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【摘 要】针对市售不同益生菌进行了基础发酵特性研究，选择不同的益生元，分别对市售益生菌进行增殖研究，验证后选择低聚果糖和半乳糖作为益生元，进行风味发酵乳的发酵研究。结果显示，益生元低聚果糖和低聚半乳糖对乳双歧杆菌A和鼠李糖乳杆菌A具有较好的增殖作用。而在风味发酵乳的研究中发现，乳双歧杆菌不参与风味发酵乳的后熟及产品风味变化较小，而鼠李糖乳杆菌的添加会显著影响风味发酵乳的后酸，导致产品的酸度和pH值的上升，影响货架期后端产品口感，所以在风味发酵乳领域，选择乳双歧杆菌作为益生菌的添加。将乳双歧杆菌A和鼠李糖乳杆菌A应用于固体饮料中，使用低水活的脱脂粉做为基料，使得终产品显著区别于市售产品，温水冲泡后具有和一杯脱脂粉一样的风味，在货架期内产品水分活度始终低于0.25。
【关键词】益生菌;益生元;风味发酵乳;发酵特性;固体饮料
【Abstract】： The basic fermentation characteristics of different commercially available probiotics were studied， different prebiotics were selected， and the probiotics were proliferated separately. After verification， fructooligosaccharides and galactose were selected as prebiotics to conduct the fermentation research of flavored fermented milk. The results showed that fructooligosaccharides and galactooligosaccharides have a good proliferation effect on Bifidobacterium lactis A and Lactobacillus rhamnosus A. In the research of flavored fermented milk， it is found that Bifidobacterium lactis does not participate in the post-ripening of flavored fermented milk and the product flavor changes little， while the addition of Lactobacillus rhamnosus will significantly affect the after-acidity of flavored fermented milk， resulting in product degradation. The increase in acidity and pH value affects the taste of products at the end of the shelf life. Therefore， in the field of flavored fermented milk， Bifidobacterium lactis is selected as a probiotic addition. Bifidobacterium lactis A and Lactobacillus rhamnosus A are used in solid beverages， using skim powder with low water activity as the base material， which makes the final product significantly different from the commercially products. After mixed in warm water， it has the same taste just like an bottle of skim powder and the water activity is always below 0.25 during the whole shelf life.
【Key words】： probiotics; prebiotics; flavor fermented milk; fermented character; solid beverage
益生菌是一类活的微生物，当摄入充足的数量时，会对宿主产生一种有论证的功能性健康益处[1-2]。目前，益生菌的功效主要集中在下面几个方向：如调节肠道菌群功能、提升免疫力、等等[3]。益生元是益生菌的食物，益生元是一种可选择性发酵的食物原料，对肠道微生態的组成和活性产生特别的作用，从而对宿主产生健康的有益影响。所有的益生元都是膳食纤维，但不是所有的膳食纤维都是益生元[4-5]。本实验在体外通过分光光度计的方法，选择市售不同的益生菌与常用益生元，分别进行培养基培养，使用OD60的方法测试不同的益生元对不同的益生菌类别增殖效果的研究。将目标益生菌即乳双歧杆菌A和鼠李糖乳杆菌A分别进行风味发酵乳的发酵实验，观察并且测定产品在货架期内的口感变化和质构变化，评估筛选适合于风味发酵乳产品使用的益生菌。并将其作为组合，共同开发一款不同于常规产品的益生菌产品，此款产品使用低水分活度的脱脂粉，进行干法混合，在货架期内具有较好的活性及质量
1.材料与方法
1.1材料与仪器
1.1.1 实验材料：益生菌（乳双歧杆菌A、鼠李糖乳杆菌A、乳双歧杆菌BB12、嗜酸乳杆菌NCFM、鼠李糖乳杆菌LGG）、益生元（低聚果糖、低聚半乳糖、菊粉）、生牛乳、白砂糖、嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌、脱脂粉、商业用MRS培养基。 1.1.2 实验仪器：分析天平、恒温水浴锅、恒温培养箱、烧杯、Mettler pH计、紫外分光光度计、磷酸盐缓冲液
