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摘要 通过人工接种的方法研究来自不同地区30份菌株的致病力（性）。结果表明，不同菌株间致病力存在差异，病情等级为1.92～8.84，以强致病力为主，占比73.3%。不同寄主对菌株的抗感反应也存在差异，可为病原菌菌群划分和育种提供理论依据。
关键词 油菜黑胫病;病原菌;致病力;人工接种;差异
中图分类号 S436.24文献标识码 A
文章编号 0517-6611（2019）21-0136-03
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.21.040
开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
Analysis of Pathogenicity Differentiation of Leptosphaeria biglobosa in Brassica napus
RONG Songbai， LI Qiangsheng， CHU Mingguang
（Crop Institute， Anhui Academy of Agricultural Sciences， Hefei， Anhui 230031）
Abstract The pathogenicity of 30 isolates from different regions was identified by artificial inoculation in this study. The result showed the pathogenic varieties were obvious among the isolates， ranging from 1.92 to 8.84. The isolates with more aggressive pathogenicity were dominant， accounting for 73.3% in the experiment. The pathogenicity of the differential races was various， which provided a theoretical basis for the classification and breeding of pathogenic.
Key words Leptosphaeria biglobosa;Pathogenic bacteria;Pathogenicity;Artificial inoculation;Differentiation
基金项目 国家重点研发计划项目（2018YFD0100602）;院自主创新基金项目（17A0206）。
作者简介 荣松柏（1978—），男，安徽枞阳人，副研究员，硕士，从事油菜抗病育种研究。通信作者，博士研究生，研究方向：油菜抗病育种。
收稿日期 2019-09-03
油菜黑胫病（phoma stem canker）是世界性油菜真菌病害之一[1]，在加拿大、澳大利亚和欧洲很多国家都有大面积发生[2]。该病害有强侵染型菌（Leptosphaeria maculans）和弱侵染型菌（L.biglobosa）2种类型[3]。在致病性上前者强于后者，也是导致世界范围内油菜黑胫病害流行及危害的主要病原菌，据统计每年造成全球油菜经济损失约9亿美元[2]。研究者根据接种寄主对不同菌株抗感反应以及菌株致病性的差异，将L.maculans菌进行了菌群的划分[4-5];随着分子生物学的发展利用，完成了基因对基因的病原菌生理小种和抗性资源的研究[6-7]。 L.biglobosa在我国已普遍发生[8-9]，通过人工接种和田间自然诱导接种，已证明了L.biglobosa菌对油菜
產量及相关性状具有一定的影响[10]。但在病原菌类型、致病性等研究上较少。笔者从全国不同地区采集30份菌株，利用人工接种的方法研究其致病性差异，以期为研究病害菌群以及抗病育种提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 供试菌株与品种
供试菌株为2009—2015年在全国油菜种植区采集的病株（表1），经实验室内分离、纯化和分子生物学PCR鉴定。菌株置于PDA（马铃薯葡萄糖琼脂）培养备用。供试油菜品种10个，均由安徽省农业科院作物研究所提供，其中国外品种5个，十字花科白菜品种1个（表2）。
1.2 方法
1.2.1 菌株分离纯化、孢子悬浮液配制。
切取边长约0.2 cm的病斑秸秆组织，经消毒、清洗等处理后置水琼脂培养基上，20 ℃黑暗条件下培养3～5 d，再挑取少量菌丝体在PDA上培养，反复多次，直至纯化[11]。无菌条件下挑取少量纯化后的菌丝在V8果汁琼脂培养基上培养5～7 d。产生孢子后用无菌水稀释，配制成浓度为107/mL分生孢子悬浮液[12-13]。
