鲆的感官评价结果
评价项目5 ℃0 ℃0 h24 h48 h72 h96 h120 h144 h192 h240 h288 h336 h体表EEAAABCAABC气味EAAABBCAABC鳃EAABBBCABBC肌肉EEAAABCABBC肉味EAAABBCAABC
表4常温条件下大菱鲆的感官评价结果
评价项目评价结果 0 h2 h4 h6 h8 h10 h12 h体表EEAABBC气味EAAABBC鳃EEAABBC肌肉EEEAABC肉味EAAABBC
TMA含量为0。感官评价0、5、30 ℃贮藏条件下大菱鲆达到二级新鲜终点时TMA含量分别达到0.018、0.044、0.050 mg/g；感官评价0、5、30 ℃贮藏条件下大菱鲆达到货架期时TMA含量分别达到0.057、0.082、0.069 mg/g。因此可利用TMA稳定变化的趋势对大菱鲆进行腐败程度的评价，但是仅凭单一的TMA指标只能了解到大菱鲆的腐败趋势，而不能确切地知道大菱鲆在任意时刻的新鲜程度。
由图2所示，随着贮藏时间延长，30 ℃贮藏条件下的TMAO比0 、5 ℃条件下分解速度快，这是因为某些微生物的活性随贮藏温度的降低而被抑制，从而导致较低温度下TMAO的分解代谢速度下降。在3个贮藏温度下，TMAO含量下降的过程中分别也出现了回升的现象，这可能是因为大菱鲆的体内同样存在着一条TMAO合成路径。感官评价0、5、30 ℃贮藏条件下大菱鲆达到二级新鲜终点时TMAO含量分别达到0.076、0.072、0.110 mg/g；感官评价0、5、30 ℃贮藏条件下大菱鲆达到货架期时TMAO含量分别达到0.050、0070、0.078 mg/g。因为在不同温度条件下的货架期时测得的TMAO含量变化范围较大，因此可以看出仅由TMAO测定值的大小很难对大菱鲆进行鲜度评价。
2.1.3冷藏和常温条件下大菱鲆TMA/TMAO摩尔比值随贮藏时间的变化大菱鲆在0、5、30 ℃贮藏条件下，随着贮藏时间延长，TMA/TMAO摩尔比值呈持续的上升状态（图3）；TMA/TMAO摩尔比值分别在0.70、0.77、0.58时，感官评价为到达二级新鲜；比值分别在1.14、1.48、1.12时，感官评价
到达货架期，这3个点为贮藏过程中比值的拐点。比值在货架期所测得的数值均大于1.12，由此可以看出在常温和冷藏条件下，当大菱鲆中比值小于1.12的时候为安全食用范围，并且其比值越小，大菱鲆就越新鲜。
2.1.4冷藏和常温条件下大菱鲆TVB-N测定值的分析在0、5 ℃温度条件下，贮藏前期TVB-N含量呈平稳上升趋势。因此，TVB-N常作为评价鱼产品的腐败指标[10]。由图4所示，在0、5、30 ℃贮藏条件下，大菱鲆二级新鲜时的TVB-N分别是16.42、16.53、14.69 mg/100 g，货架期时的TVB-N含量分别为20.47、20.07、25.99 mg/100 g。根据GB/T 18108—2008《鲜海水鱼》，海水鱼类的TVB-N值不得超过 30 mg/100 g，本试验所得货架期终点TVB-N结果未超出界限值，并且此判定结果与感官评定结果相一致。
