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[摘要] 目的 探讨肿瘤间质活化的成纤维细胞激活蛋白在垂体泌乳素腺瘤组织中的表达及其临床意义。 方法 采用2012年2月～2015年1月间我院60例泌乳素腺瘤的患者标本。根据术前影像资料和术中所见将其分为肿瘤侵袭组和肿瘤非侵袭组。采用免疫组化法检测标本间质中FAP的表达，并用IPP7.0图像分析软件统一定量分析两组标本免疫组化图片的光密度值（OD值）。 结果 FAP在侵袭组表达率为87.5%（21/24），非侵袭组表达率为69.4%（25/36）。侵袭组与非侵袭组的表达强度OD值分别为（0.2282±0.0553）、（0.1592±0.0662），差异有统计学意义（P<0.05）。 结论 成纤维细胞激活蛋白在侵袭性和非侵袭性泌乳素腺瘤中均有表达，但表达强度在两组间有统计学意义，成纤维细胞激活蛋白可能作为鉴别泌乳素腺瘤的侵袭性的一个生物标志物。
[关键词] 成纤维细胞激活蛋白；肿瘤间质；垂体腺瘤；侵袭性
[中图分类号] R736.4；R730.231 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2016）10-0004-03
[Abstract] Objective To observe the difference of FAP expression in invasive or noninvasive prolactinoma and disscus the possible clinical applications. Methods Sixty cases of prolactinoma from February 2012 to January 2015 were enrolled， who were divided into invasive and noninvasive group according to the preoperative clinical data and intraoperative finding. The FAP expression in both invasive and noninvasive prolactinoma specimens were detected by immunohistochemical assay （S-P method）. Image dissector （IPP 7.0） was used to determine corresponding optical density （OD value） that represents its expression intensity. Results FAP was detected in the invasive prolactinoma of 87.5%（21/24）and 69.4%（25/36） in the noninvasive prolactinoma which was observed in the prolacinomas or in the cytoplasm of the tumor. The expression of OD values of the two groups were （0.2282±0.0553） and （0.1592±0.0662） respectively， the difference was statistically significant（P<0.05）. Conclusion The FAP is expressed in both invasive and noninvasive prolatinomas with different expression intensity. FAP maybe used as a marker to distinguish invasive from noninvasive prolactinoma.
[Key words] Fibroblast activation protein （FAP）； Tumor stroma； Prolactinoma； Invasive
腫瘤的发生、发展与肿瘤环境中的间质细胞紧密相关，活化的间质细胞通过分泌细胞因子和基质蛋白酶等促使肿瘤的增殖、浸润与转移。肿瘤相关性成纤维细胞（tumor-associated fibro-blast，TAF）在肿瘤进展中发挥重大作用，其分泌的成纤维细胞激活蛋白（fibroblast activation protein，FAP）主要表达于上皮癌和恶性间叶细胞中[1，2]，在正常成人静息的成纤维细胞中通常不表达，提示其是一个增生性成纤维细胞的表面标志物，在肿瘤发生、发展、侵袭中起重要作用[2，3]。近年来，FAP在肿瘤组织中的表达备受关注；但是在垂体瘤组织中的表达则鲜见报道。本研究主要通过检测垂体泌乳素腺瘤组织中FAP的表达分析其与泌乳素腺瘤侵袭性的关系，旨在为泌乳素腺瘤预后判断提供新的评价指标。现报道如下。
1 材料与方法
1.1 材料来源