1.2.2 DNA提取和PCR 鉴定。
用干净的刀片从长满菌丝的培养皿（Φ为90 mm）中轻轻刮下菌丝，利用真菌DNA快速提取试剂盒（上海生工B518229）按照试剂盒操作说明提取DNA。
多重PCR引物从上海生物工程公司定购，由于病原菌有2种类型，引物A：5’-CTTGCCCACCAATTGGATCCCCTA-3’用于鉴定L.maculans，引物B：5’-ATCAGGGGATTGGTGTCAGCAGTTGA-3’用于鉴定 L.biglobosa， 引物 R：5’-GCAAAATGTGCTGCGCTCCAGG-3’为共同反向引物。20 μL PCR反应体系：40 ng DNA模 板，正向引物各100 ng，反 向 引 物 200 ng，4 μmol dNTPs，1U的Taq酶，30 mmol MgCl2，1倍PCR缓冲液，加ddH2O调至反应体积。引物PCR反应为常规SCAR反应程序，65 ℃退火。 1.2.3 人工接種。
将50 mL的50孔塑料穴盘用无菌花卉营养土填充压实，充分湿润，按每穴1粒播种油菜种子，用少量细土覆盖。温室条件为16 h白天温度20 ℃，8 h夜晚温度15 ℃。待子叶长出后（约播种后10 d）用消毒过的剪刀剪去幼苗生长点，促进子叶生长。将配制好表面长满菌丝体的PDA用消毒过的塑料管分切成直径3～4 mm的小块，接种前在油菜子叶中心部位用消毒针轻刺小孔，将菌丝块菌丝面贴于子叶小孔处。接种后保持在恒温25 ℃，光照16 h、黑暗8 h，100%湿度的生长室内48 h。试验设3次重复，每份菌株每次重复接种10棵，试验设置空白对照。
1.2.4 病害调查与统计。
接种14 d后根据子叶接种部位的病斑面积大小和死亡程度，按照0～9级分级标准进行调查（图1），并记录数据和统计分析[4，14]。
2 结果与分析
2.1 病原菌PCR鉴定
对纯化后的30个菌株提取DNA，进行多重PCR鉴定。鉴定结果显示，30个菌株DNA中扩增出大小440 bp的扩增产物（L.biglobosa），未检测出大小334 bp与L.maculans相对应的谱带（图2）。
2.2 致病力差异分析 从表3可以看出，
来自江西、安徽、江苏和陕西的30个供试菌株对接种的10份油菜和十字花科品种表现出不同的致病性。病原菌致病力平均等级为1.92～8.80，其中代号038-4菌株在所供试植株上均表现出较低的致病力，平均值仅为1.92，而019-3菌株致病力高达8.84;病原菌侵染子叶形成大小不一的病斑，前者较小，病斑一般直径小于3 mm，且病斑处没有分生孢子器产生;而后者强致病菌株在子叶表面形成较大面积病斑，并伴有分生孢子器产生，导致叶片干枯直至死亡（图1）。弱致病力指数小于4的菌株有3个;中等致病力指数大于等于4小于6的有5个，强致病力指数大于等于6的有22个，不同菌株间致病力存在明显差异。
在相同地区菌株致病力表现上，除江西省1份供试菌株表现为强致病性外，其余3个省份均存在差异，其中江苏省弱致病菌1例，中等致病菌3例，强致病菌7例;安徽省中等致病菌1例，强致病菌8例;陕西省弱致病菌2例，中等致病菌1例，强致病菌6例。
通过对菌株致病力分析，供试菌株在同一受体品种上的致病力等级差值为5.8～8.8。其中，022-4和040-1菌株对G1品种的致病力等级分别为0.2和9.0，差值达最大值;菌株对G8品种的致病力差异最小（图3）。
3 讨论
我国是油菜生产大国，油菜种植区域广阔。油菜黑胫病作为一种油菜新病害在我国已经普遍发生[8]。虽然迄今为止，尚未在我国发现强侵染型（L.maculans）菌，但研究表明油菜黑胫病（L.biglobosa）在一定情况下会导致严重的油菜产量损失。因此，加强对该病害的研究，有利于油菜产业的健康发展。
不同的生态环境和耕作习惯对病害发生也具有一定的影响，在调查和采集样本过程中发现，不同地区或不同田块，病害的发病率、病情指数均存在明显差异[15]。从该试验结果看，来自于4个省份的病原菌表现出弱致病力、中等致病力和强致病力的占比分别为10.0%、16.7%和73.3%，一方面证明了我国油菜黑胫病病原菌的致病性存在差异;另一方面，其强致病力菌株占多数，预示着该病害对我国油菜可能会产生严重的危害。
病原菌致病力研究充分说明了我国油菜黑胫病菌的多样性，但形成的原因，以及机理尚不十分清楚，尤其是在病原菌类群和生理小种类型的划分等方面亟待进一步研究。
参考文献
[1] FITT B D L，BRUN H，BARBETTI M J，et al.Worldwide importance of phoma stem canker（Leptosphaeria maculans and L.biglobosa）on oilseed rape（Brassica napus）[J].European journal of plant pathology，2006，114：3-15.
