论文部分内容阅读
[摘要]目的 通过免疫母鸡制备抗人Ⅳ型胶原多克隆抗体（IgY），为检测人血清Ⅳ型胶原含量提供IgY。 方法 采用人胎盘来源的Ⅳ型胶原蛋白作为抗原，免疫Leghorn母鸡，采用PEG方法分离纯化鸡卵黄中的抗体，获得抗体粗提物。经Sephadex G100凝胶过滤制备多克隆抗体纯品。使用SDS-PAGE、免疫琼脂双向扩散等方法对提取物的含量、纯度及特异性进行鉴定。 结果 电泳结果显示，抗体粗提物纯度为81%。抗体纯品仅在70kd和25kd处各有一条带，纯度达到96%；免疫琼脂双向扩散实验结果显示，抗体纯品、粗品及免疫三周后雞血清均与中心孔的抗原形成抗原抗体复合物的乳白色沉淀线。 结论 本研究分离纯化方法制备的抗Ⅳ型胶原IgY，具有抗体纯度高、特异性强等特点，为多克隆抗体广泛应用奠定了基础。
[关键词] IgY；Ⅳ型胶原；多克隆抗体
[中图分类号] R392 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2014）10-27-04
[Abstract] Objective To detect the content of collagen type Ⅳ in human serum， and prepare polyclonal antibody （IgY） against it by immunized hens. Methods The collagen typeⅣ from human placenta was used as antigen to immunize Leghorn hens. It was used the PEG method to prepare antibody-IgY from the chicken egg yolk and obtain its crude extraction. The purity of the polyclonal antibody（IgY） was obtained by Sephadex G-100 gel filtration column. The content， purity and specificity of extract were measured with SDS-PAGE and double agar gel immune-diffusion test. Results The result of electrophoresis showed that the purity of antibody crude extraction was 81%， The purified IgY were shown two straps and the molecular weight（MW） of them were estimated to be approximately 70kD and 25kD respectively， its purity was 96%； the result of double agar gel immune-diffusion test showed that such as the purification and crude extraction of antibody and chicken sera after immunization three weeks， all of product were formed milky white precipitation lines of antigen-antibody complexes with antigen in the center hole. Conclusion In this study， the IgY against human collagen type Ⅳ with high purity and strong specificity was produced by separation and purification methods， which afford a theoretical foundation for polyclonal antibodies widely application.
[Key words] IgY； Collagen type Ⅳ； Polyclonal antibody
近年来，用于疾病研究、诊断的抗体主要来源于哺乳动物的单克隆抗体和多克隆抗体[1]。由于多克隆抗体在制备和纯化方面较单克隆抗体简单，且可在完成一次免疫后连续获得大量抗体。因此，多克隆抗体在疾病的诊断方面已经广泛应用[2]。IgY是禽类血清中的主要免疫球蛋白，鸡经特异性抗原免疫后，在卵黄中可富集特异性抗体（IgY）[3]。卵黄中的IgY纯度高，有较强的特异性。
1.8 IgY特异性鉴定
采用免疫琼脂双向扩散方法[7]。1.2%盐水琼脂糖制备琼脂板；待琼脂凝固后，打孔器打孔，孔径 4mm，孔距 15mm；加样，1孔加生理盐水对照、2孔加入抗体纯品、3孔加抗体粗品、4孔加入血清（鸡免疫后3周），每孔加样品20μL；琼脂板玻片置 37℃温箱中 12h。的轻链，IgY重链区有4个稳定区而区别于其他抗体的3个稳定区，报道称IgY的分子量为180kd[9]。目前关于IgY制备技术趋于成熟，具备方法简单、一次免疫后持续获得大量抗体的特点。关于IgY的分离纯化方法很多，包括聚乙二醇（PEG）法、水稀释法、氯仿-PEG法等[10]。
本研究为获得纯度较高的Ⅳ型胶原IgY，采用PEG法与Sephadex G100凝胶过滤相结合的方法制备多克隆抗体。结果显示，纯化的抗体经SDS-PAGE电泳可见单纯PEG法分离的抗体（粗品），在70kd以上、25kd以下均有少量杂带，图像分析仪检测纯度为81%。经EPG与凝胶过滤联合方法制备的抗体（精品），仅在25、70kd处有两条带，其他位置未见多余条带，纯度为97%。抗体含量检测结果，粗品含量为46.87mg、精品含量为33.22mg。按照纯度的百分比计算，可见精品的抗体含量与粗品中抗体含量基本符合，同时也证明经凝胶过滤后，抗体含量基本没有丢失。IgY特异性鉴定结果表明，抗体精品、抗体粗品、血清与抗原间均有特异性沉淀线产生，而且线的连接平滑、无交叉，证明三个样品中的抗体与中心孔的抗原有特异性，并表明三种抗体来源相同[11]。按照第2-3-4孔的顺序，抗原抗体复合物形成沉淀线逐渐远离中心孔，这是由于各孔中抗体含量逐步降低的结果[12]。中心孔与1孔之间没有沉淀线产生。 Ⅳ型胶原蛋白是基底膜网状结构的主要成分，肝脏纤维化时，肝组织和血清内Ⅳ型胶原含量随纤维化程度而增加。因此，检测血清中Ⅳ型胶原含量可以早期诊断肝纤维化及病变程度[12]。目前，检测的方法有化学发光法、酶标记法（ELISA）等。采用本研究分離纯化方法制备的抗Ⅳ型胶原IgY，具有纯度好、含量高、抗体特异性强的特点，符合诊断试剂对多克隆抗体的要求[13]，为建立新型检测方法奠定了基础。
[参考文献]
[1] 智海东，张宇辉，解生亮，等.鸡源抗体制备技术[J].畜牧兽医科技信息，2010，7（9）：13-14.
