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摘要：目的 觀察山茱萸环烯醚萜苷对血管性痴呆（VD）大鼠学习记忆能力和脑组织病理变化的影响，探讨其相关机制。方法 SD大鼠随机分为假手术组、模型组、阳性药组和山茱萸环烯醚萜苷低、中、高剂量组。采用永久性双侧颈总动脉结扎（2VO）手术造模，术后6 h开始灌胃给药，每日1次，共3个月。Morris水迷宫实验检测大鼠空间学习记忆能力，物体识别实验评价大鼠识别记忆能力。免疫组化染色检测脑组织存活神经元和胆碱乙酰基转移酶（ChAT）表达。结果 永久性2VO术后3个月，模型组大鼠逃避潜伏期延长，识别指数降低，海马和大脑皮层NeuN阳性神经元存活数减少，ChAT表达降低；与模型组比较，山茱萸环烯醚萜苷各剂量组大鼠逃避潜伏期缩短，识别指数升高，海马和大脑皮层NeuN阳性神经元存活数增多，海马ChAT表达升高。结论 山茱萸环烯醚萜苷通过保护神经元和促进ChAT表达从而改善VD大鼠的认知功能障碍。
关键词：山茱萸环烯醚萜苷；双侧颈总动脉结扎；血管性痴呆；认知功能障碍；神经元存活；胆碱乙酰基转移酶；大鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.06.014
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2018）06-0056-05
Effects of Cornel Iridoid Glycoside on Learning-memory Ability and Brain Pathological Changes in Vascular Dementia Rats
MENG Min， YANG Cui-cui， ZHANG Li， LI Ya-li， ZHANG Lan， LI Lin
Department of Pharmacy， Xuanwu Hospital of Capital Medical University， Beijing Engineering Research Center for Nervous System Drugs， Key Laboratory for Neurodegenerative Diseases of Ministry of Education， Beijing 100053， China
Abstract： Objective To investigate the effects of cornel iridoid glycoside （CIG） on the learning-memory ability and pathological changes in the brain of vascular dementia （VD） rats； To discuss relevant mechanism of action. Methods SD rats were randomly divided into sham-operation group， model group， positive medicine group， CIG groups low-， medium- and high-dose groups. The animal model of VD was replicated by permanent bilateral common carotid artery occlusion （2VO） in rats. Drugs were intragastrically administered 6 h after surgery and then once a day for 3 months. Morris water maze test was used to detect spatial learning-memory ability， and recognition memory was measured by the object recognition test. Immunohistochemical staining was used to detect the neuronal survival and the expression of choline acetyltransferase （ChAT） in the brain. Results Three months after permanent 2VO operation， the model rats showed a longer escape latency in Morris water maze， a lower discrimination index in the object recognition test， and a decrease in NeuN positive neuronal survival and ChAT expression in the hippocampus and cerebral cortex. Compared with the model group， intragastric administration