[2] WEST J S，KHARBANDA P D，BARBETTI M J，et al.Epidemiology and management of Leptosphaeria maculans（phoma stem canker）on oilseed rape in Australia，Canada and Europe[J].Plant Pathol，2001，50（1）：10-27.
[3] JOHNSON R D，LEWIS B G.DNA polymorphism in Leptosphaeria maculans[J].Physiological and molecular plant pathology，1990，37（6）：417-424.
[4] KOCH E，SONG K，OSBORN T C，et al.Relationship between pathogenicity and phylogeny based on restriction fragment length polymorphism in Leptosphaeria maculans[J].Mol PlantMicrobe Interact，1991，4：341-349.
[5] MENGISTU A，RIMMER S R，KOCH E，et al.Pathogenicity grouping of isolates of Leptosphaeria maculans on Brassica napus cultivars and their disease reaction profiles on rapidcycling brassicas[J].Plant Dis，1991，75：1279-1282. [6] ROUXEL T，BALESDENT M H.The stem canker（blackleg）fungus，Leptosphaeria maculans，enters the genomic era[J].Mol Plant Pathol，2005，6（3）：225-241.
[7] VAN DE WOUW A P，LOWE R G T，ELLIOTT C E，et al.An avirulence gene，AvrLmJ1，from the blackleg fungus，Leptosphaeria maculans，confers avirulence to Brassica juncea cultivars[J].Mol Plant Pathol，2014，15（5）：523-530.
[8] WEST J S，EVANS N，LIU S Y，et al.Leptosphaeria maculans causing stem canker of oilseed rape in China[J].Plant pathology，2000，49（6）：800.
[9] 李强生，荣松柏，胡宝成，等.中国油菜黑胫病害分布及病原菌鉴定[J].中国油料作物学报，2013，35（4）：415-423.
[10] 荣松柏，胡宝成，陈凤祥，等.油菜黑胫病对油菜产量及农艺性状的影响[J].作物杂志，2015（6）：159-161.
[11] 陶炼.农作物病害研究之油菜黑胫病害[M].北京：光明日报出版社，2009.
[12] MENGISTU A，RIMMER R S，WILLIAMAS P H.Protocols for in vitro sporulation，ascospore release，sexual mating，and fertility in crosses of Leptosphaeria maculans[J].Plant disease，1993，77（5）：538-540.
[13] LI H，BARBETTI M J，SIVASITHAMPARAM K.Concomitant inoculation of an avirulent strain of Leptosphaeria maculans prevents breakdown of a single dominant genebased resistance in Brassica napus cv.Surpass 400 by a virulent strain[J].Field crops research，2006，95（2/3）：206-211.
[14] WILLIAMS P H，DELWICHE P A.Screening for resistance to blackleg of crucifers in the seeding stange[C]//VAN MERREWIJK N P A，TOXOPEUS H.Proceeding of the Eucarpia Cruciferae Conference.Wageningen，Netherlands：[s.n]，1979：164-170.
[15] 胡寶成.把论文写在大地上：参加国家油菜产业技术体系工作纪实[M].北京：中国农业科学技术出版社，2017.
