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摘要：用深孔微培养-酶标仪检测替代摇瓶培养-紫外分光光度计检测，以期建立1种高通量选育果胶酶高产菌的方法。试验确立的最佳微培养条件为：转速280 r/min，振幅45 mm，装液量1.2 mL/孔。经统计软件分析表明：2种检测方法的检测值、酶产值间线性回归关系均极显著，且数值排序大致相同，表明用深孔微培养-酶标仪检测体系选育菌种是可行的。通过复合诱变（超声波处理40 min，紫外照射60 s），经过高通量筛选，得到4株高产菌。经传代培养后证明：C23-7、C23-9这2株菌遗传稳定，酶活效价均值分别可达705.7、695.0 U/mL，分别比出发菌株（477.3 U/mL）提高了47.85%、45.61%，适合应用。
关键词：果胶酶；高通量；复合诱变；超声波；紫外诱变
中图分类号： S182 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2016）07-0513-04
果胶酶被广泛应用于食品加工、纺织加工、造纸制浆、医疗卫生等领域[1-2]，是世界四大酶制剂之一。目前果胶酶主要采用微生物发酵法大规模生产，具有较高的市场价值和应用价值。高效生产果胶酶具有十分重要的现实意义，而提高酶的产量，离不开高产菌种的选育。目前，菌种选育的技术手段十分丰富，如原生质体杂交育种、不定向诱变、转基因定向育种等，大大提升了育种效果，但是与其配套的高效筛选方法却进展不大。已报道的果胶酶高产菌种选育方法，多数仍为传统的平板筛选法[3-5]。传统方法在初筛时，对诱变后菌液的梯度稀释过程中，很有可能遗漏高产正突变菌株，而且人工、设备消耗较大，效率低下。建立1种可有效减少筛选遗漏、工作强度、材料消耗，提高工作效率的果胶酶高产菌选育方法，就成为亟待解决的问题。
1 材料与方法
1.1 主要材料与仪器
1.1.1 出发菌株 出发菌株为笔者所在实验室保藏的1株可产果胶酶的黑曲霉（Asperillus.spp）及其多个突变株。
1.1.2 主要仪器 SP-Max 2300A光吸收型全波长酶标仪；VIS-7220N紫外分光光度计；ZWY-200D摇床；Matrix EXP 6道移液器；TDZ5-WS孔板離心机；YLN-V紫外诱变箱；xrc-80AD超声波清洗器；孔板固定架；48孔矩形深孔板（4.6 mL）。
1.1.3 主要试剂 果胶粉（Sigma公司，分析纯）。DNS溶液为自行配制，储存于棕色容器避光保存1周后备用。
1.1.4 培养基 种子培养基：40 g果胶，10 g （NH）2SO4，38 g K2HPO4·3H2O，2 g KH2PO4，加蒸馏水定容到 1 000 mL，将pH值调至6。
发酵培养基：30 g蔗糖，2 g果胶，20 g（NH4）2SO4，3 g NaNO3，3.8 g K2HPO4，0.2 g KH2PO4·3H2O，0.25 g MgSO4，0.15 g Fe2（SO4）3，加蒸馏水定容到1 000 mL，将pH值调至6。
筛选平板培养基：28 g果胶，20 g （NH4）2SO4，3.8 g K2HPO4，0.2 g KH2PO4·3H2O，0.18 g CaCl2，0.25 g MgSO4，0.15 g Fe2（SO4）3，20 g琼脂条，0.2 g溴酚蓝，加蒸馏水定容到1 000 mL，将pH值调至6。
斜面培养基：PDA培养基。
1.1.5 种子液制备 挑单菌落接在PDA斜面上，于30 ℃培养7 d，用无菌生理盐水冲洗斜面，装入含有玻璃珠的锥形瓶中，振荡。用血球计数板计数，调节孢子浓度为2×107个/mL，作为种子液。
1.2 培养条件和酶活效价测定方法