of CIG for 3 months shortened the escape latency in Morris water maze， elevated the discrimination index in the object recognition test， and increased the NeuN positive neuronal survival in the hippocampus and cerebral cortex and ChAT expression of 2VO rats. Conclusion CIG can improve the cognitive impairment of VD model rats through protecting neurons and promoting ChAT expression. Keywords： corneliridoid glycoside； bilateral common carotid artery ligation； vascular dementia； cognitive impairment； neuronal survival； choline acetyltransferase； rats
血管性痴呆（vascular dementia，VD）是由缺血性卒中、出血性卒中及造成记忆、认知和行为等脑区低灌注脑血管疾病所致的严重认知功能障碍综合征。大鼠永久性双侧颈总动脉结扎（bilateral common carotid artery ligation，2VO）致慢性脑血流灌注不足模型能很好地模拟人VD中认知功能障碍和神经元死亡等病理变化。山茱萸环烯醚萜苷（cornel iridoid glycoside，CIG）是从传统补肾中药山萸肉中提取的有效组分。本课题组以往研究表明，CIG能改善局灶性脑缺血大鼠模型的神经功能缺损，抑制脑组织炎症和神经元凋亡，促进神经发生和血管新生[1-2]；并可改善穹窿-海马伞切断模型大鼠学习记忆功能，增高脑组织神经营养因子含量和神经元存活[3]。本实验采用永久性2VO大鼠模型模拟VD，观察CIG对该模型学习记忆功能和脑组织神经元存活的影响。
1 材料与方法
1.1 动物
SPF级雄性SD大鼠90只，体质量260～280 g，北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号SCXK（京）2012-0001。饲养于SPF级屏障环境，室温20～25 ℃，相对湿度50%～70%，12 h光照，自由摄食饮水。
1.2 药物
CIG，本研究室从山萸肉中提取，纯度70%；尼莫地平，正大青春宝药业有限公司，批号20151126。
1.3 主要试剂与仪器
抗NeuN抗体，Abcam公司（ab177487）；抗胆碱乙酰基转移酶（ChAT）抗体，博士德公司（BA0596）；生物素标记的抗兔IgG，中杉金桥公司；辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素，Vector Laboratories公司；DAB显色试剂盒，西雅金桥公司。Morris水迷宫，中国医学科学院药物研究所；冰冻切片机，Thermo公司；生物显微镜，Olympus公司。
1.4 造模
待大鼠体质量达到300 g，进行永久性2VO手术。10%水合氯醛（4 mL/kg）腹腔注射麻醉，行颈正中切口，游离双侧颈总动脉，结扎，涂抹青霉素粉末并缝合伤口。假手术组仅分离双侧颈总动脉不结扎。
1.5 分组及给药
实验大鼠随机分为假手术组（17只）、模型组（14只）、阳性药组（16 mg/kg，14只）和CIG低劑量组（30 mg/kg，15只）、CIG中剂量组（60 mg/kg，16只）、CIG高剂量组（120 mg/kg，14只），各给药组造模术后6 h开始给予相应药物灌胃，假手术组和模型组给予等量蒸馏水灌胃。给药体积1 mL/100 g，每日1次，共3个月。实验过程动物死亡假手术组6只、模型组2只、CIG低剂量组2只、CIG中剂量组4只、CIG高剂量组1只和阳性药组2只。除假手术组1只因牙齿过长戳破口腔死亡，1只为同笼互相打斗致死外，其余动物均为麻醉死亡或手术后遗症（肠梗阻、术后出血）死亡。
1.6 Morris水迷宫实验
水迷宫直径200 cm，水深30 cm，水温（20±3）℃，水面平均分成4个象限。根据Vorhees C V等[4]方法，每日每只大鼠训练2次，120 s/次，共5 d，平台放置在任意象限，平台位于水下1.5 cm，选取平台邻象限和对象限作为入水点，记录大鼠在120 s内寻找到平台的时间（逃避潜伏期）。
1.7 物体识别实验
将大鼠旷场箱隔离成2个等大的箱子，长80 cm、宽40 cm、高40 cm，根据文献[5]方法，实验分3部分，适应期：第1日，将大鼠放入箱中，箱中不放任何物体，10 min/只；熟悉期：第2日，在箱中放入2个相同物体（A，A’），记录大鼠对2个物体的关注时间（以鼠嘴的方向对着物体，凑近约2 cm范围内计时，鼠趴在物体上或者只在物体附近走动则不能计时[6]）；测试期：第3日，将其中一个物体换成新物体，记录大鼠对新、旧物体的关注时间，计算识别指数。识别指数为大鼠关注新旧物体时间差与关注新旧物体时间和的比值。每只大鼠实验结束后，用消毒液清洁盒子和物品，消除气味。
