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摘要
[目的]建立一种发酵液中核黄素含量的快速测定方法。[方法]利用紫外分光光度法，检测波长为444 nm。[结果] 在5.04～25.40 μg/ml之间相关系数为0.999 6，回收率为100.736 7%。 [结论] 该方法简单、快速、准确。
关键词 紫外分光光度法；核黄素；发酵液
中图分类号 S182 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）11-03223-02
Abstract [Objective] The research aimed to found a method to determine the concentration of riboflavin in fermentation broth fast. [Method] Using UV spectrophotometry， the determination wavelength was 444 nm. [Result] The coefficient was 0.999 6 in the linearity range from 5.04 μg/ml to 25.4 μg/ml， and the recovery rate was 100.736 7%. [Conclusion] This method was simple， fast and accurate.
Key words UV spectrophotography； Riboflavin； Fermentation broth
核黄素（Riboflavin）即维生素B2（Vitamin B2），是人和动物必需的水溶性维生素，是体内多种氧化酶系统中不可缺少的辅基部分。如果机体缺乏核黄素，那么就会影响生物体正常的氧化作用，引起物质代谢紊乱，出现一系列的病症，可出现口角炎、舌炎等一系列皮肤黏膜症状，严重者将会导致死亡[1]。有研究表明，核黄素的缺乏会减弱HepG2细胞中的氧化折叠及阿朴脂蛋白B100的分泌，引起机体产生焦虑应答[2]。进一步研究显示，缺乏核黄素还会引起HepG2细胞中蛋白质和DNA的损伤，使得细胞周期停留在G1期[3]。核黄素广泛存在于动植物中，在酵母、肝、肾、蛋黄、奶及大豆中含量丰富，很多微生物、植物、真菌都能合成核黄素，但是脊柱动物包括人类只能从食物中摄取，因此它被广泛应用于医药、食品及饲料等行业[4-7]。现在，全世界年产核黄素3 000 t，其中约75%用作饲料添加剂，约25%用于食品和药品[8]。目前，核黄素的工业化生产以微生物液态深层发酵法为主。生产用的菌种主要有阿氏假囊酵母（Eremothecium ashbyii，简称E. ashbyii ）、棉病阿舒囊霉（Ashbya gossypii） 、无名假丝酵母菌（Candida famate）及枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[9]。快速测定发酵液中核黄素的含量对菌种选育、代谢调控、改进发酵工艺都具有非常重要的意义。笔者对紫外分光光度法快速测定发酵液中核黄素的含量进行了研究。
1 材料与方法
1.1 菌种
供试菌种为枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis），生物室保藏。
1.2 培养基
斜面培养基：胰蛋白胨1.0%，酵母抽提物0.5%，NaCl 1.0%，琼脂2.0%，pH 7.2～7.4；
种子培养基：葡萄糖2.0%，酵母抽提物1.0%，MgSO4·7H2O 0.05%，pH 7.2～7.4；
发酵培养基：葡萄糖10%， MgSO4·7H2O 0.05%，黄豆粉0.35%，玉米桨0.3%，酵母粉0.1%，pH 7.2～7.4。
1.3 试验方法
1.3.1
发酵条件。从冷藏斜面上挑取菌苔，在含有相对应抗生素的LB平板上三区划线，37 ℃培养箱中活化24 h，挑取单菌落接种至装有50 ml种子培养基的250 ml三角瓶中，37 ℃培养24 h，接种至装有50 ml发酵培养基的250 ml三角瓶中，使发酵液中菌体初始浓度为2.5×108 cfu/ml，40 ℃，220 r/min振荡培养50 h，待测。
1.3.2
样品处理。将发酵液摇匀，取发酵液500 μl，加4.5 ml 0.05 mol/L NaOH，8 000 r/min离心4～5 min，除去发酵液中的菌体和其他杂质，所得上清液再用0.01 mol/L HAC适当稀释后即为待测液。
1.3.3
标准溶液。避光操作。精密称取核黄素对照品50.4 mg，加5 ml 0.05 mol/L NaOH溶解，再用0.01 mol/L HAc定容至100 ml，分别取不同量，用0.01 mol/L HAc稀释成不同浓度，即5.04、10.08、12.10、15.12、18.14、20.16、25.40 μg/ml，在444 nm下测定吸收值。每个点测定3次，求A（平均）。
1.3.4
参比溶液。以灭菌后的培养基溶液代替发酵液，同“1.3.2”操作处理后作为空白溶液。
1.3.5
检测条件。用紫外分光光度计对标准溶液、发酵液及未接种培养基进行全波长扫描，在444nm处测定发酵液的吸收峰值。
1.3.6
定量测定。样品经过处理后在444 nm处测定其吸收峰值，根据444 nm处吸收峰值及所做出的标准曲线进行定量。
2 结果与分析
2.1 发酵液中核黄素提取试剂的确定
根据核黄素的溶解度与pH的关系[10]和相关文献报道，确定了用0.05 mol/L NaOH提取核黄素。结果表明，采取该方法可以使得核黄素稳定存在的时间满足试验要求，并且可以充分溶解发酵液中的核黄素，经离心可以方便地除去发酵液中菌体和其他杂质，减少对扫描图谱的干扰。
[目的]建立一种发酵液中核黄素含量的快速测定方法。[方法]利用紫外分光光度法，检测波长为444 nm。[结果] 在5.04～25.40 μg/ml之间相关系数为0.999 6，回收率为100.736 7%。 [结论] 该方法简单、快速、准确。
关键词 紫外分光光度法；核黄素；发酵液
中图分类号 S182 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）11-03223-02
Abstract [Objective] The research aimed to found a method to determine the concentration of riboflavin in fermentation broth fast. [Method] Using UV spectrophotometry， the determination wavelength was 444 nm. [Result] The coefficient was 0.999 6 in the linearity range from 5.04 μg/ml to 25.4 μg/ml， and the recovery rate was 100.736 7%. [Conclusion] This method was simple， fast and accurate.