收集2012年2月～2015年1月间我院60例泌乳素腺瘤的患者标本。其中侵袭性24例，非侵袭性36例。侵袭组男16例，女8例，平均年龄（32±6）岁，泌乳素水平（862.63±111.73）ng/mL；非侵袭组男22例，女14例，平均年龄（40±8）岁，泌乳素水平（616.04±90.52）ng/mL。
1.2 分组标准
根据术前核磁共振增强相上结果作出初步诊断，再根据术中所见将垂体泌乳素腺瘤分为侵袭性和非侵袭性两组。术前影像学分期主要参照Hardy-Wilosn[4]分级分期和Knosp[5]分级。术中见肿瘤明显向鞍上池及两侧海绵窦侵袭的定为侵袭性腺瘤。
1.3 FAP检测
FAP检测根据试剂盒说明进行。主要采用试剂：鼠抗人FAP单克隆抗体（德国Calbiochem公司）用于检测成纤维细胞激活蛋白（FAP）一抗；即用型S-P免疫细胞化学染色超敏试剂盒（武汉博士德）为抗小鼠IgG（二抗），DAB显色试剂盒（武汉博士德）行免疫组化显色。染色黄色为阳性，同一条件下拍照待统一定量分析。 1.4 統计学处理
所有免疫组化图片经IPP（Image-Pro Plus version 7.0）软件统一条件下测定其光密度OD（Optic Density Value）值；OD=IOD/Area，OD：平均光密度；IOD：累积光密度；Area：阳性区域面积。所有计量资料均以（x±s）表示，组间差异采用t检验，统计分析采用SPSS13.0统计学软件包。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 泌乳素腺瘤组织切片分析结果
泌乳素腺瘤组织切片分析结果提示，FAP在两组中均有阳性表达，各组FAP表达情况见封三图1～4。表达部位主要位于肿瘤细胞周围间质，部分组织可见血管周围的阳性表达（封三图2）。阳性率在侵袭组为87.5%（21/24），非侵袭组为69.4%（25/36）。
2.2 两组FAP表达强度（OD值）比较
两组FAP表达强度（OD值）比较，差异有统计学意义（P<0.05），见表1。
3讨论
肿瘤组织中除了瘤细胞，还包括间质细胞、细胞外基质（ECM）、血管和免疫细胞。肿瘤的演进不仅是由癌基因和抑癌基因来调控，还依赖于由间质形成的微环境的作用[6]。肿瘤细胞可通过诱导肿瘤基质（主要是成纤维细胞）表达FAP等一些基质蛋白从而促进肿瘤的侵袭和转移。这些基质蛋白对肿瘤发生、生长、血管形成，浸润与转移有重要作用，并具有器官特异性[7]。许多体外实验已经证明TAF有刺激肿瘤组织增殖的作用[8]。类似的体内实验进一步支持了以上结果[9]：将肿瘤细胞株接种于裸鼠时，TAF不仅可以缩短裸鼠成瘤的时间且提高了接种的成瘤率；同时可显著减少接种细胞株总的剂量。以上研究结果都说明成纤维细胞激活在肿瘤的发生和发展中起着诱导和协助的作用。
FAP是脯氨酰基特异的丝氨酸寡肽酶家族成员之一，是由单克隆抗体F19识别的一种膜结合糖蛋白，由FAP-A和FAP-B两个亚单位组成分子量为170 kDa的二聚体，仅选择性表达于肿瘤微环境、愈合的创面及器官的生理性重建等。FAP可选择性表达于90%以上的上皮源性恶性肿瘤的间质成纤维细胞上，如胰腺癌、食管癌、宫颈癌等，另外FAP也表达于骨及骨髓中的恶性间叶细胞，皮肤黑色素瘤等[1]，但在正常组织中的成纤维细胞和良性肿瘤间质中几乎无阳性表达，这提示其可能是一个增生性成纤维细胞的表面标志物。体外研究表明，FAP具有胶原酶以及类似二肽肽酶的活性，能够降解细胞外基质组分，参与趋化因子和神经肽的裂解，使癌细胞更容易脱离原来的位置，从而促进肿瘤的侵袭转移和组织重塑。此外，FAP阳性的肿瘤间质细胞会抑制机体自身的抗肿瘤免疫反应，从而协助肿瘤细胞躲避免疫攻击.为肿瘤发展营造更合适的微环境[10]。
本研究发现FAP在泌乳素腺瘤中均有阳性表达（见封三图1～4），但表达强度不同。在侵袭组呈强表达，在非侵袭组FAP呈弱表达，表达强度通过其OD值来表示，侵袭组约为非侵袭组的1.5倍。有研究显示[11]在垂体腺瘤周围硬脑膜的标本中发现，微腺瘤、大腺瘤及巨腺瘤的微侵袭率在80%以上且依次升高。相反，相同研究中的术中所见的肿瘤侵袭率仅40%左右。本实验中的“非侵袭组”的标本也有阳性表达正好验证了这一点，因为看似非侵袭性的肿瘤实际上已经被“侵袭性”了。
FAP在肿瘤间质中表达的作用机制尚未得到充分的阐明，现研究结果认为，FAP的功能有以下几种：降解细胞外基质，肿瘤细胞的侵袭和参与肿瘤组织的重塑；可激活另一种蛋白酶原而间接起到降解的作用降解细胞外基质；解离与降解细胞外基质结合的生长因子，如转化生长因子、血小板 生生长因子等，使肿瘤向恶性转化；参与肿瘤血管生成过程。有研究发现FAP的酶活性在细胞株移植成瘤系统中是必需的[12]。Loeffler等[13]构建了一种口服的针对FAP靶点的DNA疫苗，在动物实验中发现其能抑制小鼠结肠癌和乳腺癌生长，在机体中并未发现影响伤口愈合或发生免疫降低等不良反应。Kelly等[14]通过研究发现提出，破坏FAP分子复合物阻断后续信号转导可以实现对肿瘤的定点抑制。应用FAP多克隆抗体处理移植瘤后可使肿瘤生长减慢，同时有研究通过siRNA敲除FAP基因来达到抑制甚至逆转FAP介导的侵袭[15]。