1.8 取材
每组取4只大鼠，10%水合氯醛（4 mL/kg）腹腔注射麻醉。麻醉后开胸，剪开心包膜，暴露心脏和主动脉弓。用钝头针头插入左心室至主动脉弓，灌注0.9%氯化钠注射液200 mL，经体循环和肺循环冲洗全身血管，待右心耳流出液无色透明时，灌注4%多聚甲醛200 mL，至大鼠全身僵硬。灌注后2 h，开颅取脑，固定，冰冻，取冠状位，连续切片（厚40 μm）。
1.9 免疫组化检测
每组取4只大鼠，每只取3张脑片，所选切片于3%H2O2室温孵育30 min，PBST洗3次×5 min，加入10%羊血清，室温孵育30 min，倾去。滴加抗NeuN抗体（1∶200）或抗ChAT抗体（1∶200），4 ℃过夜；PBST洗3次，每次5 min。加生物素标记抗兔IgG工作液，37 ℃孵育1 h，PBST洗3次×5 min。加适量过氧化物酶标记的链霉卵白素，37 ℃孵育1 h，PBST洗3次×5 min。DAB显色，自来水终止显色，晾干后，二甲苯透明，中性树脂封片。
1.10 统计学方法
采用SPSS20.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，组间比较用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。 2 結果
2.1 山茱萸环烯醚萜苷对模型大鼠学习记忆能力的影响
2.1.1 Morris水迷宫实验结果
随训练时间增加，逃避潜伏期呈逐渐缩短趋势；第4、5日，模型组大鼠逃避潜伏期较假手术组明显延长（P<0.05）；CIG各剂量组大鼠逃避潜伏期较模型组明显缩短，差异有统计学意义（P<0.01）。结果见表1。
2.1.2 物体识别实验结果
在熟悉期所有大鼠对2物体均无偏好；在测试期模型组识别指数较假手术组明显降低（P<0.01），CIG各剂量组大鼠识别指数较模型组明显升高，差异有统计学意义（P<0.01）。结果见表2。
2.2 山茱萸环烯醚萜苷对模型大鼠脑组织神经元存活的影响
模型组大鼠大脑皮层和海马NeuN阳性神经元数较假手术组明显减少，差异有统计学意义（P<0.05）；CIG各剂量组大鼠大脑皮层和海马NeuN阳性神经元数较模型组明显增加，差异有统计学意义（P<0.05）。结果见表3、图1和图2。
2.3 山茱萸环烯醚萜苷对模型大鼠海马胆碱乙酰基转移酶表达的影响
模型组大鼠海马CA1区ChAT阳性神经元数较假手术组明显减少，差异有统计学意义（P<0.05）；CIG各剂量组大鼠海马CA1区ChAT阳性神经元数较模型组明显增加，差异有统计学意义（P<0.05）。结果见表4、图3。
3 讨论
大鼠永久性2VO可引起慢性脑血流灌注不足，最终导致学习记忆功能障碍，与VD临床症状相似。Morris水迷宫实验是评价啮齿类动物空间学习记忆功能的重要手段。Morris水迷宫实验发现，2VO术后3个月，模型组大鼠出现空间学习记忆障碍，给予CIG可明显改善模型大鼠空间学习记忆能力。我们还应用物体识别实验检测大鼠的识别记忆功能，发现模型组识别指数较假手术组明显降低，CIG各剂量组识别指数显著升高。表明CIG能明显改善2VO模型大鼠的学习记忆功能，提示其可能有助于改善VD临床症状。
在2VO造成的VD模型中，由于缺血缺氧会导致神经元的损伤及死亡，这是VD主要病理改变[7-9]。本课题组以往应用尼氏染色方法检测的结果表明，大鼠2VO术后30 d，海马锥体细胞密度轻度减低；术后60 d，细胞核固缩深染，细胞密度显著减低，表明有大量的海马锥体细胞死亡[10]。近年来多用神经核标记物NeuN检测神经元的数量，进而确定神经元的损伤程度[11-12]。本实验免疫组化染色发现，2VO术后3个月，模型组大鼠大脑皮层和海马NeuN阳性神经元数明显减少，CIG能显著增加模型大鼠脑组织NeuN阳性神经元数，改善VD的病理变化，具有神经保护作用。本课题组以往研究表明，CIG能增高慢性局灶性脑缺血大鼠脑组织血管内皮生长因子和神经营养因子表达，促进神经发生和血管新生[2，13]；对于穹窿-海马伞切断模型大鼠，CIG能升高其脑组织神经营养因子含量，并且通过促进Bcl-2表达、抑制Bax和细胞色素C表达从而抑制细胞凋亡[3，14]。因此，我们推测CIG改善模型大鼠脑组织神经元存活机制可能与增加神经营养因子含量和抑制神经元细胞凋亡有关。
ChAT能促进乙酰胆碱的合成，而乙酰胆碱是促进学习记忆功能的主要神经递质，同时ChAT也可反映胆碱能系统的功能。本研究发现，2VO术后3个月，模型组大鼠海马区ChAT阳性细胞数显著减少，CIG干预后模型大鼠海马ChAT阳性神经元数明显增加，表明CIG能增加胆碱能神经元数，同时增加ChAT含量，促进乙酰胆碱合成，进而改善模型大鼠的学习记忆能力，为临床治疗VD提供依据。
参考文献：
[1] YA B， LI C， ZHANG L， et al. Cornel iridoid glycoside inhibits inflammation and apoptosis in brains of rats with focal cerebral ischemia[J]. Neurochemical Research，2010，35（5）：773-781.