1.2实验方法
1.2.1 单因素实验设计如下：
将益生元按照2%添加于改良的MRS培养基种，以此做为对照组。实验组选择不同的益生菌和益生元，形成15组样品分别进行紫外分光光度计OD600的测定，菌种培养条件选择37℃，48h培养。
1.2.2 将乳双歧杆菌A和鼠李糖乳杆菌A分别做为益生菌制备风味发酵乳，测定产品在货架期内的pH，滴定酸度的变化数据，并进行感官评定。
1.2.2.1 风味发酵乳生产工艺流程：
配料→均质→杀菌→接种发酵→灌装→冷藏后熟
配料：将鲜牛乳进行升温至50℃，加入白砂糖8%、低聚半乳糖2%，55℃保温水合30 min。
均质：温度65℃，压力20 MPa。
杀菌：95 ℃，5 min。
接种发酵：冷却至40℃，接種酸奶发酵剂，搅拌使菌粉混合均匀，置于40℃恒温箱内发酵至pH值到达4.5，滴定酸度达到70度。
灌装：将酸奶经过乳化泵乳化后灌装于酸奶杯中，快速冷却至15℃。
冷藏后熟：4-6 ℃，冷藏后熟24h。
权重 评分标准
色泽 10 10-6（乳白色，浊度高） 5-1（有发黄等异常颜色，浊度低）
乳清析出 20 20-17（无析出，微量析出） 16-11（少量析出） 10-5（析出较多） 4-1（严重析出）
粘稠度 20 20-17（粘度适中，口感浓厚） 16-11（口感略显稀薄） 10-5（口感较稀薄） 4-1（口感很稀）
顺滑感、奶香味 20 20-17（顺滑爽口，奶油感强） 16-11（顺滑感和奶香味略弱） 10-5（顺滑度和奶香味较差，有粉感或颗粒感） 4-1（不顺滑，颗粒感和粉感严重）
酸甜度 20 20-17（酸甜适中） 16-11（稍甜或酸） 10-5（较甜或酸） 4-1（过甜或酸）
酸奶特征风味 10 10-9（酸奶特征风味明显） 8-6（特征风味略淡） 5-3（特征风味淡或有异味） 2-1（异味明显）
1.2.2.2 货架期产品的检测及感官评定
分别于产品生产后24h、48h、72h、7天、14天、21天测定产品的pH值，滴定酸度及感官评定。
感官测试：请 10 位感官正常、经过训练有经验的人组成评定小组，对不同益生菌添加的风味发酵乳进行综合的感官评价，评分标准见下表：
1.2.3 益生菌固体饮料产品的开发
选择新西兰进口低水分活度脱脂乳粉与益生菌粉混合制备成为固体饮料，在货架期的第1天、3个月、6个月、9个月、12个月、15个月与18个月分别测定产品的水分活度，并在货架期的初始及第18个月测定产品中的益生菌总数量。
2 结果与分析
2.1 益生元的筛选与OD600增殖数据结果如下：
从以上结果可以得出，所有的益生元都可以增殖益生菌。
乳杆菌增殖结果，三株乳杆菌在培养48h后，OD值均大于0.7，但是在添加低聚半乳糖的培养基中增长效果更显著。但是在添加菊粉的培养基中，增殖效果并没有这么明显。LGG在含有低聚糖和低聚果糖的培养基中增殖效果更显著，这与Pansear 文献描述一致[6-7]。
940–948.嗜酸乳杆菌NCFM，相较于添加低聚半乳糖的培养基中，其在添加低聚果糖的培养基中会有更好的增殖（1.38 和 0.865）。从结果也可以看出来，双歧杆菌属的两株菌相较于乳杆菌来说，均可以较好的利用本实验中的三中益生元来进行增殖，并且同样可以看出，双歧杆菌属可以较好的利用低聚半乳糖相比较于菊粉和低聚果糖，乳双歧杆菌A最终的OD值可以达到1.45[8-11]。
2.2 风味发酵乳货架期的跟踪监测
从上述数据可以看出，添加鼠李糖乳杆菌A的风味发酵乳，随着货架期时间的延长，乳清析出比较明显，pH和酸度升高明显，同时伴随而来的就是感官评价分数的降低。在保质期第21天，酸度达到114，pH也降低至4.2，而感官评价分数更是低到56分。根据以上结论，在风味发酵乳产品设计及开发中，使用乳双歧杆菌会容易得到优秀的产品，尽量避免使用鼠李糖乳杆菌A。
2.3 益生菌固体饮料产品的开发
众所周知，目前市面上益生菌产品多以麦芽糊精作为基地，添加其他原料复合制备成益生菌固体饮料。本产品显著区别于市售产品，使用新西兰特制的低水分活度的脱脂粉，让对水分活度非常敏感的益生菌，可以在低水分活度条件下依然可以在整个货架期内具有较好的活力。
3 结论
经过本次实验，在产品开发过程中，针对益生菌（乳双歧杆菌A和鼠李糖乳杆菌A），推荐使用低聚果糖和低聚半乳糖进行益生菌的增殖，但是在风味发酵乳产品开发中，不建议选择鼠李糖乳杆菌A作为益生菌添加于产品中。在二者组合的益生菌固体饮料产品中，控制好原材料的水分活度是保证其活菌数的关键因素。
参考文献：
1.Gregor R. The Scientific Basis for Probiotic Strian of Lactobacillus[J].Applied and Enviomentai Microbiology，1999，Vol.65（9）：3763-3766
2.Schrezenmeir J，de Vrese M.Probiotics and symbiotica-approaching a definition [J].American Society for clinical Nutrition，2001，Vol.73 3.Granata L A.Improved caid，flavour and volatile compound production in a high protein and fiber soymilk yoghurt-like product [J].Food Science，1996，Vol.61（2）：331-336
4.Bosscher， D.， Van Loo， J. and Franck， A. （2006） Inulin and oligofructose as prebiotics in the prevention of intestinal infections and diseases. Nutr Res Rev 19， 216–226.