1.2.1 摇瓶培养及其酶活效价测定 摇瓶培养：250 mL三角瓶中装液23 mL，接种2 mL种子液；转速200 r/min，振幅25 mm；温度30 ℃，培养58 h。以下如无专门说明，均与此相同。
在其他条件一定的情况下，单位酶活力与反应后显色物浓度呈线性相关，显色物浓度又与D值呈线性相关。因此可以直接用D值代表酶活力效价，用来反映单位酶活力。
摇瓶培养酶活力效价测定：培养结束后，取发酵液，用离心机离心，上清液即为粗酶液。
试管中加入0.9 mL含1%果胶的缓冲溶液，40 ℃水浴保温3 min；加入0.1 mL适度稀释的粗酶液，反应10 min；加入 3 mL 3，5-二硝基水杨酸（DNS）溶液，混匀，沸水浴3 min；冷却，定容到15 mL。以煮沸灭活酶液作为空白对照调零。适度稀释反应液（使D值保持在0.1～1.0之间），装入1 cm石英皿中，用紫外分光光度计测定540 nm处D540 nm。以加煮沸灭活酶液的试管为空白对照。每次测定3个平行。相关计算公式：
摇瓶培养酶活力效价（U/mL）=D540 nm×反应液稀释倍数×酶液稀释倍数。
1.2.2 深孔培养及其酶活效价测定 深孔培养：在适当单孔装液量、振幅、转速下，培养温度为30 ℃，培养时间为58 h。以下如无特别说明，均与此相同。
深孔培养酶活力效价测定。培养结束后，在各孔取 0.1 mL 发酵液，转入空白深孔板对应孔中，用无菌水补足至1 mL，混匀，孔板离心机离心，孔中上清液即为粗酶液。
为方便比较起见，其他测定条件完全同本节。不同的是先在试管中进行DNS反应，适度稀释反应液后，再将反应液移至48孔孔板对应孔中，利用酶标仪快速测定D540 nm。原因是直接利用孔板进行显色反应，沸水浴容易使孔板受热变形，且DNS反应液呈碱性，具有一定的腐蚀性，且稀释样液不方便，都会影响到测定。以加煮沸灭活酶液并经扫板检测的深孔为空白对照。每次测定3个平行，相关公式： 孔板培养酶活力效价（U/mL）=D540 nm×反应液稀释倍数×酶液稀释倍数。
1.3 复合诱变条件的确认
超声波可产生空化作用，使液体中小气泡产生高温高气压，冲击细胞，破坏壁膜，促使胞内外物质交换，从而引发突变。在紫外线照射下，嘌呤、嘧啶会形成嘧啶二聚体，阻碍碱基配对，引发突变。2种诱变方式操作简便，安全无毒，设备易得，突变率高，适合作为诱变因子。而复合诱变具备有效克服疲劳效应、提高突变率的优势。因此本研究决定采用紫外线-超声波复合诱变的方式选育高产菌种。
在平皿中分别装入10 mL种子液，超声波功率480 W，频率40 Hz，分别作用10、20、30、40、50、60、70 min（每个梯度3个平行），计算各梯度致死率。
平皿中分别装入10 mL种子液。将紫外灯功率调至 15 W，距离30 cm，电磁搅拌。分别照射15、30、45、60、75、90、105 s（每梯度3个平行）。计算各梯度致死率。致死率用平板计数法计算，3个平行，相关公式为：
致死率=（1-诱变处理后单位活菌数/未诱变处理时单位活菌数）×100%。
1.4 高通量法筛选和分离纯化单菌株
按适当方法进行诱变，将诱变后菌液尽可能全部、分别接入装有培养基的深孔板，每孔接50 μL，共得195孔。振荡培养。
对照出发菌株深孔培养的酶活效价用酶标仪测量，得到高产孔。高产孔中混有高产单菌株的概率明显较高，起到富集高产株的作用；并且，诱变后的菌液几乎全部转接至各孔，用于筛选，大大减少了遗漏可能。
将高产孔中菌液接种于斜面，培养6 d，用无菌水冲洗制成孢子悬液，适当稀释后涂布于筛选平板。挑取菌落较大、水解圈/菌落直径比值较高的单菌落，用灭菌牙签分别挑入48孔板振荡培养。用酶标仪检测酶活力效价，将高产株转接至斜面并编号保藏；同时，将高活力菌株转接入摇瓶中发酵验证酶活力效价。
2 结果与分析