[2] YAO R， ZHANG L， WANG W， et al. Cornel iridoid glycoside promotes neurogenesis and angiogenesis and improves neurological function after focal cerebral ischemia in rats[J]. Brain Research Bulletin，2009，79（1）：69-76.
[3] ZHAO L， DING Y， ZHANG L， et al. Cornel iridoid glycoside improves memory ability and promotes neuronal survival in fimbria–fornix transected rats[J]. European Journal of Pharmacology，2010， 647（1/2/3）：68-74.
[4] VORHEES C V， WILLIAMS M T. Morris water maze：procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory[J]. Nat Protoc，2006，1（2）：848-858.
[5] ENNACCEUR A， DELACOUR J. A new one-trial test for neurobiological studies of memory in rats 1：Behavioral data[J]. Behav Brain Res，1988，31（1）：47-59. [6] 宋广青，孙秀萍，刘新民.大鼠物体识别实验方法综述[J].中国比较医学杂志，2013，23（7）：55-60.
[7] MA Y， QU Y， FEI Z. Vascular endothelial growth factor in cerebral ischemia[J]. J Neurosci Res，2011，89（7）：969-978.
[8] FARKAS E， INSITITORIS A， DOMOKI F， et al. The effect of pre- and posttreatment with diazoxide on the early phase of chronic cerebral hypoperfusion in the rat[J]. Brain Res，2006，1087（1）：168-174.
[9] LIU J， JIN D， XIAO L， et al. Paeoniflorin attenuates chronic cerebral hypoperfusion-induced learning dysfunction and brain damage in rats[J]. Brain Res，2006，1089（1）：162-170.
[10] 刘汇波，叶翠飞，李斌，等.双侧颈总动脉结扎对大鼠学习记忆功能和海马组织形态学的影响[J].基础医学与临床，1998（4）：55-59.
[11] 张建，王雅丽，李佳，等.消栓肠溶胶囊对慢性脑低灌注大鼠皮层神经元损伤的影响[J].国际中医中药杂志，2016，38（2）：141-144.
[12] 龙建飞，张弛，张秋霞，等.黄连解毒汤有效部位对脑缺血大鼠半暗带神经元NeuN、Caspase-3、PARP表达的影响[J].北京中医药大学学报， 2014，37（2）：90-93，98，插1.
[13] 姚瑞芹，张如意，张丽，等.山茱萸环烯醚萜苷对局灶性脑缺血大鼠血管内皮生长因子及其受体表达的影响[J].中国脑血管病雜志，2009， 6（3）：134-138.
[14] 丁月霞，张丽，叶翠飞，等.山茱萸环烯醚萜苷对穹隆海马伞切断大鼠海马区神经元存活和细胞凋亡调控因子的影响[J].首都医科大学学报， 2011，32（1）：73-78.
