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摘 要：针对现有生物化学实验“DNS法测定植物组织中还原糖及总糖含量”中的一些不足进行改进，包括实验材料选择、波长选择、DNS量、显色时间、DNS的配制等方面，最后对实验中一些注意事项进行了详细分析，以提高该实验的教学效果。
关键词：DNS法；实验教学；还原糖；改进
中图分类号 Q547 文献标识码 B 文章编号 1007-7731（2013）11-16-02
3，5-二硝基水杨酸法（DNS法）是在碱性条件下，DNS与还原糖加热后被还原成橘红色氨基化合物，然后比色测定糖含量。该法可测定还原糖和总糖含量，并可通过多糖=总糖-还原糖，粗略获得多糖含量。相比之下，该方法具有操作简便、快速、灵敏度高、杂质干扰较小等优点[1-9]。
“DNS法测定植物组织中还原糖及总糖含量”实验涉及了一些基本的生物化学实验技能，如组织捣碎（或研磨）、离心技术、定容操作、比色测定及标准曲线绘制等。该实验能有效提高学生的基本操作技能和动手能力，同时能将理论知识与实际应用很好地结合在一起。实验的学时及难度适中，在生物化学实验中是一项很好的综合性实验。
笔者根据多年来实验教学经验总结，现对该实验相关步骤进行改进，并对实验中值得注意的地方进行详细总结，以提高其教学效果。
1 方法改进
1.1 实验材料选择 多数生物化学实验教材中的该实验对象为淀粉[1-5]。淀粉作为实验材料的缺点主要有：（1）还原糖含量一般很低（如红薯淀粉）；（2）不同淀粉的还原糖含量也不一样；（3）材料本身缺乏可操作性等。本着材料来源容易，还原糖含量高，色素影响小，易提取，能有效提高学生的动手能力和激发实验兴趣，理论与实际应用有效结合等各方面的因素，结合多年来的实验经验积累，认为白薯（又名“地瓜”）为最佳实验材料。
1.2 波长选择 考虑到DNS显色液的影响、葡萄糖标准曲线的线性和最大吸收值等相关因素[6，10-11]，多年来本科实验教学结果证明520nm为最适测定波长。实验过程中要提醒学生，比色测定时首先要准确调好波长，在测量时就不能再调了，更不能更换分光光度计。
1.3 DNS添加量 DNS的量与待测液中还原糖的含量有关。DNS过多会使其吸光度增大，从而影响标准曲线的线性关系[10]。实验证明，添加3mL的DNS较适宜，还原糖含量与吸光值之间的线性较好。
1.4 显色时间的选择 实验证明，显色5min以上，其吸光值已基本趋于稳定[10-11]。考虑到教学实验过程中，有时水浴温度未达到或接近沸水浴等因素，故建议显色时间设定为6～8min。实验中所有水浴对象的沸水浴时间要保持统一。
1.5 DNS试剂的配制 DNS试剂中酒石酸钾钠的作用是防止溶解氧的侵入（DNS与还原糖反应是一种氧化还原反应，随着氧在待测液中溶解量的增加，显色液的吸光值呈现明显的下降趋势）；苯酚是增加DNS显色后的颜色深度，以及平衡脲形成时对糖测定的影响；亚硫酸氢钠与苯酚配合使显色后颜色更加稳定；碱性环境是DNS与还原糖显色作用的条件[10]。
配制方法：把DNS加入到氢氧化钠溶液中，（下转26页）（上接16页）加热搅拌待其完全溶解后，加入已溶解的酒石酸钾钠溶液并混匀，再加入苯酚和亚硫酸氢钠，贮存于棕色试剂瓶中。
2 注意事项分析
实验过程中一些细节问题值得注意，如：（1）现在的实验室条件都普遍提高了，可以考虑选择组织捣碎机或匀浆机代替手工研磨实验材料，这样可以从很大程度上减少实验误差；（2）除去提取的糖溶液中杂质可采用4 000r/min，离心5min；（3）比色皿要使用同一厂家生产的且为同一型号的，比色皿的清洁度无疑是实验误差的主要因素，比色皿的清洗可以先用小镊子夹酒精棉球里外擦净，然后再用蒸馏水里外冲洗3遍。（4）控制好待测液吸光值在标准曲线范围以内，浓度过高要进行稀释；（5）比色测定前需自然冷却至室温，切勿骤冷而导致溶液浑浊，同时，测定时溶液要混匀；（6）因多糖水解成单糖时，每断裂1个糖苷键需加入1个水分子，故在计算总糖含量时，需将测得的单糖量乘以0.9加以校正；（7）实验过程中注意DNS的污染。
参考文献
[1]袁道强，黄建华.生物化学实验和技术[M].北京： 中国轻工业出版社，2006.