2.1 深孔板培养方法的优化
2.1.1 转速、振幅对酶产量的影响 设置转速梯度 40 r/min，振幅梯度10 mm，深孔板装液量1 mL/孔。在深孔中接入出发菌株种子液，按“1.2”节中的方法培养，研究转速、振幅对酶产量的影响。由图1可以看出：当振幅小于 35 mm 时，产物积累量随转速的提高增长十分有限，可能是深孔中、摇瓶中液体的力学状况明显不同，深孔中的液体相对摇瓶会产生明显的表面张力，培养液所受离心力需要克服表面张力，振荡效果较差，影响了溶氧效果[6]；当振幅达到45 mm时，转速从240 r/min增长到280 r/min时，产物积累量有了显著提高，可能是在振幅、转速明显提高后，克服了表面张力，改善了供氧条件。而在45 mm振幅下，转速超过280 r/min后，进一步提高转速，产物积累量没有明显提高，过高的转速还容易使发酵液溢出，增加了交叉污染的可能。因此，选取深孔培养的振动条件为转速280 r/min，振幅45 mm。
2.1.2 单孔装液量对酶产量的影响 采用0.2 mL/孔的装液梯度（每个梯度3个平行），转速、振幅同“2.1.1”節中的优化结果，验证装液量的影响。产酶是一个需氧过程，装液量的多少对果胶酶积累量的影响很大[7]。由图2可见：装液量为1.0 mL/孔时，单位效价最高；装液量为1.2、1.4 mL/孔时有所下降，但下降不多，且相互间差别不大；装液量继续加大后，效价有较为明显的下降。
装液量过多会使菌体生长困难，单位产物积累下降，且容易造成交叉污染和空气中的杂菌污染。而装液量过少，会给取样分析造成困难，且容易提高培养液挥发率，影响测定精度。深孔板振荡培养结果表明，四周培养基澄清无生长迹象，因此设置装液量为1.2 mL/孔。
2.2 深孔板法用于菌种选育的可行性分析
2.2.1 酶标仪替代紫外分光光度计的可行性 取14株产酶能力明显不同的突变株，按“1.2.1”节中的方法摇瓶培养后，分别利用酶标仪检测深孔、紫外分光光度计检测石英皿中液体吸光度，得到2组酶活效价。
由图3可见，2组数据排序一致。用SPSS软件分析得到2组数据的相关性，F值=596.122，P值=0.000<0.01。
2种测定方法所得酶活效价不同，但2组数据线性回归关系极显著，说明用酶标仪检测法代替紫外分光光度计检测法是可行的。
2.2.2 深孔板培养与摇瓶培养产酶量相关性分析 由于摇瓶培养、深孔板中的菌体生存环境存在一定区别，会对菌体的生长繁殖和新陈代谢过程产生影响，进而影响产物积累。本研究旨在用深孔培养替代摇瓶培养以提高选育效率，考察同一菌株在2个不同培养环境下彼此之间产物积累量的相关性，有一定的必要性。
取14株产酶能力有明显差异的突变株，分别接入孔板和摇瓶当中培养（做3个平行），按“1.2”节中方法测出2组酶活效价。由图4可见：产量排序大致相同，有2株不同，原因可能是同一菌株对不同生长环境的适应能力不同。用SPSS软件分析2组数据关系可知：F值=61.533，P值=0.000<0.01。
2种培养方法之间酶活效价线性回归关系极显著，说明用微孔板培养替代摇瓶发酵，用于快速挑选高产菌株是可行的。深孔产量偏低，可能是深孔供氧能力较差所致。
2.3 高通量选育
2.3.1 复合诱变条件的确认 如图5、图6所示，随着超声波时间的延长，致死率呈线性提高，30 min时达到62.3%，40 min 达到74.6%，50 min时即达到89.3%，70 min开始达到100%。随着紫外照射时间延长，致死率同样迅速提高，45 s 后即达55.6%，60 s时达到71.8%，75 s时达到86.5%，105 s开始达到100%。 致死率过低，会使突变率不足，不利于得到突变菌株。致死率过高，同样不利于得到突变株[8-9]。并且，考虑到要先后进行2次诱变，2种诱变条件均不宜处理过长时间，使致死率过高。因此，选取2个诱变因子的致死率均为70%～80%的时间作为处理时间。以此确认诱变条件：超声波处理40 min，紫外照射时间60 s。
