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摘要 以果蝇、日蝇及其3龄幼虫为研究对象，采用先染色后分离唾腺组织的方法简化了唾腺染色体的制备过程。通过比较发现，日蝇可能是更适合
制备唾腺染色体的试验材料。
关键词 果蝇；日蝇；唾腺染色体；遗传学实验
中图分类号 S-01 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2018）21-0234-03
Abstract Taking Drosophila melanogaster，Heleomyzidae and their thirdinstar larvae as research objects，the preparation process of salivary gland chromosome was simplified by using the method of firstly staining and then separating the salivary gland tissue.The results indicated Heleomyzidae might be more suitable for preparing salivary gland chromosome than other experimental materials.
Key words Drosophila melanogaster；Heleomyzidae；Salivary gland chromosome；Genetics experiments
唾腺染色体最早是1881年意大利细胞学家Balbiani在摇蝇幼虫中发现的一种巨大染色体，由于存在于唾液腺细胞中，所以称为唾腺染色体（salivary gland chromosome），是染色体常染色质区的核蛋白纤维不断复制，但复制产物不分开，成千上万条染色质纤维平行排列成宽大的带状物，又称多线染色体（polytene chromosome），比一般染色体粗1 000～2 000倍，长100～200倍[1]。果蝇唾腺染色体制片与观察是遗传学教学的典型实验之一。现今普遍采用的唾腺染色体制备方法是压片法[2]。长期以来，许多研究者对该实验方法进行了不断优化，近几年又有研究者从果蝇的培养方法、果蝇唾腺体的剥取、实验过程中的解离处理、不同染色剂的比较以及后期图片的处理等方面做了改进[1，3-12]。这些研究中实际操作都比较繁琐，忽视了唾腺染色体“巨大”这个特点，唾腺细胞核也比其他细胞大，因此只要稍作染色，就能将果蝇唾腺体从头部组织的口器、脂肪和食道管中分离开。此外，唾腺染色体普遍存在于蝇科幼虫中，蝇科其他种可能也是唾腺染色体制片的优秀材料。笔者对唾腺染色体制片方法进行了简化与改进，旨在为唾腺染色体的研究和实验教学提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料 果蝇及其3龄幼虫、日蝇及其3龄幼虫。
1.2 试剂 1%醋酸洋红，采用常规方法配制。称取1 g洋红，加到100 mL 45%的醋酸溶液中，煮沸约5 min，悬入一生锈小铁钉1 min，冷却过滤并保存于棕色瓶中备用。
1.3 器材 显微镜、镊子、解剖针、载玻片、盖玻片、滤纸。
1.4 试验方法
①取果蝇和日蝇3龄幼虫置于载玻片上，用镊子夹住幼虫的尾部，用解剖针按住幼虫头部，轻轻拉出幼虫的口器，带出唾腺及其他组织。②滴加1滴1%的醋酸洋红，染色约1 min后，置于显微镜载物台上，使用4倍物镜观察唾腺组织，剔除口器、脂肪、食道管等其他组织部分。如果这些组织与唾腺组织联结比较紧密，可用解剖针剖解，再去除非唾腺组织部分。③对着唾腺组织盖上盖玻片，盖玻片一角垫上双面刀片，按住另一边，用镊子轻敲几下，去掉刀片，盖上滤纸，垂直压片后，即可使用显微镜进行观察。
2 结果与分析
2.1 唾腺染色体制片方法的简化
日蝇和果蝇同属双翅目，日蝇成虫比果蝇大（图1、2），3龄幼虫也比果蝇大。无论是果蝇3龄幼虫还是日蝇3龄幼虫都很容易制备出唾腺染色体装片。3龄幼虫头部被拉出并染色约1 min后，在4倍物镜下可见清晰的头部组织，包括口器、脂肪、唾腺、食道管等，其中唾腺组织是由许多大型唾腺细胞组成，细胞中间是染色比较深的细胞核，核内即为唾腺染色体，其他组织的细胞核比较小，因此很容易将唾腺组织与其他组织区分开来，便于剥离（图3、4）。用解剖针移除口器和食道管，留下唾腺组织及其附着的少量脂肪（图5、6），发现日蝇的唾腺组织比果蝇大。经压片后，在40倍物镜下能清晰地观察到唾腺染色体的图像，由于去除了口器和食道管等组织的混杂，所以图片背景比较清晰（图7、8）。这说明这种方法适用于果蝇和日蝇唾腺染色体的制片与观察，尤其是实验教学。