5.Ben， X.M.J.， Li， Z.T.， Feng， S.Y.， Shi， D.， Chen， R. and Zhou， X.Y. （2008） Low level of galacto-oligosaccharide in infant formula stimulates growth of intestinal Bififidobacteria and
Lactobacilli. World J Gastroenterol 14， 6564–6568.
6.Berger， B.， Pridmore， R.D.， Barretto， C.， Delmas-Julien， F.， Schreiber， K.， Arigoni， F. and Brussow， H. （2007） Similarity and differences in the Lactobacillus acidophilus group identifified by polyphasic analysis and comparative genomics. J Bacteriol 189， 1311–1321.
7.Bode， L. （2009） Human milk oligosaccharides： prebiotics and beyond. Nutr Rev 67（Suppl 2）， S183–191.
8.（Panesar and Kumari 2011）Panesar， P.S. and Kumari， S. （2011） Lactulose： production，
， purifification and potential applications. Biotechnol Adv 6
9. Bosscher， D.， Van Loo， J. and Franck， A. （2006） Inulin and oligofructose as prebiotics in the prevention of intestinal infections and diseases. Nutr Res Rev 19， 216–226.
10.Coulier， L.， Timmermans， J.， Bas， R.， Van Den Dool， R.， Haaksman， I.， Klarenbeek， B.， Slaghek， T. and Van Dongen， W. （2009） In-depth characterization of prebiotic galacto-oligosaccharides by a combination of analytical techniques. J Agric Food Chem 57， 8488–8495.
11. Davis， L.M.， Mart?nez， I.， Walter， J. and Hutkins， R. （2010） A dose dependent impact of prebiotic galactooligosaccharides on the intestinal microbiota of healthy adults. Int J Food Microbiol 144， 285–292.
恒天然商貿（上海）有限公司
【关键词】益生菌;益生元;风味发酵乳;发酵特性;固体饮料
【Abstract】： The basic fermentation characteristics of different commercially available probiotics were studied， different prebiotics were selected， and the probiotics were proliferated separately. After verification， fructooligosaccharides and galactose were selected as prebiotics to conduct the fermentation research of flavored fermented milk. The results showed that fructooligosaccharides and galactooligosaccharides have a good proliferation effect on Bifidobacterium lactis A and Lactobacillus rhamnosus A. In the research of flavored fermented milk， it is found that Bifidobacterium lactis does not participate in the post-ripening of flavored fermented milk and the product flavor changes little， while the addition of Lactobacillus rhamnosus will significantly affect the after-acidity of flavored fermented milk， resulting in product degradation. The increase in acidity and pH value affects the taste of products at the end of the shelf life. Therefore， in the field of flavored fermented milk， Bifidobacterium lactis is selected as a probiotic addition. Bifidobacterium lactis A and Lactobacillus rhamnosus A are used in solid beverages， using skim powder with low water activity as the base material， which makes the final product significantly different from the commercially products. After mixed in warm water， it has the same taste just like an bottle of skim powder and the water activity is always below 0.25 during the whole shelf life.