（收稿日期：2017-12-19）
（修回日期：2018-01-08；编辑：华强）
关键词：山茱萸环烯醚萜苷；双侧颈总动脉结扎；血管性痴呆；认知功能障碍；神经元存活；胆碱乙酰基转移酶；大鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.06.014
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2018）06-0056-05
Effects of Cornel Iridoid Glycoside on Learning-memory Ability and Brain Pathological Changes in Vascular Dementia Rats
MENG Min， YANG Cui-cui， ZHANG Li， LI Ya-li， ZHANG Lan， LI Lin
Department of Pharmacy， Xuanwu Hospital of Capital Medical University， Beijing Engineering Research Center for Nervous System Drugs， Key Laboratory for Neurodegenerative Diseases of Ministry of Education， Beijing 100053， China
Abstract： Objective To investigate the effects of cornel iridoid glycoside （CIG） on the learning-memory ability and pathological changes in the brain of vascular dementia （VD） rats； To discuss relevant mechanism of action. Methods SD rats were randomly divided into sham-operation group， model group， positive medicine group， CIG groups low-， medium- and high-dose groups. The animal model of VD was replicated by permanent bilateral common carotid artery occlusion （2VO） in rats. Drugs were intragastrically administered 6 h after surgery and then once a day for 3 months. Morris water maze test was used to detect spatial learning-memory ability， and recognition memory was measured by the object recognition test. Immunohistochemical staining was used to detect the neuronal survival and the expression of choline acetyltransferase （ChAT） in the brain. Results Three months after permanent 2VO operation， the model rats showed a longer escape latency in Morris water maze， a lower discrimination index in the object recognition test， and a decrease in NeuN positive neuronal survival and ChAT expression in the hippocampus and cerebral cortex. Compared with the model group， intragastric administration of CIG for 3 months shortened the escape latency in Morris water maze， elevated the discrimination index in the object recognition test， and increased the NeuN positive neuronal survival in the hippocampus and cerebral cortex and ChAT expression of 2VO rats. Conclusion CIG can improve the cognitive impairment of VD model rats through protecting neurons and promoting ChAT expression. Keywords： corneliridoid glycoside； bilateral common carotid artery ligation； vascular dementia； cognitive impairment； neuronal survival； choline acetyltransferase； rats