2.3.2 复合诱变和高通量筛选结果 按“2.3.1”节中确认的诱变条件进行复合诱变，再按“1.4”节中的方法筛选高产孔，分离纯化单菌株。
诱变后分接培养的195孔菌中，158孔无生长迹象，其余37孔经酶活检测，结果见图7。可以看出：多孔正变株酶活力得以提高，其中C23孔最高，酶活效价可达254.6 U/mL。对照组（出发菌株）酶活效价：孔板186.7 U/mL。可見高产孔C23比对照（出发菌株）高36.19%。
按“1.2.2”节中方法分离纯化C23孔中菌株，共得到单菌落67株，挑选出17株水解圈/菌落直径比较大、生长比较迅速的单菌株，经摇瓶培养验证，共得到4株高产菌株，分别为：C23-4（687.5 U/mL）、C23-7（701.3 U/mL）、C23-9（692.3 U/mL）、C23-14（698.7 U/mL）（图8）。
2.4 高产株遗传稳定性验证
将斜面转接分离纯化所得4株高产菌传代培养，每转接1次记为1代。取不同代数菌株进行摇瓶试验，测定酶活效价。由表1可见，C23-7、C23-9这2株菌产酶性能遗传性比较稳定，酶活效价均值分别可达705.7、695.0 U/mL，与出发菌株的477.3 U/mL相比分别提高了47.85%、45.61%，适合作为生产用菌种；而C23-4、C23-14随传代培养而酶活效价下降，可能是因为传代过程中相关性状丢失或者发生了自然分化，不适合作为生产用菌种。
3 结论
试验结果表明，本研究尝试建立的采用深孔板微量培育、酶标仪快速检测、高通量选育果胶酶高产菌的方法是可行的。与传统选育方法相比，本方法几乎覆盖了诱变后等待初筛的菌，大大减少了高产株遗漏的可能性。最多可一次性利用酶标仪精确测定48个待测样本的酶活力效价，单批次检测量大增，显著提高了初次筛选的效率，大大降低了材耗和能耗，节省了人工，提高了效率。
本方法是一种具备一定应用价值的果胶酶高产菌株选育方法，一些其他产酶菌株，如果所产酶可用紫外分光光度法原理测定（如产纤维素酶菌），亦可尝试利用本方法进行菌种选育。
参考文献：
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[2]李祖明，张洪勋，白志辉，等. 微生物果胶酶研究进展[J]. 生物技术通报，2010（3）：42-49.
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[4]华宝玉，林 娟，严 芬，等. 产果胶酶菌株的筛选鉴定及其产酶条件的研究[J]. 福州大学学报：自然科学版，2012，40（3）：412-417.
[5]袁志辉.一株果胶酶产生菌的筛选、鉴定及其产酶条件研究[J]. 天然产物研究与开发，2013，25（12）：1627-1630，1637.
[6]Duetz W A. Microtiter plates as mini-bioreactors：miniaturization of fermentation methods[J]. Trends in Microbiology，2007，15（10）：469-475.
[7]全桂静，王 硕. 果胶酶液体发酵条件与分离纯化的研究[J]. 现代食品科技，2009，25（11）：1338-1341.
[8]佘秋生，杨海波，杨冠军，等. 紫外诱变黑曲霉筛选高产果胶酶菌种[J]. 中国酿造，2012，31（6）：134-137.
[9]陈 林，王明兹，柯崇榕，等. 紫外线与超声波复合诱变选育红曲色素高产菌株的研究[J]. 中国酿造，2010（3）：66-67.