【Key words】： probiotics; prebiotics; flavor fermented milk; fermented character; solid beverage
益生菌是一类活的微生物，当摄入充足的数量时，会对宿主产生一种有论证的功能性健康益处[1-2]。目前，益生菌的功效主要集中在下面几个方向：如调节肠道菌群功能、提升免疫力、等等[3]。益生元是益生菌的食物，益生元是一种可选择性发酵的食物原料，对肠道微生態的组成和活性产生特别的作用，从而对宿主产生健康的有益影响。所有的益生元都是膳食纤维，但不是所有的膳食纤维都是益生元[4-5]。本实验在体外通过分光光度计的方法，选择市售不同的益生菌与常用益生元，分别进行培养基培养，使用OD60的方法测试不同的益生元对不同的益生菌类别增殖效果的研究。将目标益生菌即乳双歧杆菌A和鼠李糖乳杆菌A分别进行风味发酵乳的发酵实验，观察并且测定产品在货架期内的口感变化和质构变化，评估筛选适合于风味发酵乳产品使用的益生菌。并将其作为组合，共同开发一款不同于常规产品的益生菌产品，此款产品使用低水分活度的脱脂粉，进行干法混合，在货架期内具有较好的活性及质量
1.材料与方法
1.1材料与仪器
1.1.1 实验材料：益生菌（乳双歧杆菌A、鼠李糖乳杆菌A、乳双歧杆菌BB12、嗜酸乳杆菌NCFM、鼠李糖乳杆菌LGG）、益生元（低聚果糖、低聚半乳糖、菊粉）、生牛乳、白砂糖、嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌、脱脂粉、商业用MRS培养基。 1.1.2 实验仪器：分析天平、恒温水浴锅、恒温培养箱、烧杯、Mettler pH计、紫外分光光度计、磷酸盐缓冲液
1.2实验方法
1.2.1 单因素实验设计如下：
将益生元按照2%添加于改良的MRS培养基种，以此做为对照组。实验组选择不同的益生菌和益生元，形成15组样品分别进行紫外分光光度计OD600的测定，菌种培养条件选择37℃，48h培养。
1.2.2 将乳双歧杆菌A和鼠李糖乳杆菌A分别做为益生菌制备风味发酵乳，测定产品在货架期内的pH，滴定酸度的变化数据，并进行感官评定。
1.2.2.1 风味发酵乳生产工艺流程：
配料→均质→杀菌→接种发酵→灌装→冷藏后熟
配料：将鲜牛乳进行升温至50℃，加入白砂糖8%、低聚半乳糖2%，55℃保温水合30 min。
均质：温度65℃，压力20 MPa。
杀菌：95 ℃，5 min。
接种发酵：冷却至40℃，接種酸奶发酵剂，搅拌使菌粉混合均匀，置于40℃恒温箱内发酵至pH值到达4.5，滴定酸度达到70度。
灌装：将酸奶经过乳化泵乳化后灌装于酸奶杯中，快速冷却至15℃。
冷藏后熟：4-6 ℃，冷藏后熟24h。
权重 评分标准
色泽 10 10-6（乳白色，浊度高） 5-1（有发黄等异常颜色，浊度低）
乳清析出 20 20-17（无析出，微量析出） 16-11（少量析出） 10-5（析出较多） 4-1（严重析出）
粘稠度 20 20-17（粘度适中，口感浓厚） 16-11（口感略显稀薄） 10-5（口感较稀薄） 4-1（口感很稀）
顺滑感、奶香味 20 20-17（顺滑爽口，奶油感强） 16-11（顺滑感和奶香味略弱） 10-5（顺滑度和奶香味较差，有粉感或颗粒感） 4-1（不顺滑，颗粒感和粉感严重）
酸甜度 20 20-17（酸甜适中） 16-11（稍甜或酸） 10-5（较甜或酸） 4-1（过甜或酸）
酸奶特征风味 10 10-9（酸奶特征风味明显） 8-6（特征风味略淡） 5-3（特征风味淡或有异味） 2-1（异味明显）
1.2.2.2 货架期产品的检测及感官评定
分别于产品生产后24h、48h、72h、7天、14天、21天测定产品的pH值，滴定酸度及感官评定。
感官测试：请 10 位感官正常、经过训练有经验的人组成评定小组，对不同益生菌添加的风味发酵乳进行综合的感官评价，评分标准见下表：
1.2.3 益生菌固体饮料产品的开发
选择新西兰进口低水分活度脱脂乳粉与益生菌粉混合制备成为固体饮料，在货架期的第1天、3个月、6个月、9个月、12个月、15个月与18个月分别测定产品的水分活度，并在货架期的初始及第18个月测定产品中的益生菌总数量。
2 结果与分析
2.1 益生元的筛选与OD600增殖数据结果如下：
从以上结果可以得出，所有的益生元都可以增殖益生菌。
乳杆菌增殖结果，三株乳杆菌在培养48h后，OD值均大于0.7，但是在添加低聚半乳糖的培养基中增长效果更显著。但是在添加菊粉的培养基中，增殖效果并没有这么明显。LGG在含有低聚糖和低聚果糖的培养基中增殖效果更显著，这与Pansear 文献描述一致[6-7]。
940–948.嗜酸乳杆菌NCFM，相较于添加低聚半乳糖的培养基中，其在添加低聚果糖的培养基中会有更好的增殖（1.38 和 0.865）。从结果也可以看出来，双歧杆菌属的两株菌相较于乳杆菌来说，均可以较好的利用本实验中的三中益生元来进行增殖，并且同样可以看出，双歧杆菌属可以较好的利用低聚半乳糖相比较于菊粉和低聚果糖，乳双歧杆菌A最终的OD值可以达到1.45[8-11]。
2.2 风味发酵乳货架期的跟踪监测
从上述数据可以看出，添加鼠李糖乳杆菌A的风味发酵乳，随着货架期时间的延长，乳清析出比较明显，pH和酸度升高明显，同时伴随而来的就是感官评价分数的降低。在保质期第21天，酸度达到114，pH也降低至4.2，而感官评价分数更是低到56分。根据以上结论，在风味发酵乳产品设计及开发中，使用乳双歧杆菌会容易得到优秀的产品，尽量避免使用鼠李糖乳杆菌A。