血管性痴呆（vascular dementia，VD）是由缺血性卒中、出血性卒中及造成记忆、认知和行为等脑区低灌注脑血管疾病所致的严重认知功能障碍综合征。大鼠永久性双侧颈总动脉结扎（bilateral common carotid artery ligation，2VO）致慢性脑血流灌注不足模型能很好地模拟人VD中认知功能障碍和神经元死亡等病理变化。山茱萸环烯醚萜苷（cornel iridoid glycoside，CIG）是从传统补肾中药山萸肉中提取的有效组分。本课题组以往研究表明，CIG能改善局灶性脑缺血大鼠模型的神经功能缺损，抑制脑组织炎症和神经元凋亡，促进神经发生和血管新生[1-2]；并可改善穹窿-海马伞切断模型大鼠学习记忆功能，增高脑组织神经营养因子含量和神经元存活[3]。本实验采用永久性2VO大鼠模型模拟VD，观察CIG对该模型学习记忆功能和脑组织神经元存活的影响。
1 材料与方法
1.1 动物
SPF级雄性SD大鼠90只，体质量260～280 g，北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号SCXK（京）2012-0001。饲养于SPF级屏障环境，室温20～25 ℃，相对湿度50%～70%，12 h光照，自由摄食饮水。
1.2 药物
CIG，本研究室从山萸肉中提取，纯度70%；尼莫地平，正大青春宝药业有限公司，批号20151126。
1.3 主要试剂与仪器
抗NeuN抗体，Abcam公司（ab177487）；抗胆碱乙酰基转移酶（ChAT）抗体，博士德公司（BA0596）；生物素标记的抗兔IgG，中杉金桥公司；辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素，Vector Laboratories公司；DAB显色试剂盒，西雅金桥公司。Morris水迷宫，中国医学科学院药物研究所；冰冻切片机，Thermo公司；生物显微镜，Olympus公司。
1.4 造模
待大鼠体质量达到300 g，进行永久性2VO手术。10%水合氯醛（4 mL/kg）腹腔注射麻醉，行颈正中切口，游离双侧颈总动脉，结扎，涂抹青霉素粉末并缝合伤口。假手术组仅分离双侧颈总动脉不结扎。
1.5 分组及给药
实验大鼠随机分为假手术组（17只）、模型组（14只）、阳性药组（16 mg/kg，14只）和CIG低劑量组（30 mg/kg，15只）、CIG中剂量组（60 mg/kg，16只）、CIG高剂量组（120 mg/kg，14只），各给药组造模术后6 h开始给予相应药物灌胃，假手术组和模型组给予等量蒸馏水灌胃。给药体积1 mL/100 g，每日1次，共3个月。实验过程动物死亡假手术组6只、模型组2只、CIG低剂量组2只、CIG中剂量组4只、CIG高剂量组1只和阳性药组2只。除假手术组1只因牙齿过长戳破口腔死亡，1只为同笼互相打斗致死外，其余动物均为麻醉死亡或手术后遗症（肠梗阻、术后出血）死亡。
1.6 Morris水迷宫实验
水迷宫直径200 cm，水深30 cm，水温（20±3）℃，水面平均分成4个象限。根据Vorhees C V等[4]方法，每日每只大鼠训练2次，120 s/次，共5 d，平台放置在任意象限，平台位于水下1.5 cm，选取平台邻象限和对象限作为入水点，记录大鼠在120 s内寻找到平台的时间（逃避潜伏期）。
1.7 物体识别实验
将大鼠旷场箱隔离成2个等大的箱子，长80 cm、宽40 cm、高40 cm，根据文献[5]方法，实验分3部分，适应期：第1日，将大鼠放入箱中，箱中不放任何物体，10 min/只；熟悉期：第2日，在箱中放入2个相同物体（A，A’），记录大鼠对2个物体的关注时间（以鼠嘴的方向对着物体，凑近约2 cm范围内计时，鼠趴在物体上或者只在物体附近走动则不能计时[6]）；测试期：第3日，将其中一个物体换成新物体，记录大鼠对新、旧物体的关注时间，计算识别指数。识别指数为大鼠关注新旧物体时间差与关注新旧物体时间和的比值。每只大鼠实验结束后，用消毒液清洁盒子和物品，消除气味。
1.8 取材
每组取4只大鼠，10%水合氯醛（4 mL/kg）腹腔注射麻醉。麻醉后开胸，剪开心包膜，暴露心脏和主动脉弓。用钝头针头插入左心室至主动脉弓，灌注0.9%氯化钠注射液200 mL，经体循环和肺循环冲洗全身血管，待右心耳流出液无色透明时，灌注4%多聚甲醛200 mL，至大鼠全身僵硬。灌注后2 h，开颅取脑，固定，冰冻，取冠状位，连续切片（厚40 μm）。
1.9 免疫组化检测
每组取4只大鼠，每只取3张脑片，所选切片于3%H2O2室温孵育30 min，PBST洗3次×5 min，加入10%羊血清，室温孵育30 min，倾去。滴加抗NeuN抗体（1∶200）或抗ChAT抗体（1∶200），4 ℃过夜；PBST洗3次，每次5 min。加生物素标记抗兔IgG工作液，37 ℃孵育1 h，PBST洗3次×5 min。加适量过氧化物酶标记的链霉卵白素，37 ℃孵育1 h，PBST洗3次×5 min。DAB显色，自来水终止显色，晾干后，二甲苯透明，中性树脂封片。
1.10 统计学方法