关键词 油菜黑胫病;病原菌;致病力;人工接种;差异
中图分类号 S436.24文献标识码 A
文章编号 0517-6611（2019）21-0136-03
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.21.040
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Analysis of Pathogenicity Differentiation of Leptosphaeria biglobosa in Brassica napus
RONG Songbai， LI Qiangsheng， CHU Mingguang
（Crop Institute， Anhui Academy of Agricultural Sciences， Hefei， Anhui 230031）
Abstract The pathogenicity of 30 isolates from different regions was identified by artificial inoculation in this study. The result showed the pathogenic varieties were obvious among the isolates， ranging from 1.92 to 8.84. The isolates with more aggressive pathogenicity were dominant， accounting for 73.3% in the experiment. The pathogenicity of the differential races was various， which provided a theoretical basis for the classification and breeding of pathogenic.
Key words Leptosphaeria biglobosa;Pathogenic bacteria;Pathogenicity;Artificial inoculation;Differentiation
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作者简介 荣松柏（1978—），男，安徽枞阳人，副研究员，硕士，从事油菜抗病育种研究。通信作者，博士研究生，研究方向：油菜抗病育种。
收稿日期 2019-09-03
油菜黑胫病（phoma stem canker）是世界性油菜真菌病害之一[1]，在加拿大、澳大利亚和欧洲很多国家都有大面积发生[2]。该病害有强侵染型菌（Leptosphaeria maculans）和弱侵染型菌（L.biglobosa）2种类型[3]。在致病性上前者强于后者，也是导致世界范围内油菜黑胫病害流行及危害的主要病原菌，据统计每年造成全球油菜经济损失约9亿美元[2]。研究者根据接种寄主对不同菌株抗感反应以及菌株致病性的差异，将L.maculans菌进行了菌群的划分[4-5];随着分子生物学的发展利用，完成了基因对基因的病原菌生理小种和抗性资源的研究[6-7]。 L.biglobosa在我国已普遍发生[8-9]，通过人工接种和田间自然诱导接种，已证明了L.biglobosa菌对油菜
產量及相关性状具有一定的影响[10]。但在病原菌类型、致病性等研究上较少。笔者从全国不同地区采集30份菌株，利用人工接种的方法研究其致病性差异，以期为研究病害菌群以及抗病育种提供理论依据。
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1.2 方法
1.2.1 菌株分离纯化、孢子悬浮液配制。
切取边长约0.2 cm的病斑秸秆组织，经消毒、清洗等处理后置水琼脂培养基上，20 ℃黑暗条件下培养3～5 d，再挑取少量菌丝体在PDA上培养，反复多次，直至纯化[11]。无菌条件下挑取少量纯化后的菌丝在V8果汁琼脂培养基上培养5～7 d。产生孢子后用无菌水稀释，配制成浓度为107/mL分生孢子悬浮液[12-13]。
1.2.2 DNA提取和PCR 鉴定。
用干净的刀片从长满菌丝的培养皿（Φ为90 mm）中轻轻刮下菌丝，利用真菌DNA快速提取试剂盒（上海生工B518229）按照试剂盒操作说明提取DNA。