[2]郭蔼光，郭泽坤.生物化学实验技术[M].北京： 高等教育出版社，2007.
[3]陈钧辉.生物化学实验[M]. 第四版.北京： 科学出版社，2008.
[4]赵永芳.生物化学技术原理及应用[M].北京： 科学出版社，2008.
[5]魏群.基础生物化学实验[M].第三版.北京： 高等教育出版社，2009.
[6]王俊丽，聂国兴，李素贞，等.DNS法测定还原糖含量时最适波长的确定[J].河南农业科学，2010（4）： 115-118.
[7]王丽娜，陈水钫，张兵.3，5-二硝基水杨酸法测定多糖含量的研究进展[J].吉林医药学院学报，2009，30（4）： 232-234.
[8]梁存权.比色法测定植物多糖含量方法概述[J].北方药学，2011，8（12）： 4，68.
[9]徐晓飞，陈健.多糖含量测定的研究进展[J].食品科学，2009，30（21）： 443-446.
[10]管斌，丁友昉，谢来苏，等.还原糖测定方法的规范[J].无锡轻工大学学报，1999，18（3）： 74-79.
[11]宋占午，王莱，刘艳玲，等.3，5-二硝基水杨酸测定还原糖含量的条件探讨[J].西北师范大学学报：自然科学版，1997，33（2）： 52-54.
（责编：徐世红）
关键词：DNS法；实验教学；还原糖；改进
中图分类号 Q547 文献标识码 B 文章编号 1007-7731（2013）11-16-02
3，5-二硝基水杨酸法（DNS法）是在碱性条件下，DNS与还原糖加热后被还原成橘红色氨基化合物，然后比色测定糖含量。该法可测定还原糖和总糖含量，并可通过多糖=总糖-还原糖，粗略获得多糖含量。相比之下，该方法具有操作简便、快速、灵敏度高、杂质干扰较小等优点[1-9]。
“DNS法测定植物组织中还原糖及总糖含量”实验涉及了一些基本的生物化学实验技能，如组织捣碎（或研磨）、离心技术、定容操作、比色测定及标准曲线绘制等。该实验能有效提高学生的基本操作技能和动手能力，同时能将理论知识与实际应用很好地结合在一起。实验的学时及难度适中，在生物化学实验中是一项很好的综合性实验。
笔者根据多年来实验教学经验总结，现对该实验相关步骤进行改进，并对实验中值得注意的地方进行详细总结，以提高其教学效果。
1 方法改进
1.1 实验材料选择 多数生物化学实验教材中的该实验对象为淀粉[1-5]。淀粉作为实验材料的缺点主要有：（1）还原糖含量一般很低（如红薯淀粉）；（2）不同淀粉的还原糖含量也不一样；（3）材料本身缺乏可操作性等。本着材料来源容易，还原糖含量高，色素影响小，易提取，能有效提高学生的动手能力和激发实验兴趣，理论与实际应用有效结合等各方面的因素，结合多年来的实验经验积累，认为白薯（又名“地瓜”）为最佳实验材料。
1.2 波长选择 考虑到DNS显色液的影响、葡萄糖标准曲线的线性和最大吸收值等相关因素[6，10-11]，多年来本科实验教学结果证明520nm为最适测定波长。实验过程中要提醒学生，比色测定时首先要准确调好波长，在测量时就不能再调了，更不能更换分光光度计。
1.3 DNS添加量 DNS的量与待测液中还原糖的含量有关。DNS过多会使其吸光度增大，从而影响标准曲线的线性关系[10]。实验证明，添加3mL的DNS较适宜，还原糖含量与吸光值之间的线性较好。