[2] 宋宏新，刘晓阳，李宏.酶标记鸡卵黄抗E.coli O 157：H7抗体的制备与特性研究[J].临床检验杂志，2007，25（4）： 290-292.
[3] 吴义龙，费荣梅.鸡卵黄抗体IgY研究进展[J].畜牧与兽医，2013，45（3）：94-98.
[4] 吴鹏，李博达，徐军.人胎盘来源Ⅳ型胶原蛋白的提取与纯化[J].中国医药科学，2013，3（19）：56-58.
[5] 朱正美，刘辉.简明免疫学技术[M].北京：科学技术出版社，2002：170-174.
[6] 厉朝龙，陈枢青，刘子贻，等.生物化学与分子生物学实验技术[M].杭州：浙江大学出版社，1999：46-47.
[7] 杨锦荣，李淑红.病原生物学与医学免疫学实验[M].北京：科学出版社，2011：85-86.
[8] 李春晖，郭立君，于洪涛，等.胃蛋白酶对抗狂犬病毒IgY影响[J].中国生物制品杂志，2005，25（1）：45-46.
[9] Parvari R，Avivi A，Lentner F，et al.Chicken Immunoglobulin Gamma-heavy Chains-limited VH Gene Repertoire， Combinatorial Diversification by D-Gene Segments and Evolution of the Heavy-Chain Locus[J].Embo Journal，1988，7（3）：739-744.
[10] 陈阿琴，杨志刚，俞颂东.卵黄免疫球蛋白及其应用研究进展[J].中国兽药杂志，2005，39（3）：28-31.
[11] 彭玉麟，呙于明.鸡卵黄免疫球蛋白在畜禽生产中的应用前景[J].中国饲料，2002，10（6）：26-28.
[12] 李知轩，赵玉珍，郝美娜，等.肝硬化患者声强定量与血清纤维化指标的相关性研究[J].中国超声医学杂志，2013， 29（3）：242-244.
[13] 余平.免疫学实验[M].武汉：华中科技大学出版社，2012：81-83.
（收稿日期：2014-03-14）
[关键词] IgY；Ⅳ型胶原；多克隆抗体
[中图分类号] R392 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2014）10-27-04
[Abstract] Objective To detect the content of collagen type Ⅳ in human serum， and prepare polyclonal antibody （IgY） against it by immunized hens. Methods The collagen typeⅣ from human placenta was used as antigen to immunize Leghorn hens. It was used the PEG method to prepare antibody-IgY from the chicken egg yolk and obtain its crude extraction. The purity of the polyclonal antibody（IgY） was obtained by Sephadex G-100 gel filtration column. The content， purity and specificity of extract were measured with SDS-PAGE and double agar gel immune-diffusion test. Results The result of electrophoresis showed that the purity of antibody crude extraction was 81%， The purified IgY were shown two straps and the molecular weight（MW） of them were estimated to be approximately 70kD and 25kD respectively， its purity was 96%； the result of double agar gel immune-diffusion test showed that such as the purification and crude extraction of antibody and chicken sera after immunization three weeks， all of product were formed milky white precipitation lines of antigen-antibody complexes with antigen in the center hole. Conclusion In this study， the IgY against human collagen type Ⅳ with high purity and strong specificity was produced by separation and purification methods， which afford a theoretical foundation for polyclonal antibodies widely application.