综上所述，本研究结果表明，FAP在侵袭性垂体腺瘤组中的表达强度与非侵袭组有显著差异，提示FAP可能作为一种鉴别及判定预后的指标。FAP可作为研究CAFs功能的新的靶点。但FAP的肿瘤生物学活性与肿瘤发展进程、预后评估等方面还需要进行进一步的研究。
[参考文献]
[1] Huber M.A，N Kraut，N Schweifer，et al. Expression of stromal cell markers in distinct compartments of human skin cancers[J]. J Cutan Pathol，2006，33（2）：145-155.
[2] Zi F，J He，D He，et al. Fibroblast activation protein alpha in tumor microenvironment：recent progression and implications （review）[J]. Mol Med Rep，2015，11（5）：3203-3211.
[3] Park JE，MC Lenter，RN Zimmermann，et al. Fibroblast activation protein，a dual specificity serine protease expressed in reactive human tumor stromal fibroblasts[J]. J Biol Chem， 1999，274（51）：36505-36512. [4] Wilson CB. A decade of pituitary microsurgery. The Herbert Olivecrona lecture[J]. J Neurosurg，1984，61（5）：814-833.
[5] Knosp E，E Steiner，K Kitz，et al. Pituitary adenomas with invasion of the cavernous sinus space：A magnetic resonance imaging classification compared with surgical findings[J]. Neurosurgery，1993，33（4）：610-617.
[6] Desmouliere A，Guyot C，Gabbiani G. The stroma reaction myofibroblast：A key player in the control of tumor cell behavior[J]. Int J Dev Biol，2004，48（5-6）：509-517.
[7] Fidler IJ. The organ microenvironment and cancer metastasis[J]. Differentiation，2002，70（9-10）：498-505.
[8] Hayward SW，Y Wang，M Cao，et al. Malignant transformation in a nontumorigenic human prostatic epithelial cell line[J]. Cancer Res，2001，61（22）：8135-8142.
[9] Elenbaas B，L Spirio，F Koerner，et al. Human breast cancer cells generated by oncogenic transformation of primary mammary epithelial cells[J]. Genes Dev，2001，15（1）：50-65.
[10] Cheng JD，RL Dunbrack，Jr M Valianou，et al. Promotion of tumor growth by murine fibroblast activation protein，a serine protease，in an animal model[J]. Cancer Res，2002， 62（16）：4767-4772.
[11] Selman WR，ER Laws，JrBW Scheithauer，et al. The occurrence of dural invasion in pituitary adenomas[J]. J Neurosurg，1986，64（3）：402-407.
[12] Cheng JD，M Valianou，AA Canutescu，et al. Abrogation of fibroblast activation protein enzymatic activity attenuates tumor growth[J]. Mol Cancer Ther，2005，4（3）：351-360.
[13] Loeffler M，JA Kruger，AG Niethammer，et al. Targeting tumor-associated fibroblasts improves cancer chemotherapy by increasing intratumoral drug uptake[J]. J Clin Invest，2006，116（7）：1955-1962.