关键词：果胶酶；高通量；复合诱变；超声波；紫外诱变
中图分类号： S182 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2016）07-0513-04
果胶酶被广泛应用于食品加工、纺织加工、造纸制浆、医疗卫生等领域[1-2]，是世界四大酶制剂之一。目前果胶酶主要采用微生物发酵法大规模生产，具有较高的市场价值和应用价值。高效生产果胶酶具有十分重要的现实意义，而提高酶的产量，离不开高产菌种的选育。目前，菌种选育的技术手段十分丰富，如原生质体杂交育种、不定向诱变、转基因定向育种等，大大提升了育种效果，但是与其配套的高效筛选方法却进展不大。已报道的果胶酶高产菌种选育方法，多数仍为传统的平板筛选法[3-5]。传统方法在初筛时，对诱变后菌液的梯度稀释过程中，很有可能遗漏高产正突变菌株，而且人工、设备消耗较大，效率低下。建立1种可有效减少筛选遗漏、工作强度、材料消耗，提高工作效率的果胶酶高产菌选育方法，就成为亟待解决的问题。
1 材料与方法
1.1 主要材料与仪器
1.1.1 出发菌株 出发菌株为笔者所在实验室保藏的1株可产果胶酶的黑曲霉（Asperillus.spp）及其多个突变株。
1.1.2 主要仪器 SP-Max 2300A光吸收型全波长酶标仪；VIS-7220N紫外分光光度计；ZWY-200D摇床；Matrix EXP 6道移液器；TDZ5-WS孔板離心机；YLN-V紫外诱变箱；xrc-80AD超声波清洗器；孔板固定架；48孔矩形深孔板（4.6 mL）。
1.1.3 主要试剂 果胶粉（Sigma公司，分析纯）。DNS溶液为自行配制，储存于棕色容器避光保存1周后备用。
1.1.4 培养基 种子培养基：40 g果胶，10 g （NH）2SO4，38 g K2HPO4·3H2O，2 g KH2PO4，加蒸馏水定容到 1 000 mL，将pH值调至6。
发酵培养基：30 g蔗糖，2 g果胶，20 g（NH4）2SO4，3 g NaNO3，3.8 g K2HPO4，0.2 g KH2PO4·3H2O，0.25 g MgSO4，0.15 g Fe2（SO4）3，加蒸馏水定容到1 000 mL，将pH值调至6。
筛选平板培养基：28 g果胶，20 g （NH4）2SO4，3.8 g K2HPO4，0.2 g KH2PO4·3H2O，0.18 g CaCl2，0.25 g MgSO4，0.15 g Fe2（SO4）3，20 g琼脂条，0.2 g溴酚蓝，加蒸馏水定容到1 000 mL，将pH值调至6。
斜面培养基：PDA培养基。
1.1.5 种子液制备 挑单菌落接在PDA斜面上，于30 ℃培养7 d，用无菌生理盐水冲洗斜面，装入含有玻璃珠的锥形瓶中，振荡。用血球计数板计数，调节孢子浓度为2×107个/mL，作为种子液。
1.2 培养条件和酶活效价测定方法
1.2.1 摇瓶培养及其酶活效价测定 摇瓶培养：250 mL三角瓶中装液23 mL，接种2 mL种子液；转速200 r/min，振幅25 mm；温度30 ℃，培养58 h。以下如无专门说明，均与此相同。
在其他条件一定的情况下，单位酶活力与反应后显色物浓度呈线性相关，显色物浓度又与D值呈线性相关。因此可以直接用D值代表酶活力效价，用来反映单位酶活力。
摇瓶培养酶活力效价测定：培养结束后，取发酵液，用离心机离心，上清液即为粗酶液。
试管中加入0.9 mL含1%果胶的缓冲溶液，40 ℃水浴保温3 min；加入0.1 mL适度稀释的粗酶液，反应10 min；加入 3 mL 3，5-二硝基水杨酸（DNS）溶液，混匀，沸水浴3 min；冷却，定容到15 mL。以煮沸灭活酶液作为空白对照调零。适度稀释反应液（使D值保持在0.1～1.0之间），装入1 cm石英皿中，用紫外分光光度计测定540 nm处D540 nm。以加煮沸灭活酶液的试管为空白对照。每次测定3个平行。相关计算公式：
摇瓶培养酶活力效价（U/mL）=D540 nm×反应液稀释倍数×酶液稀释倍数。
1.2.2 深孔培养及其酶活效价测定 深孔培养：在适当单孔装液量、振幅、转速下，培养温度为30 ℃，培养时间为58 h。以下如无特别说明，均与此相同。