2.2 唾腺染色体制片材料的优化 在实验过程中有时候拉出来的3龄幼虫头部组织排布比较规则（图3、4），从形态上也可以将唾腺组织与口器、脂肪和食道管区分开。如果拉出的头部组织排布不规则，唾腺组织和食道管就很难辨认，经过染色后，根據唾腺组织细胞核大、染色深等特点，比较容易将其与食道管区分（图9、10）。日蝇无论是成虫还是幼虫都比果蝇大，分离唾腺组织时比较容易操作，压片后唾腺染色体相差不大。自然环境中日蝇比较多，容易诱捕和培养。因此，在唾腺染色体制片和观察实验课中，选用日蝇作为实验材料比果蝇更为理想。
3 结论与讨论
3.1 唾腺染色体制片方法的简化与改进 ①省略了一些器具和药品。
在一些实验指导和文献中通常要使用双筒解剖镜、酒精灯、生理盐水、固定液、HCl解离液、乙醇、背景净化液、冲洗液等[1，3-6]。该方法不需要使用这些器具和药品，在显微镜低倍镜（4倍物镜）下就可以分离唾腺组织和其他组织，因为步骤少、时间短，再加上1%醋酸洋红具有一定的固定作用，唾腺细胞无细胞壁且间隙物质少，所以可以省略以上器具和药品。②剥离唾腺组织前先染色。 在以往的方法中，剥离唾腺组织一般要在生理盐水中进行，在盐酸解离液中解离，或者在净化液中处理以净化背景，这些溶液对醋酸洋红的染色有一定的影响，所以需要用水冲洗后才能加醋酸洋红进行染色[1，3-12]。此外，唾腺与食道管等组织颜色相近，很难辨别，解剖后如果没有及时确认，就会随液体漂动，而与其他组织混为一体，故常常容易误将食道管等当成唾腺，导致实验失败。在剥离唾腺组织前，对果蝇3龄幼虫头部组织进行染色，由于唾腺细胞体积大，唾腺染色体粗大，染色后很容易与其他组织部分区分开来，因此剥离出来的唾腺组织就比较干净，背景干净。由于操作过程中使用的试剂较少，醋酸洋红染色受到的干扰就少，再加上在染液中剥离唾腺，又加快了醋酸洋红的染色，所以染色时间就会縮短。
③实验材料的改进。
以往的唾腺染色体制片和观察实验中，选用的实验材料都是果蝇3龄幼虫，但是果蝇3龄幼虫比较小。选用日蝇作为实验材料，更容易制备出比较理想的装片。
3.2 建议 ①拉出3龄幼虫头部时，解剖针不宜太尖太锋利，可稍微倾斜解剖针，以免割破口器而使整个头部缩进幼虫内部，也可以用牙签或大头针代替。
②剥取唾腺组织时，可将载玻片从显微镜载物台上取下来，操作比较方便，但因为在显微镜看到的图像与实际相反，即翻转180°，所以将头部各个组织分离开后，将载玻片置于显微镜下观察唾腺组织，再去除其他组织部分。③敲打盖玻片时用力要恰当，以唾腺组织完全分散，呈浅红雾状为宜，避免因用力不足而导致细胞重叠从而影响观察效果，或者因用力过大而导致唾腺染色体断裂而漂走。
参考文献
[1]刘祖洞，江绍慧.遗传学实验[M].2版.北京：高等教育出版社，1987：9-13.
[2] 杨大翔.“果蝇唾腺染色体的制备与观察实验”的背景知识[J].生物学教学，2005，30（4）：37-39.
[3] 卢龙斗，常重杰，杜启艳，等.遗传学实验技术[M].合肥：中国科学技术大学出版社，1996：27-30.
[4] 张志达.如何做好“果蝇唾腺染色体观察”实验[J].廊坊师专学报（自然科学版），1997（3）：45-46.
[5] 庞瑞媛，谢文海，李桂芬.唾腺染色体实验方法的改进[J].玉林师范学院学报（自然科学版），2002，23（3）：89-90.
[6] 薛小桥，曾庆韬，杨勇.一种易于掌握的果蝇唾腺染色体制片方法[J].实验室研究与探索，2000（5）：108-109，112.
[7] 胡甘.用于果蝇唾腺染色体实验材料的培养方法[J].实验科学与技术，2007（5）：38，52.
[8] 周志华.快速获得果蝇唾腺体的技巧和方法[J].安徽农学通报，2017，23（21）：39-40，63.
[9] 王晓杰，董梅，王永香，等.盐酸解离对果蝇唾腺染色体解聚与制片效果的影响[J].青岛农业大学学报（自然科学版），2016，33（1）：24-26.
[10] 刘丽影，刘文静，邵红.果蝇唾腺染色体四种染色方法的比较[J].佳木斯大学学报（自然科学版），2007，25（3）：424-426.
[11] 倪奎.三种染色法对果蝇唾腺染色体制片优化设计[J].合肥学院学报（综合版），2017，34（2）：79-83.