采用SPSS20.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，组间比较用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。 2 結果
2.1 山茱萸环烯醚萜苷对模型大鼠学习记忆能力的影响
2.1.1 Morris水迷宫实验结果
随训练时间增加，逃避潜伏期呈逐渐缩短趋势；第4、5日，模型组大鼠逃避潜伏期较假手术组明显延长（P<0.05）；CIG各剂量组大鼠逃避潜伏期较模型组明显缩短，差异有统计学意义（P<0.01）。结果见表1。
2.1.2 物体识别实验结果
在熟悉期所有大鼠对2物体均无偏好；在测试期模型组识别指数较假手术组明显降低（P<0.01），CIG各剂量组大鼠识别指数较模型组明显升高，差异有统计学意义（P<0.01）。结果见表2。
2.2 山茱萸环烯醚萜苷对模型大鼠脑组织神经元存活的影响
模型组大鼠大脑皮层和海马NeuN阳性神经元数较假手术组明显减少，差异有统计学意义（P<0.05）；CIG各剂量组大鼠大脑皮层和海马NeuN阳性神经元数较模型组明显增加，差异有统计学意义（P<0.05）。结果见表3、图1和图2。
2.3 山茱萸环烯醚萜苷对模型大鼠海马胆碱乙酰基转移酶表达的影响
模型组大鼠海马CA1区ChAT阳性神经元数较假手术组明显减少，差异有统计学意义（P<0.05）；CIG各剂量组大鼠海马CA1区ChAT阳性神经元数较模型组明显增加，差异有统计学意义（P<0.05）。结果见表4、图3。
3 讨论
大鼠永久性2VO可引起慢性脑血流灌注不足，最终导致学习记忆功能障碍，与VD临床症状相似。Morris水迷宫实验是评价啮齿类动物空间学习记忆功能的重要手段。Morris水迷宫实验发现，2VO术后3个月，模型组大鼠出现空间学习记忆障碍，给予CIG可明显改善模型大鼠空间学习记忆能力。我们还应用物体识别实验检测大鼠的识别记忆功能，发现模型组识别指数较假手术组明显降低，CIG各剂量组识别指数显著升高。表明CIG能明显改善2VO模型大鼠的学习记忆功能，提示其可能有助于改善VD临床症状。
在2VO造成的VD模型中，由于缺血缺氧会导致神经元的损伤及死亡，这是VD主要病理改变[7-9]。本课题组以往应用尼氏染色方法检测的结果表明，大鼠2VO术后30 d，海马锥体细胞密度轻度减低；术后60 d，细胞核固缩深染，细胞密度显著减低，表明有大量的海马锥体细胞死亡[10]。近年来多用神经核标记物NeuN检测神经元的数量，进而确定神经元的损伤程度[11-12]。本实验免疫组化染色发现，2VO术后3个月，模型组大鼠大脑皮层和海马NeuN阳性神经元数明显减少，CIG能显著增加模型大鼠脑组织NeuN阳性神经元数，改善VD的病理变化，具有神经保护作用。本课题组以往研究表明，CIG能增高慢性局灶性脑缺血大鼠脑组织血管内皮生长因子和神经营养因子表达，促进神经发生和血管新生[2，13]；对于穹窿-海马伞切断模型大鼠，CIG能升高其脑组织神经营养因子含量，并且通过促进Bcl-2表达、抑制Bax和细胞色素C表达从而抑制细胞凋亡[3，14]。因此，我们推测CIG改善模型大鼠脑组织神经元存活机制可能与增加神经营养因子含量和抑制神经元细胞凋亡有关。
ChAT能促进乙酰胆碱的合成，而乙酰胆碱是促进学习记忆功能的主要神经递质，同时ChAT也可反映胆碱能系统的功能。本研究发现，2VO术后3个月，模型组大鼠海马区ChAT阳性细胞数显著减少，CIG干预后模型大鼠海马ChAT阳性神经元数明显增加，表明CIG能增加胆碱能神经元数，同时增加ChAT含量，促进乙酰胆碱合成，进而改善模型大鼠的学习记忆能力，为临床治疗VD提供依据。
参考文献：
[1] YA B， LI C， ZHANG L， et al. Cornel iridoid glycoside inhibits inflammation and apoptosis in brains of rats with focal cerebral ischemia[J]. Neurochemical Research，2010，35（5）：773-781.
[2] YAO R， ZHANG L， WANG W， et al. Cornel iridoid glycoside promotes neurogenesis and angiogenesis and improves neurological function after focal cerebral ischemia in rats[J]. Brain Research Bulletin，2009，79（1）：69-76.
[3] ZHAO L， DING Y， ZHANG L， et al. Cornel iridoid glycoside improves memory ability and promotes neuronal survival in fimbria–fornix transected rats[J]. European Journal of Pharmacology，2010， 647（1/2/3）：68-74.
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（收稿日期：2017-12-19）
（修回日期：2018-01-08；编辑：华强）