深孔培养酶活力效价测定。培养结束后，在各孔取 0.1 mL 发酵液，转入空白深孔板对应孔中，用无菌水补足至1 mL，混匀，孔板离心机离心，孔中上清液即为粗酶液。
为方便比较起见，其他测定条件完全同本节。不同的是先在试管中进行DNS反应，适度稀释反应液后，再将反应液移至48孔孔板对应孔中，利用酶标仪快速测定D540 nm。原因是直接利用孔板进行显色反应，沸水浴容易使孔板受热变形，且DNS反应液呈碱性，具有一定的腐蚀性，且稀释样液不方便，都会影响到测定。以加煮沸灭活酶液并经扫板检测的深孔为空白对照。每次测定3个平行，相关公式： 孔板培养酶活力效价（U/mL）=D540 nm×反应液稀释倍数×酶液稀释倍数。
1.3 复合诱变条件的确认
超声波可产生空化作用，使液体中小气泡产生高温高气压，冲击细胞，破坏壁膜，促使胞内外物质交换，从而引发突变。在紫外线照射下，嘌呤、嘧啶会形成嘧啶二聚体，阻碍碱基配对，引发突变。2种诱变方式操作简便，安全无毒，设备易得，突变率高，适合作为诱变因子。而复合诱变具备有效克服疲劳效应、提高突变率的优势。因此本研究决定采用紫外线-超声波复合诱变的方式选育高产菌种。
在平皿中分别装入10 mL种子液，超声波功率480 W，频率40 Hz，分别作用10、20、30、40、50、60、70 min（每个梯度3个平行），计算各梯度致死率。
平皿中分别装入10 mL种子液。将紫外灯功率调至 15 W，距离30 cm，电磁搅拌。分别照射15、30、45、60、75、90、105 s（每梯度3个平行）。计算各梯度致死率。致死率用平板计数法计算，3个平行，相关公式为：
致死率=（1-诱变处理后单位活菌数/未诱变处理时单位活菌数）×100%。
1.4 高通量法筛选和分离纯化单菌株
按适当方法进行诱变，将诱变后菌液尽可能全部、分别接入装有培养基的深孔板，每孔接50 μL，共得195孔。振荡培养。
对照出发菌株深孔培养的酶活效价用酶标仪测量，得到高产孔。高产孔中混有高产单菌株的概率明显较高，起到富集高产株的作用；并且，诱变后的菌液几乎全部转接至各孔，用于筛选，大大减少了遗漏可能。
将高产孔中菌液接种于斜面，培养6 d，用无菌水冲洗制成孢子悬液，适当稀释后涂布于筛选平板。挑取菌落较大、水解圈/菌落直径比值较高的单菌落，用灭菌牙签分别挑入48孔板振荡培养。用酶标仪检测酶活力效价，将高产株转接至斜面并编号保藏；同时，将高活力菌株转接入摇瓶中发酵验证酶活力效价。
2 结果与分析
2.1 深孔板培养方法的优化
2.1.1 转速、振幅对酶产量的影响 设置转速梯度 40 r/min，振幅梯度10 mm，深孔板装液量1 mL/孔。在深孔中接入出发菌株种子液，按“1.2”节中的方法培养，研究转速、振幅对酶产量的影响。由图1可以看出：当振幅小于 35 mm 时，产物积累量随转速的提高增长十分有限，可能是深孔中、摇瓶中液体的力学状况明显不同，深孔中的液体相对摇瓶会产生明显的表面张力，培养液所受离心力需要克服表面张力，振荡效果较差，影响了溶氧效果[6]；当振幅达到45 mm时，转速从240 r/min增长到280 r/min时，产物积累量有了显著提高，可能是在振幅、转速明显提高后，克服了表面张力，改善了供氧条件。而在45 mm振幅下，转速超过280 r/min后，进一步提高转速，产物积累量没有明显提高，过高的转速还容易使发酵液溢出，增加了交叉污染的可能。因此，选取深孔培养的振动条件为转速280 r/min，振幅45 mm。
2.1.2 单孔装液量对酶产量的影响 采用0.2 mL/孔的装液梯度（每个梯度3个平行），转速、振幅同“2.1.1”節中的优化结果，验证装液量的影响。产酶是一个需氧过程，装液量的多少对果胶酶积累量的影响很大[7]。由图2可见：装液量为1.0 mL/孔时，单位效价最高；装液量为1.2、1.4 mL/孔时有所下降，但下降不多，且相互间差别不大；装液量继续加大后，效价有较为明显的下降。
装液量过多会使菌体生长困难，单位产物积累下降，且容易造成交叉污染和空气中的杂菌污染。而装液量过少，会给取样分析造成困难，且容易提高培养液挥发率，影响测定精度。深孔板振荡培养结果表明，四周培养基澄清无生长迹象，因此设置装液量为1.2 mL/孔。
2.2 深孔板法用于菌种选育的可行性分析