[Key words] IgY； Collagen type Ⅳ； Polyclonal antibody
近年来，用于疾病研究、诊断的抗体主要来源于哺乳动物的单克隆抗体和多克隆抗体[1]。由于多克隆抗体在制备和纯化方面较单克隆抗体简单，且可在完成一次免疫后连续获得大量抗体。因此，多克隆抗体在疾病的诊断方面已经广泛应用[2]。IgY是禽类血清中的主要免疫球蛋白，鸡经特异性抗原免疫后，在卵黄中可富集特异性抗体（IgY）[3]。卵黄中的IgY纯度高，有较强的特异性。
1.8 IgY特异性鉴定
采用免疫琼脂双向扩散方法[7]。1.2%盐水琼脂糖制备琼脂板；待琼脂凝固后，打孔器打孔，孔径 4mm，孔距 15mm；加样，1孔加生理盐水对照、2孔加入抗体纯品、3孔加抗体粗品、4孔加入血清（鸡免疫后3周），每孔加样品20μL；琼脂板玻片置 37℃温箱中 12h。的轻链，IgY重链区有4个稳定区而区别于其他抗体的3个稳定区，报道称IgY的分子量为180kd[9]。目前关于IgY制备技术趋于成熟，具备方法简单、一次免疫后持续获得大量抗体的特点。关于IgY的分离纯化方法很多，包括聚乙二醇（PEG）法、水稀释法、氯仿-PEG法等[10]。
本研究为获得纯度较高的Ⅳ型胶原IgY，采用PEG法与Sephadex G100凝胶过滤相结合的方法制备多克隆抗体。结果显示，纯化的抗体经SDS-PAGE电泳可见单纯PEG法分离的抗体（粗品），在70kd以上、25kd以下均有少量杂带，图像分析仪检测纯度为81%。经EPG与凝胶过滤联合方法制备的抗体（精品），仅在25、70kd处有两条带，其他位置未见多余条带，纯度为97%。抗体含量检测结果，粗品含量为46.87mg、精品含量为33.22mg。按照纯度的百分比计算，可见精品的抗体含量与粗品中抗体含量基本符合，同时也证明经凝胶过滤后，抗体含量基本没有丢失。IgY特异性鉴定结果表明，抗体精品、抗体粗品、血清与抗原间均有特异性沉淀线产生，而且线的连接平滑、无交叉，证明三个样品中的抗体与中心孔的抗原有特异性，并表明三种抗体来源相同[11]。按照第2-3-4孔的顺序，抗原抗体复合物形成沉淀线逐渐远离中心孔，这是由于各孔中抗体含量逐步降低的结果[12]。中心孔与1孔之间没有沉淀线产生。 Ⅳ型胶原蛋白是基底膜网状结构的主要成分，肝脏纤维化时，肝组织和血清内Ⅳ型胶原含量随纤维化程度而增加。因此，检测血清中Ⅳ型胶原含量可以早期诊断肝纤维化及病变程度[12]。目前，检测的方法有化学发光法、酶标记法（ELISA）等。采用本研究分離纯化方法制备的抗Ⅳ型胶原IgY，具有纯度好、含量高、抗体特异性强的特点，符合诊断试剂对多克隆抗体的要求[13]，为建立新型检测方法奠定了基础。
[参考文献]
[1] 智海东，张宇辉，解生亮，等.鸡源抗体制备技术[J].畜牧兽医科技信息，2010，7（9）：13-14.
[2] 宋宏新，刘晓阳，李宏.酶标记鸡卵黄抗E.coli O 157：H7抗体的制备与特性研究[J].临床检验杂志，2007，25（4）： 290-292.
[3] 吴义龙，费荣梅.鸡卵黄抗体IgY研究进展[J].畜牧与兽医，2013，45（3）：94-98.
[4] 吴鹏，李博达，徐军.人胎盘来源Ⅳ型胶原蛋白的提取与纯化[J].中国医药科学，2013，3（19）：56-58.
[5] 朱正美，刘辉.简明免疫学技术[M].北京：科学技术出版社，2002：170-174.
[6] 厉朝龙，陈枢青，刘子贻，等.生物化学与分子生物学实验技术[M].杭州：浙江大学出版社，1999：46-47.
[7] 杨锦荣，李淑红.病原生物学与医学免疫学实验[M].北京：科学出版社，2011：85-86.
[8] 李春晖，郭立君，于洪涛，等.胃蛋白酶对抗狂犬病毒IgY影响[J].中国生物制品杂志，2005，25（1）：45-46.
[9] Parvari R，Avivi A，Lentner F，et al.Chicken Immunoglobulin Gamma-heavy Chains-limited VH Gene Repertoire， Combinatorial Diversification by D-Gene Segments and Evolution of the Heavy-Chain Locus[J].Embo Journal，1988，7（3）：739-744.
[10] 陈阿琴，杨志刚，俞颂东.卵黄免疫球蛋白及其应用研究进展[J].中国兽药杂志，2005，39（3）：28-31.
[11] 彭玉麟，呙于明.鸡卵黄免疫球蛋白在畜禽生产中的应用前景[J].中国饲料，2002，10（6）：26-28.
[12] 李知轩，赵玉珍，郝美娜，等.肝硬化患者声强定量与血清纤维化指标的相关性研究[J].中国超声医学杂志，2013， 29（3）：242-244.
[13] 余平.免疫学实验[M].武汉：华中科技大学出版社，2012：81-83.
（收稿日期：2014-03-14）