2.1.5冷藏和常温条件下大菱鲆TVC测定值的分析通常冷藏温度下贮藏水产品腐败由微生物的污染引起，而温度和贮藏时间又是影响腐败微生物生长的主要因素。因此，菌落总数（TVC）常被用来判定食品被污染程度，是食品卫生指示性指标。如图5所示，在5、30 ℃贮藏条件下，微生物的生长没有明显的延滞期，而是直接进入了对数期，这是因为较高的温度可以促进细菌生长繁殖。2个贮藏条件下的初始菌落总数不同，这是由鱼类的生存环境和捕捞方式的差异造成的。由冷藏和常温条件下TVC的稳定变化趋势可知，TVC可以表征该条件下大菱鲆被微生物污染的程度。 2.2冷冻条件下大菱鲆各项指标的分析
2.2.1冷冻条件下大菱鲆随贮藏时间的感官变化与常温和冷藏保存阶段不同，肌肉品质是样品冷冻阶段发生品质变化的主要因素，鲜活状态的大菱鲆鱼肉柔韧有弹性，随着冷冻时间延长，鱼肉品质逐渐下降，鱼肉弹性下降，肉质出现糜感，鱼肉出现脱水现象，这是由多方面原因引起的：首先，冷冻状况下鱼肉中的水分形成冰晶，分布在鱼肉组织的细胞内或细胞间，冰晶的存在造成了细胞壁的物理性损伤，导致细胞原生质外溢，细胞变形，从而造成鱼肉肌肉品质的下降；其次，冰晶的形成破坏了结合水和蛋白质分子的结合态，并且冰晶间的相互挤压破坏了部分化学键，部分化学键又发生重组，因此蛋白质分子内的化学键的断裂与重组导致蛋白变性[11-14]；最后，鱼类体内所存在的TMAOase催化TMAO生成DMA与FA，醛化引起的蛋白质分子的交联作用也可引起蛋白质变性。同冷藏和常温贮藏条件一样，冷冻条件下大菱鲆鱼鳃变化最为明显，颜色逐渐加深。当样品贮存到7 d时，感官评定为二级新鲜；贮藏到105 d时，感官评定为货架期；当大菱鲆贮藏期为165 d时，感官评定为腐败中期（表5）。
表5冷冻条件下大菱鲆的感官评价结果
评价
指标感官评价结果0 d4 d7 d14 d21 d28 d45 d75 d105 d135 d165 d体表EAAAAAAABBC肌肉EEAAAABBBCC眼睛EEAAAAAABCC鳃EAAAABBBBCC气味EEAAAAABBBC
2.2.2冷冻条件下大菱鲆TMA随贮藏时间的变化大菱鲆在冷冻条件下TMA含量水平变化幅度较冷藏和常温下变化幅度变小，贮藏初期TMA的增长速度较快；之后TMA含量变化缓慢，并且该条件下货架期时所测得的TMA含量为 0.033 mg/g（图6），这与冷藏条件下的测得值相比差别较大。由于冷冻条件下肌肉品质等其他因素主导着鱼类的品质，使TMA作为冷冻大菱鲆的腐败指标较不灵敏，因此在冷冻条件下TMA很难对大菱鲆的品质做出评价。
2.2.3冷冻条件下大菱鲆TMAO、DMA和FA随贮藏时间的变化在冷冻过程中，大菱鲆TMAO含量水平整体呈下降趋势（图7），与常温和冷藏条件相同，在大菱鲆冷冻条件下TMAO在下降的过程中同样出现了回升的现象。因此单一应用TMAO指标很难对大菱鲆进行鲜度评价。由图7还可以看出，FA和DMA存在着相类似的变化趋势，冷冻条件下大菱鲆的FA和DMA含量大体上呈上升趋势，可以作为评价冷冻大菱鲆腐败程度的指标。但是，FA和DMA是冷冻条件下的腐败成分，这就决定了应用FA和DMA作为大菱鲆新鲜程度的局限性。