2.2.1 酶标仪替代紫外分光光度计的可行性 取14株产酶能力明显不同的突变株，按“1.2.1”节中的方法摇瓶培养后，分别利用酶标仪检测深孔、紫外分光光度计检测石英皿中液体吸光度，得到2组酶活效价。
由图3可见，2组数据排序一致。用SPSS软件分析得到2组数据的相关性，F值=596.122，P值=0.000<0.01。
2种测定方法所得酶活效价不同，但2组数据线性回归关系极显著，说明用酶标仪检测法代替紫外分光光度计检测法是可行的。
2.2.2 深孔板培养与摇瓶培养产酶量相关性分析 由于摇瓶培养、深孔板中的菌体生存环境存在一定区别，会对菌体的生长繁殖和新陈代谢过程产生影响，进而影响产物积累。本研究旨在用深孔培养替代摇瓶培养以提高选育效率，考察同一菌株在2个不同培养环境下彼此之间产物积累量的相关性，有一定的必要性。
取14株产酶能力有明显差异的突变株，分别接入孔板和摇瓶当中培养（做3个平行），按“1.2”节中方法测出2组酶活效价。由图4可见：产量排序大致相同，有2株不同，原因可能是同一菌株对不同生长环境的适应能力不同。用SPSS软件分析2组数据关系可知：F值=61.533，P值=0.000<0.01。
2种培养方法之间酶活效价线性回归关系极显著，说明用微孔板培养替代摇瓶发酵，用于快速挑选高产菌株是可行的。深孔产量偏低，可能是深孔供氧能力较差所致。
2.3 高通量选育
2.3.1 复合诱变条件的确认 如图5、图6所示，随着超声波时间的延长，致死率呈线性提高，30 min时达到62.3%，40 min 达到74.6%，50 min时即达到89.3%，70 min开始达到100%。随着紫外照射时间延长，致死率同样迅速提高，45 s 后即达55.6%，60 s时达到71.8%，75 s时达到86.5%，105 s开始达到100%。 致死率过低，会使突变率不足，不利于得到突变菌株。致死率过高，同样不利于得到突变株[8-9]。并且，考虑到要先后进行2次诱变，2种诱变条件均不宜处理过长时间，使致死率过高。因此，选取2个诱变因子的致死率均为70%～80%的时间作为处理时间。以此确认诱变条件：超声波处理40 min，紫外照射时间60 s。
2.3.2 复合诱变和高通量筛选结果 按“2.3.1”节中确认的诱变条件进行复合诱变，再按“1.4”节中的方法筛选高产孔，分离纯化单菌株。
诱变后分接培养的195孔菌中，158孔无生长迹象，其余37孔经酶活检测，结果见图7。可以看出：多孔正变株酶活力得以提高，其中C23孔最高，酶活效价可达254.6 U/mL。对照组（出发菌株）酶活效价：孔板186.7 U/mL。可見高产孔C23比对照（出发菌株）高36.19%。
按“1.2.2”节中方法分离纯化C23孔中菌株，共得到单菌落67株，挑选出17株水解圈/菌落直径比较大、生长比较迅速的单菌株，经摇瓶培养验证，共得到4株高产菌株，分别为：C23-4（687.5 U/mL）、C23-7（701.3 U/mL）、C23-9（692.3 U/mL）、C23-14（698.7 U/mL）（图8）。
2.4 高产株遗传稳定性验证
将斜面转接分离纯化所得4株高产菌传代培养，每转接1次记为1代。取不同代数菌株进行摇瓶试验，测定酶活效价。由表1可见，C23-7、C23-9这2株菌产酶性能遗传性比较稳定，酶活效价均值分别可达705.7、695.0 U/mL，与出发菌株的477.3 U/mL相比分别提高了47.85%、45.61%，适合作为生产用菌种；而C23-4、C23-14随传代培养而酶活效价下降，可能是因为传代过程中相关性状丢失或者发生了自然分化，不适合作为生产用菌种。
3 结论
试验结果表明，本研究尝试建立的采用深孔板微量培育、酶标仪快速检测、高通量选育果胶酶高产菌的方法是可行的。与传统选育方法相比，本方法几乎覆盖了诱变后等待初筛的菌，大大减少了高产株遗漏的可能性。最多可一次性利用酶标仪精确测定48个待测样本的酶活力效价，单批次检测量大增，显著提高了初次筛选的效率，大大降低了材耗和能耗，节省了人工，提高了效率。
本方法是一种具备一定应用价值的果胶酶高产菌株选育方法，一些其他产酶菌株，如果所产酶可用紫外分光光度法原理测定（如产纤维素酶菌），亦可尝试利用本方法进行菌种选育。
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