Key words UV spectrophotography； Riboflavin； Fermentation broth
核黄素（Riboflavin）即维生素B2（Vitamin B2），是人和动物必需的水溶性维生素，是体内多种氧化酶系统中不可缺少的辅基部分。如果机体缺乏核黄素，那么就会影响生物体正常的氧化作用，引起物质代谢紊乱，出现一系列的病症，可出现口角炎、舌炎等一系列皮肤黏膜症状，严重者将会导致死亡[1]。有研究表明，核黄素的缺乏会减弱HepG2细胞中的氧化折叠及阿朴脂蛋白B100的分泌，引起机体产生焦虑应答[2]。进一步研究显示，缺乏核黄素还会引起HepG2细胞中蛋白质和DNA的损伤，使得细胞周期停留在G1期[3]。核黄素广泛存在于动植物中，在酵母、肝、肾、蛋黄、奶及大豆中含量丰富，很多微生物、植物、真菌都能合成核黄素，但是脊柱动物包括人类只能从食物中摄取，因此它被广泛应用于医药、食品及饲料等行业[4-7]。现在，全世界年产核黄素3 000 t，其中约75%用作饲料添加剂，约25%用于食品和药品[8]。目前，核黄素的工业化生产以微生物液态深层发酵法为主。生产用的菌种主要有阿氏假囊酵母（Eremothecium ashbyii，简称E. ashbyii ）、棉病阿舒囊霉（Ashbya gossypii） 、无名假丝酵母菌（Candida famate）及枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[9]。快速测定发酵液中核黄素的含量对菌种选育、代谢调控、改进发酵工艺都具有非常重要的意义。笔者对紫外分光光度法快速测定发酵液中核黄素的含量进行了研究。
1 材料与方法
1.1 菌种
供试菌种为枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis），生物室保藏。
1.2 培养基
斜面培养基：胰蛋白胨1.0%，酵母抽提物0.5%，NaCl 1.0%，琼脂2.0%，pH 7.2～7.4；
种子培养基：葡萄糖2.0%，酵母抽提物1.0%，MgSO4·7H2O 0.05%，pH 7.2～7.4；
发酵培养基：葡萄糖10%， MgSO4·7H2O 0.05%，黄豆粉0.35%，玉米桨0.3%，酵母粉0.1%，pH 7.2～7.4。
1.3 试验方法
1.3.1
发酵条件。从冷藏斜面上挑取菌苔，在含有相对应抗生素的LB平板上三区划线，37 ℃培养箱中活化24 h，挑取单菌落接种至装有50 ml种子培养基的250 ml三角瓶中，37 ℃培养24 h，接种至装有50 ml发酵培养基的250 ml三角瓶中，使发酵液中菌体初始浓度为2.5×108 cfu/ml，40 ℃，220 r/min振荡培养50 h，待测。
1.3.2
样品处理。将发酵液摇匀，取发酵液500 μl，加4.5 ml 0.05 mol/L NaOH，8 000 r/min离心4～5 min，除去发酵液中的菌体和其他杂质，所得上清液再用0.01 mol/L HAC适当稀释后即为待测液。
1.3.3
标准溶液。避光操作。精密称取核黄素对照品50.4 mg，加5 ml 0.05 mol/L NaOH溶解，再用0.01 mol/L HAc定容至100 ml，分别取不同量，用0.01 mol/L HAc稀释成不同浓度，即5.04、10.08、12.10、15.12、18.14、20.16、25.40 μg/ml，在444 nm下测定吸收值。每个点测定3次，求A（平均）。
1.3.4
参比溶液。以灭菌后的培养基溶液代替发酵液，同“1.3.2”操作处理后作为空白溶液。
1.3.5
检测条件。用紫外分光光度计对标准溶液、发酵液及未接种培养基进行全波长扫描，在444nm处测定发酵液的吸收峰值。
1.3.6
定量测定。样品经过处理后在444 nm处测定其吸收峰值，根据444 nm处吸收峰值及所做出的标准曲线进行定量。
2 结果与分析
2.1 发酵液中核黄素提取试剂的确定
根据核黄素的溶解度与pH的关系[10]和相关文献报道，确定了用0.05 mol/L NaOH提取核黄素。结果表明，采取该方法可以使得核黄素稳定存在的时间满足试验要求，并且可以充分溶解发酵液中的核黄素，经离心可以方便地除去发酵液中菌体和其他杂质，减少对扫描图谱的干扰。