[14] Kelly T. Fibroblast activation protein-alpha and dipeptidyl peptidase Ⅳ（CD26）：cell-surface proteases that activate cell signaling and are potential targets for cancer therapy[J]. Drug Resist Updat，2005，8（1-2）：51-58.
[15] Teichgraber V，C Monasterio，K Chaitanya，et al. Specific inhibition of fibroblast activation protein（FAP）-alpha prevents tumor progression in vitro[J]. Adv Med Sci，2015， 60（2）：264-272.
（收稿日期：2015-12-21）
[关键词] 成纤维细胞激活蛋白；肿瘤间质；垂体腺瘤；侵袭性
[中图分类号] R736.4；R730.231 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2016）10-0004-03
[Abstract] Objective To observe the difference of FAP expression in invasive or noninvasive prolactinoma and disscus the possible clinical applications. Methods Sixty cases of prolactinoma from February 2012 to January 2015 were enrolled， who were divided into invasive and noninvasive group according to the preoperative clinical data and intraoperative finding. The FAP expression in both invasive and noninvasive prolactinoma specimens were detected by immunohistochemical assay （S-P method）. Image dissector （IPP 7.0） was used to determine corresponding optical density （OD value） that represents its expression intensity. Results FAP was detected in the invasive prolactinoma of 87.5%（21/24）and 69.4%（25/36） in the noninvasive prolactinoma which was observed in the prolacinomas or in the cytoplasm of the tumor. The expression of OD values of the two groups were （0.2282±0.0553） and （0.1592±0.0662） respectively， the difference was statistically significant（P<0.05）. Conclusion The FAP is expressed in both invasive and noninvasive prolatinomas with different expression intensity. FAP maybe used as a marker to distinguish invasive from noninvasive prolactinoma.
[Key words] Fibroblast activation protein （FAP）； Tumor stroma； Prolactinoma； Invasive
腫瘤的发生、发展与肿瘤环境中的间质细胞紧密相关，活化的间质细胞通过分泌细胞因子和基质蛋白酶等促使肿瘤的增殖、浸润与转移。肿瘤相关性成纤维细胞（tumor-associated fibro-blast，TAF）在肿瘤进展中发挥重大作用，其分泌的成纤维细胞激活蛋白（fibroblast activation protein，FAP）主要表达于上皮癌和恶性间叶细胞中[1，2]，在正常成人静息的成纤维细胞中通常不表达，提示其是一个增生性成纤维细胞的表面标志物，在肿瘤发生、发展、侵袭中起重要作用[2，3]。近年来，FAP在肿瘤组织中的表达备受关注；但是在垂体瘤组织中的表达则鲜见报道。本研究主要通过检测垂体泌乳素腺瘤组织中FAP的表达分析其与泌乳素腺瘤侵袭性的关系，旨在为泌乳素腺瘤预后判断提供新的评价指标。现报道如下。
1 材料与方法
1.1 材料来源
收集2012年2月～2015年1月间我院60例泌乳素腺瘤的患者标本。其中侵袭性24例，非侵袭性36例。侵袭组男16例，女8例，平均年龄（32±6）岁，泌乳素水平（862.63±111.73）ng/mL；非侵袭组男22例，女14例，平均年龄（40±8）岁，泌乳素水平（616.04±90.52）ng/mL。
1.2 分组标准