[12] 杨大祥，程劼，许也，等.果蝇（Drosophila melanogaster）唾腺染色体的制备及染色体识别[J].中国农业大学学报， 2014，19（1）：143-149.
制备唾腺染色体的试验材料。
关键词 果蝇；日蝇；唾腺染色体；遗传学实验
中图分类号 S-01 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2018）21-0234-03
Abstract Taking Drosophila melanogaster，Heleomyzidae and their thirdinstar larvae as research objects，the preparation process of salivary gland chromosome was simplified by using the method of firstly staining and then separating the salivary gland tissue.The results indicated Heleomyzidae might be more suitable for preparing salivary gland chromosome than other experimental materials.
Key words Drosophila melanogaster；Heleomyzidae；Salivary gland chromosome；Genetics experiments
唾腺染色体最早是1881年意大利细胞学家Balbiani在摇蝇幼虫中发现的一种巨大染色体，由于存在于唾液腺细胞中，所以称为唾腺染色体（salivary gland chromosome），是染色体常染色质区的核蛋白纤维不断复制，但复制产物不分开，成千上万条染色质纤维平行排列成宽大的带状物，又称多线染色体（polytene chromosome），比一般染色体粗1 000～2 000倍，长100～200倍[1]。果蝇唾腺染色体制片与观察是遗传学教学的典型实验之一。现今普遍采用的唾腺染色体制备方法是压片法[2]。长期以来，许多研究者对该实验方法进行了不断优化，近几年又有研究者从果蝇的培养方法、果蝇唾腺体的剥取、实验过程中的解离处理、不同染色剂的比较以及后期图片的处理等方面做了改进[1，3-12]。这些研究中实际操作都比较繁琐，忽视了唾腺染色体“巨大”这个特点，唾腺细胞核也比其他细胞大，因此只要稍作染色，就能将果蝇唾腺体从头部组织的口器、脂肪和食道管中分离开。此外，唾腺染色体普遍存在于蝇科幼虫中，蝇科其他种可能也是唾腺染色体制片的优秀材料。笔者对唾腺染色体制片方法进行了简化与改进，旨在为唾腺染色体的研究和实验教学提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料 果蝇及其3龄幼虫、日蝇及其3龄幼虫。
1.2 试剂 1%醋酸洋红，采用常规方法配制。称取1 g洋红，加到100 mL 45%的醋酸溶液中，煮沸约5 min，悬入一生锈小铁钉1 min，冷却过滤并保存于棕色瓶中备用。
1.3 器材 显微镜、镊子、解剖针、载玻片、盖玻片、滤纸。
1.4 试验方法
①取果蝇和日蝇3龄幼虫置于载玻片上，用镊子夹住幼虫的尾部，用解剖针按住幼虫头部，轻轻拉出幼虫的口器，带出唾腺及其他组织。②滴加1滴1%的醋酸洋红，染色约1 min后，置于显微镜载物台上，使用4倍物镜观察唾腺组织，剔除口器、脂肪、食道管等其他组织部分。如果这些组织与唾腺组织联结比较紧密，可用解剖针剖解，再去除非唾腺组织部分。③对着唾腺组织盖上盖玻片，盖玻片一角垫上双面刀片，按住另一边，用镊子轻敲几下，去掉刀片，盖上滤纸，垂直压片后，即可使用显微镜进行观察。
2 结果与分析
2.1 唾腺染色体制片方法的简化
日蝇和果蝇同属双翅目，日蝇成虫比果蝇大（图1、2），3龄幼虫也比果蝇大。无论是果蝇3龄幼虫还是日蝇3龄幼虫都很容易制备出唾腺染色体装片。3龄幼虫头部被拉出并染色约1 min后，在4倍物镜下可见清晰的头部组织，包括口器、脂肪、唾腺、食道管等，其中唾腺组织是由许多大型唾腺细胞组成，细胞中间是染色比较深的细胞核，核内即为唾腺染色体，其他组织的细胞核比较小，因此很容易将唾腺组织与其他组织区分开来，便于剥离（图3、4）。用解剖针移除口器和食道管，留下唾腺组织及其附着的少量脂肪（图5、6），发现日蝇的唾腺组织比果蝇大。经压片后，在40倍物镜下能清晰地观察到唾腺染色体的图像，由于去除了口器和食道管等组织的混杂，所以图片背景比较清晰（图7、8）。这说明这种方法适用于果蝇和日蝇唾腺染色体的制片与观察，尤其是实验教学。