1.4 显色时间的选择 实验证明，显色5min以上，其吸光值已基本趋于稳定[10-11]。考虑到教学实验过程中，有时水浴温度未达到或接近沸水浴等因素，故建议显色时间设定为6～8min。实验中所有水浴对象的沸水浴时间要保持统一。
1.5 DNS试剂的配制 DNS试剂中酒石酸钾钠的作用是防止溶解氧的侵入（DNS与还原糖反应是一种氧化还原反应，随着氧在待测液中溶解量的增加，显色液的吸光值呈现明显的下降趋势）；苯酚是增加DNS显色后的颜色深度，以及平衡脲形成时对糖测定的影响；亚硫酸氢钠与苯酚配合使显色后颜色更加稳定；碱性环境是DNS与还原糖显色作用的条件[10]。
配制方法：把DNS加入到氢氧化钠溶液中，（下转26页）（上接16页）加热搅拌待其完全溶解后，加入已溶解的酒石酸钾钠溶液并混匀，再加入苯酚和亚硫酸氢钠，贮存于棕色试剂瓶中。
2 注意事项分析
实验过程中一些细节问题值得注意，如：（1）现在的实验室条件都普遍提高了，可以考虑选择组织捣碎机或匀浆机代替手工研磨实验材料，这样可以从很大程度上减少实验误差；（2）除去提取的糖溶液中杂质可采用4 000r/min，离心5min；（3）比色皿要使用同一厂家生产的且为同一型号的，比色皿的清洁度无疑是实验误差的主要因素，比色皿的清洗可以先用小镊子夹酒精棉球里外擦净，然后再用蒸馏水里外冲洗3遍。（4）控制好待测液吸光值在标准曲线范围以内，浓度过高要进行稀释；（5）比色测定前需自然冷却至室温，切勿骤冷而导致溶液浑浊，同时，测定时溶液要混匀；（6）因多糖水解成单糖时，每断裂1个糖苷键需加入1个水分子，故在计算总糖含量时，需将测得的单糖量乘以0.9加以校正；（7）实验过程中注意DNS的污染。
参考文献
[1]袁道强，黄建华.生物化学实验和技术[M].北京： 中国轻工业出版社，2006.
[2]郭蔼光，郭泽坤.生物化学实验技术[M].北京： 高等教育出版社，2007.
[3]陈钧辉.生物化学实验[M]. 第四版.北京： 科学出版社，2008.
[4]赵永芳.生物化学技术原理及应用[M].北京： 科学出版社，2008.
[5]魏群.基础生物化学实验[M].第三版.北京： 高等教育出版社，2009.
[6]王俊丽，聂国兴，李素贞，等.DNS法测定还原糖含量时最适波长的确定[J].河南农业科学，2010（4）： 115-118.
[7]王丽娜，陈水钫，张兵.3，5-二硝基水杨酸法测定多糖含量的研究进展[J].吉林医药学院学报，2009，30（4）： 232-234.
[8]梁存权.比色法测定植物多糖含量方法概述[J].北方药学，2011，8（12）： 4，68.
[9]徐晓飞，陈健.多糖含量测定的研究进展[J].食品科学，2009，30（21）： 443-446.
[10]管斌，丁友昉，谢来苏，等.还原糖测定方法的规范[J].无锡轻工大学学报，1999，18（3）： 74-79.
[11]宋占午，王莱，刘艳玲，等.3，5-二硝基水杨酸测定还原糖含量的条件探讨[J].西北师范大学学报：自然科学版，1997，33（2）： 52-54.
（责编：徐世红）