根据术前核磁共振增强相上结果作出初步诊断，再根据术中所见将垂体泌乳素腺瘤分为侵袭性和非侵袭性两组。术前影像学分期主要参照Hardy-Wilosn[4]分级分期和Knosp[5]分级。术中见肿瘤明显向鞍上池及两侧海绵窦侵袭的定为侵袭性腺瘤。
1.3 FAP检测
FAP检测根据试剂盒说明进行。主要采用试剂：鼠抗人FAP单克隆抗体（德国Calbiochem公司）用于检测成纤维细胞激活蛋白（FAP）一抗；即用型S-P免疫细胞化学染色超敏试剂盒（武汉博士德）为抗小鼠IgG（二抗），DAB显色试剂盒（武汉博士德）行免疫组化显色。染色黄色为阳性，同一条件下拍照待统一定量分析。 1.4 統计学处理
所有免疫组化图片经IPP（Image-Pro Plus version 7.0）软件统一条件下测定其光密度OD（Optic Density Value）值；OD=IOD/Area，OD：平均光密度；IOD：累积光密度；Area：阳性区域面积。所有计量资料均以（x±s）表示，组间差异采用t检验，统计分析采用SPSS13.0统计学软件包。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 泌乳素腺瘤组织切片分析结果
泌乳素腺瘤组织切片分析结果提示，FAP在两组中均有阳性表达，各组FAP表达情况见封三图1～4。表达部位主要位于肿瘤细胞周围间质，部分组织可见血管周围的阳性表达（封三图2）。阳性率在侵袭组为87.5%（21/24），非侵袭组为69.4%（25/36）。
2.2 两组FAP表达强度（OD值）比较
两组FAP表达强度（OD值）比较，差异有统计学意义（P<0.05），见表1。
3讨论
肿瘤组织中除了瘤细胞，还包括间质细胞、细胞外基质（ECM）、血管和免疫细胞。肿瘤的演进不仅是由癌基因和抑癌基因来调控，还依赖于由间质形成的微环境的作用[6]。肿瘤细胞可通过诱导肿瘤基质（主要是成纤维细胞）表达FAP等一些基质蛋白从而促进肿瘤的侵袭和转移。这些基质蛋白对肿瘤发生、生长、血管形成，浸润与转移有重要作用，并具有器官特异性[7]。许多体外实验已经证明TAF有刺激肿瘤组织增殖的作用[8]。类似的体内实验进一步支持了以上结果[9]：将肿瘤细胞株接种于裸鼠时，TAF不仅可以缩短裸鼠成瘤的时间且提高了接种的成瘤率；同时可显著减少接种细胞株总的剂量。以上研究结果都说明成纤维细胞激活在肿瘤的发生和发展中起着诱导和协助的作用。
FAP是脯氨酰基特异的丝氨酸寡肽酶家族成员之一，是由单克隆抗体F19识别的一种膜结合糖蛋白，由FAP-A和FAP-B两个亚单位组成分子量为170 kDa的二聚体，仅选择性表达于肿瘤微环境、愈合的创面及器官的生理性重建等。FAP可选择性表达于90%以上的上皮源性恶性肿瘤的间质成纤维细胞上，如胰腺癌、食管癌、宫颈癌等，另外FAP也表达于骨及骨髓中的恶性间叶细胞，皮肤黑色素瘤等[1]，但在正常组织中的成纤维细胞和良性肿瘤间质中几乎无阳性表达，这提示其可能是一个增生性成纤维细胞的表面标志物。体外研究表明，FAP具有胶原酶以及类似二肽肽酶的活性，能够降解细胞外基质组分，参与趋化因子和神经肽的裂解，使癌细胞更容易脱离原来的位置，从而促进肿瘤的侵袭转移和组织重塑。此外，FAP阳性的肿瘤间质细胞会抑制机体自身的抗肿瘤免疫反应，从而协助肿瘤细胞躲避免疫攻击.为肿瘤发展营造更合适的微环境[10]。
本研究发现FAP在泌乳素腺瘤中均有阳性表达（见封三图1～4），但表达强度不同。在侵袭组呈强表达，在非侵袭组FAP呈弱表达，表达强度通过其OD值来表示，侵袭组约为非侵袭组的1.5倍。有研究显示[11]在垂体腺瘤周围硬脑膜的标本中发现，微腺瘤、大腺瘤及巨腺瘤的微侵袭率在80%以上且依次升高。相反，相同研究中的术中所见的肿瘤侵袭率仅40%左右。本实验中的“非侵袭组”的标本也有阳性表达正好验证了这一点，因为看似非侵袭性的肿瘤实际上已经被“侵袭性”了。
FAP在肿瘤间质中表达的作用机制尚未得到充分的阐明，现研究结果认为，FAP的功能有以下几种：降解细胞外基质，肿瘤细胞的侵袭和参与肿瘤组织的重塑；可激活另一种蛋白酶原而间接起到降解的作用降解细胞外基质；解离与降解细胞外基质结合的生长因子，如转化生长因子、血小板 生生长因子等，使肿瘤向恶性转化；参与肿瘤血管生成过程。有研究发现FAP的酶活性在细胞株移植成瘤系统中是必需的[12]。Loeffler等[13]构建了一种口服的针对FAP靶点的DNA疫苗，在动物实验中发现其能抑制小鼠结肠癌和乳腺癌生长，在机体中并未发现影响伤口愈合或发生免疫降低等不良反应。Kelly等[14]通过研究发现提出，破坏FAP分子复合物阻断后续信号转导可以实现对肿瘤的定点抑制。应用FAP多克隆抗体处理移植瘤后可使肿瘤生长减慢，同时有研究通过siRNA敲除FAP基因来达到抑制甚至逆转FAP介导的侵袭[15]。
综上所述，本研究结果表明，FAP在侵袭性垂体腺瘤组中的表达强度与非侵袭组有显著差异，提示FAP可能作为一种鉴别及判定预后的指标。FAP可作为研究CAFs功能的新的靶点。但FAP的肿瘤生物学活性与肿瘤发展进程、预后评估等方面还需要进行进一步的研究。
[参考文献]
[1] Huber M.A，N Kraut，N Schweifer，et al. Expression of stromal cell markers in distinct compartments of human skin cancers[J]. J Cutan Pathol，2006，33（2）：145-155.