2.2 唾腺染色体制片材料的优化 在实验过程中有时候拉出来的3龄幼虫头部组织排布比较规则（图3、4），从形态上也可以将唾腺组织与口器、脂肪和食道管区分开。如果拉出的头部组织排布不规则，唾腺组织和食道管就很难辨认，经过染色后，根據唾腺组织细胞核大、染色深等特点，比较容易将其与食道管区分（图9、10）。日蝇无论是成虫还是幼虫都比果蝇大，分离唾腺组织时比较容易操作，压片后唾腺染色体相差不大。自然环境中日蝇比较多，容易诱捕和培养。因此，在唾腺染色体制片和观察实验课中，选用日蝇作为实验材料比果蝇更为理想。
3 结论与讨论
3.1 唾腺染色体制片方法的简化与改进 ①省略了一些器具和药品。
在一些实验指导和文献中通常要使用双筒解剖镜、酒精灯、生理盐水、固定液、HCl解离液、乙醇、背景净化液、冲洗液等[1，3-6]。该方法不需要使用这些器具和药品，在显微镜低倍镜（4倍物镜）下就可以分离唾腺组织和其他组织，因为步骤少、时间短，再加上1%醋酸洋红具有一定的固定作用，唾腺细胞无细胞壁且间隙物质少，所以可以省略以上器具和药品。②剥离唾腺组织前先染色。 在以往的方法中，剥离唾腺组织一般要在生理盐水中进行，在盐酸解离液中解离，或者在净化液中处理以净化背景，这些溶液对醋酸洋红的染色有一定的影响，所以需要用水冲洗后才能加醋酸洋红进行染色[1，3-12]。此外，唾腺与食道管等组织颜色相近，很难辨别，解剖后如果没有及时确认，就会随液体漂动，而与其他组织混为一体，故常常容易误将食道管等当成唾腺，导致实验失败。在剥离唾腺组织前，对果蝇3龄幼虫头部组织进行染色，由于唾腺细胞体积大，唾腺染色体粗大，染色后很容易与其他组织部分区分开来，因此剥离出来的唾腺组织就比较干净，背景干净。由于操作过程中使用的试剂较少，醋酸洋红染色受到的干扰就少，再加上在染液中剥离唾腺，又加快了醋酸洋红的染色，所以染色时间就会縮短。
③实验材料的改进。
以往的唾腺染色体制片和观察实验中，选用的实验材料都是果蝇3龄幼虫，但是果蝇3龄幼虫比较小。选用日蝇作为实验材料，更容易制备出比较理想的装片。
3.2 建议 ①拉出3龄幼虫头部时，解剖针不宜太尖太锋利，可稍微倾斜解剖针，以免割破口器而使整个头部缩进幼虫内部，也可以用牙签或大头针代替。
②剥取唾腺组织时，可将载玻片从显微镜载物台上取下来，操作比较方便，但因为在显微镜看到的图像与实际相反，即翻转180°，所以将头部各个组织分离开后，将载玻片置于显微镜下观察唾腺组织，再去除其他组织部分。③敲打盖玻片时用力要恰当，以唾腺组织完全分散，呈浅红雾状为宜，避免因用力不足而导致细胞重叠从而影响观察效果，或者因用力过大而导致唾腺染色体断裂而漂走。
参考文献
[1]刘祖洞，江绍慧.遗传学实验[M].2版.北京：高等教育出版社，1987：9-13.
[2] 杨大翔.“果蝇唾腺染色体的制备与观察实验”的背景知识[J].生物学教学，2005，30（4）：37-39.
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[4] 张志达.如何做好“果蝇唾腺染色体观察”实验[J].廊坊师专学报（自然科学版），1997（3）：45-46.
[5] 庞瑞媛，谢文海，李桂芬.唾腺染色体实验方法的改进[J].玉林师范学院学报（自然科学版），2002，23（3）：89-90.
[6] 薛小桥，曾庆韬，杨勇.一种易于掌握的果蝇唾腺染色体制片方法[J].实验室研究与探索，2000（5）：108-109，112.
[7] 胡甘.用于果蝇唾腺染色体实验材料的培养方法[J].实验科学与技术，2007（5）：38，52.
[8] 周志华.快速获得果蝇唾腺体的技巧和方法[J].安徽农学通报，2017，23（21）：39-40，63.
[9] 王晓杰，董梅，王永香，等.盐酸解离对果蝇唾腺染色体解聚与制片效果的影响[J].青岛农业大学学报（自然科学版），2016，33（1）：24-26.
[10] 刘丽影，刘文静，邵红.果蝇唾腺染色体四种染色方法的比较[J].佳木斯大学学报（自然科学版），2007，25（3）：424-426.
[11] 倪奎.三种染色法对果蝇唾腺染色体制片优化设计[J].合肥学院学报（综合版），2017，34（2）：79-83.
[12] 杨大祥，程劼，许也，等.果蝇（Drosophila melanogaster）唾腺染色体的制备及染色体识别[J].中国农业大学学报， 2014，19（1）：143-149.