2.3 益生菌固体饮料产品的开发
众所周知，目前市面上益生菌产品多以麦芽糊精作为基地，添加其他原料复合制备成益生菌固体饮料。本产品显著区别于市售产品，使用新西兰特制的低水分活度的脱脂粉，让对水分活度非常敏感的益生菌，可以在低水分活度条件下依然可以在整个货架期内具有较好的活力。
3 结论
经过本次实验，在产品开发过程中，针对益生菌（乳双歧杆菌A和鼠李糖乳杆菌A），推荐使用低聚果糖和低聚半乳糖进行益生菌的增殖，但是在风味发酵乳产品开发中，不建议选择鼠李糖乳杆菌A作为益生菌添加于产品中。在二者组合的益生菌固体饮料产品中，控制好原材料的水分活度是保证其活菌数的关键因素。
参考文献：
1.Gregor R. The Scientific Basis for Probiotic Strian of Lactobacillus[J].Applied and Enviomentai Microbiology，1999，Vol.65（9）：3763-3766
2.Schrezenmeir J，de Vrese M.Probiotics and symbiotica-approaching a definition [J].American Society for clinical Nutrition，2001，Vol.73 3.Granata L A.Improved caid，flavour and volatile compound production in a high protein and fiber soymilk yoghurt-like product [J].Food Science，1996，Vol.61（2）：331-336
4.Bosscher， D.， Van Loo， J. and Franck， A. （2006） Inulin and oligofructose as prebiotics in the prevention of intestinal infections and diseases. Nutr Res Rev 19， 216–226.
5.Ben， X.M.J.， Li， Z.T.， Feng， S.Y.， Shi， D.， Chen， R. and Zhou， X.Y. （2008） Low level of galacto-oligosaccharide in infant formula stimulates growth of intestinal Bififidobacteria and
Lactobacilli. World J Gastroenterol 14， 6564–6568.
6.Berger， B.， Pridmore， R.D.， Barretto， C.， Delmas-Julien， F.， Schreiber， K.， Arigoni， F. and Brussow， H. （2007） Similarity and differences in the Lactobacillus acidophilus group identifified by polyphasic analysis and comparative genomics. J Bacteriol 189， 1311–1321.
7.Bode， L. （2009） Human milk oligosaccharides： prebiotics and beyond. Nutr Rev 67（Suppl 2）， S183–191.
8.（Panesar and Kumari 2011）Panesar， P.S. and Kumari， S. （2011） Lactulose： production，
， purifification and potential applications. Biotechnol Adv 6
9. Bosscher， D.， Van Loo， J. and Franck， A. （2006） Inulin and oligofructose as prebiotics in the prevention of intestinal infections and diseases. Nutr Res Rev 19， 216–226.
10.Coulier， L.， Timmermans， J.， Bas， R.， Van Den Dool， R.， Haaksman， I.， Klarenbeek， B.， Slaghek， T. and Van Dongen， W. （2009） In-depth characterization of prebiotic galacto-oligosaccharides by a combination of analytical techniques. J Agric Food Chem 57， 8488–8495.
11. Davis， L.M.， Mart?nez， I.， Walter， J. and Hutkins， R. （2010） A dose dependent impact of prebiotic galactooligosaccharides on the intestinal microbiota of healthy adults. Int J Food Microbiol 144， 285–292.
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