[2] Zi F，J He，D He，et al. Fibroblast activation protein alpha in tumor microenvironment：recent progression and implications （review）[J]. Mol Med Rep，2015，11（5）：3203-3211.
[3] Park JE，MC Lenter，RN Zimmermann，et al. Fibroblast activation protein，a dual specificity serine protease expressed in reactive human tumor stromal fibroblasts[J]. J Biol Chem， 1999，274（51）：36505-36512. [4] Wilson CB. A decade of pituitary microsurgery. The Herbert Olivecrona lecture[J]. J Neurosurg，1984，61（5）：814-833.
[5] Knosp E，E Steiner，K Kitz，et al. Pituitary adenomas with invasion of the cavernous sinus space：A magnetic resonance imaging classification compared with surgical findings[J]. Neurosurgery，1993，33（4）：610-617.
[6] Desmouliere A，Guyot C，Gabbiani G. The stroma reaction myofibroblast：A key player in the control of tumor cell behavior[J]. Int J Dev Biol，2004，48（5-6）：509-517.
[7] Fidler IJ. The organ microenvironment and cancer metastasis[J]. Differentiation，2002，70（9-10）：498-505.
[8] Hayward SW，Y Wang，M Cao，et al. Malignant transformation in a nontumorigenic human prostatic epithelial cell line[J]. Cancer Res，2001，61（22）：8135-8142.
[9] Elenbaas B，L Spirio，F Koerner，et al. Human breast cancer cells generated by oncogenic transformation of primary mammary epithelial cells[J]. Genes Dev，2001，15（1）：50-65.
[10] Cheng JD，RL Dunbrack，Jr M Valianou，et al. Promotion of tumor growth by murine fibroblast activation protein，a serine protease，in an animal model[J]. Cancer Res，2002， 62（16）：4767-4772.
[11] Selman WR，ER Laws，JrBW Scheithauer，et al. The occurrence of dural invasion in pituitary adenomas[J]. J Neurosurg，1986，64（3）：402-407.
[12] Cheng JD，M Valianou，AA Canutescu，et al. Abrogation of fibroblast activation protein enzymatic activity attenuates tumor growth[J]. Mol Cancer Ther，2005，4（3）：351-360.
[13] Loeffler M，JA Kruger，AG Niethammer，et al. Targeting tumor-associated fibroblasts improves cancer chemotherapy by increasing intratumoral drug uptake[J]. J Clin Invest，2006，116（7）：1955-1962.
[14] Kelly T. Fibroblast activation protein-alpha and dipeptidyl peptidase Ⅳ（CD26）：cell-surface proteases that activate cell signaling and are potential targets for cancer therapy[J]. Drug Resist Updat，2005，8（1-2）：51-58.
[15] Teichgraber V，C Monasterio，K Chaitanya，et al. Specific inhibition of fibroblast activation protein（FAP）-alpha prevents tumor progression in vitro[J]. Adv Med Sci，2015， 60（2）：264-272.
（收稿日期：2015-12-21）