多重PCR引物从上海生物工程公司定购，由于病原菌有2种类型，引物A：5’-CTTGCCCACCAATTGGATCCCCTA-3’用于鉴定L.maculans，引物B：5’-ATCAGGGGATTGGTGTCAGCAGTTGA-3’用于鉴定 L.biglobosa， 引物 R：5’-GCAAAATGTGCTGCGCTCCAGG-3’为共同反向引物。20 μL PCR反应体系：40 ng DNA模 板，正向引物各100 ng，反 向 引 物 200 ng，4 μmol dNTPs，1U的Taq酶，30 mmol MgCl2，1倍PCR缓冲液，加ddH2O调至反应体积。引物PCR反应为常规SCAR反应程序，65 ℃退火。 1.2.3 人工接種。
将50 mL的50孔塑料穴盘用无菌花卉营养土填充压实，充分湿润，按每穴1粒播种油菜种子，用少量细土覆盖。温室条件为16 h白天温度20 ℃，8 h夜晚温度15 ℃。待子叶长出后（约播种后10 d）用消毒过的剪刀剪去幼苗生长点，促进子叶生长。将配制好表面长满菌丝体的PDA用消毒过的塑料管分切成直径3～4 mm的小块，接种前在油菜子叶中心部位用消毒针轻刺小孔，将菌丝块菌丝面贴于子叶小孔处。接种后保持在恒温25 ℃，光照16 h、黑暗8 h，100%湿度的生长室内48 h。试验设3次重复，每份菌株每次重复接种10棵，试验设置空白对照。
1.2.4 病害调查与统计。
接种14 d后根据子叶接种部位的病斑面积大小和死亡程度，按照0～9级分级标准进行调查（图1），并记录数据和统计分析[4，14]。
2 结果与分析
2.1 病原菌PCR鉴定
对纯化后的30个菌株提取DNA，进行多重PCR鉴定。鉴定结果显示，30个菌株DNA中扩增出大小440 bp的扩增产物（L.biglobosa），未检测出大小334 bp与L.maculans相对应的谱带（图2）。
2.2 致病力差异分析 从表3可以看出，
来自江西、安徽、江苏和陕西的30个供试菌株对接种的10份油菜和十字花科品种表现出不同的致病性。病原菌致病力平均等级为1.92～8.80，其中代号038-4菌株在所供试植株上均表现出较低的致病力，平均值仅为1.92，而019-3菌株致病力高达8.84;病原菌侵染子叶形成大小不一的病斑，前者较小，病斑一般直径小于3 mm，且病斑处没有分生孢子器产生;而后者强致病菌株在子叶表面形成较大面积病斑，并伴有分生孢子器产生，导致叶片干枯直至死亡（图1）。弱致病力指数小于4的菌株有3个;中等致病力指数大于等于4小于6的有5个，强致病力指数大于等于6的有22个，不同菌株间致病力存在明显差异。
在相同地区菌株致病力表现上，除江西省1份供试菌株表现为强致病性外，其余3个省份均存在差异，其中江苏省弱致病菌1例，中等致病菌3例，强致病菌7例;安徽省中等致病菌1例，强致病菌8例;陕西省弱致病菌2例，中等致病菌1例，强致病菌6例。
通过对菌株致病力分析，供试菌株在同一受体品种上的致病力等级差值为5.8～8.8。其中，022-4和040-1菌株对G1品种的致病力等级分别为0.2和9.0，差值达最大值;菌株对G8品种的致病力差异最小（图3）。
3 讨论
我国是油菜生产大国，油菜种植区域广阔。油菜黑胫病作为一种油菜新病害在我国已经普遍发生[8]。虽然迄今为止，尚未在我国发现强侵染型（L.maculans）菌，但研究表明油菜黑胫病（L.biglobosa）在一定情况下会导致严重的油菜产量损失。因此，加强对该病害的研究，有利于油菜产业的健康发展。
不同的生态环境和耕作习惯对病害发生也具有一定的影响，在调查和采集样本过程中发现，不同地区或不同田块，病害的发病率、病情指数均存在明显差异[15]。从该试验结果看，来自于4个省份的病原菌表现出弱致病力、中等致病力和强致病力的占比分别为10.0%、16.7%和73.3%，一方面证明了我国油菜黑胫病病原菌的致病性存在差异;另一方面，其强致病力菌株占多数，预示着该病害对我国油菜可能会产生严重的危害。
病原菌致病力研究充分说明了我国油菜黑胫病菌的多样性，但形成的原因，以及机理尚不十分清楚，尤其是在病原菌类群和生理小种类型的划分等方面亟待进一步研究。
参考文献
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[8] WEST J S，EVANS N，LIU S Y，et al.Leptosphaeria maculans causing stem canker of oilseed rape in China[J].Plant pathology，2000，49（6）：800.
[9] 李强生，荣松柏，胡宝成，等.中国油菜黑胫病害分布及病原菌鉴定[J].中国油料作物学报，2013，35（4）：415-423.
[10] 荣松柏，胡宝成，陈凤祥，等.油菜黑胫病对油菜产量及农艺性状的影响[J].作物杂志，2015（6）：159-161.
[11] 陶炼.农作物病害研究之油菜黑胫病害[M].北京：光明日报出版社，2009.
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