2.2.4冷冻条件下大菱鲆（TMA DMA）/TMAO摩尔比值随贮藏时间的变化同样的，和冷藏贮藏条件比较，冷冻贮藏条件下大菱鲆没有在腐败中期出现明显的拐点，这是因为低温条件下样品的腐败过程变得更加缓慢。（TMA DMA）/TMAO摩尔比值在前20 d内增长较为快速（图8），比值为049时，感观评价为二级新鲜；比值为1.02时，感观评价到达货架期；比值在1.40时，感官评价为腐败中期。冷冻大菱鲆的（TMA DMA）/TMAO摩尔比值随贮藏时间延长逐渐增大，在货架期所测得的比值为0.81，因此当比值小于0.81时为安全食用范围，并且在安全食用范围之内比值越小，大菱鲆就越新鲜。
2.2.5冷冻条件下大菱鲆TVB-N测定值的分析冷冻条件下大菱鲆中的TVB-N含量随时间延长逐渐增加并且30 d后TVB-N变化趋于平稳（图9）。与较高温度条件下贮藏样品产生恶臭而达到腐败中期不同，冷冻条件下鱼肉品质的变化不明显，本试验在腐败中期时所测得的大菱鲆中的TVB-N含量为21.14 mg/100 g，其仍然在GB 2733—2005《鲜、冻动物性水产品卫生标准》所划定的30 mg/100 g的安全范围之内，由此可看出应用TVB-N对于冷冻大菱鲆的新鲜程度评价有一定的局限性。
2.2.6冷冻条件下大菱鲆TVC测定值的分析冷冻条件下大菱鲆TVC值整体上呈下降趋势（图10），长时间的冷冻环境不能使样品达到完全灭菌效果，只是抑制了微生物的生理机能，并且冷冻之前新鲜状态的样品的TVC值比贮藏之后的要高。由此可以看出冷冻大菱鲆的新鲜程度绝大程度取决于冷冻之前，经过长时间冷冻样品的TVC值不能指示鱼类的真实鲜度。
3结论
大菱鲆中TMA和TMAO受到贮藏条件和样品差异性的影响，使不同贮藏条件下货架期时TMA和TMAO含量产生较大差异。如0、5、30 ℃贮藏条件下大菱鲆达到货架期时TMA
的含量分别达到0.057、0.082、0.069 mg/g，而冷冻条件下TMA的含量为0.033 mg/g；0、5、30 ℃贮藏条件下大菱鲆达到货架期时TMAO的含量分别达到0.05、0.07、0.078 mg/g，而冷冻条件下TMAO含量为0.07 mg/g，所以单一的TMA和TMAO很难准确评价大菱鲆的新鲜程度。由于DMA和FA是大菱鲆冻藏阶段的腐败产物，因此其不能为各个贮藏阶段下的大菱鲆进行品质评价。
大菱鲆冷藏和常温条件下的TMA/TMAO摩尔比值和冷冻（TMA DMA）/TMAO摩尔比值在贮藏过程中变化稳定，挥发胺/氧化三甲胺摩尔比值可以反映出样品中腐败成分TMA、DMA与鲜味成分TMAO物质的量的比例关系，从而避免了单一的TMAO、DMA和TMA只能对样品进行腐败趋势分析的局限性。在3个贮藏条件下，挥发胺/氧化三甲胺摩尔比值在货架期所测得的数值大于0.81，因此当大菱鲆中挥发胺/氧化三甲胺摩尔比值小于0.81时在安全食用范围，并且在安全食用范围之内摩尔比值越小，大菱鲆就越新鲜。
在冷藏和常温条件下大菱鲆鱼肉中的TVB-N和TVC变化趋势稳定，因此TVB-N和TVC适用于该条件下的品质评价；但是在冷冻条件下TVB-N的变化较为缓慢，以至于TVB-N在评价冷冻鱼品质时敏感度变差，同时TVC在贮藏过程中逐渐减少，导致TVC很难反映冷冻贮藏样品的真实鲜度。 分析以上结果可知，挥发胺/氧化三甲胺摩尔比值可以作为判定大菱鲆新鲜度的指标。但是，要使挥发胺/氧化三甲胺摩尔比值能够作为检测大菱鲆以至于更多种水产品的鲜度指标，还需要大批量的、多种温度条件下的试验。
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