摘要：将拟南芥ERA-1基因除信号肽外的剩余编码序列克隆到原核表达载体pET28a上，转化到大肠杆菌BL21 （DE3）中表达，发现表达的目的蛋白位于包涵体中，大量表达目的蛋白并用镍柱亲和层析法进行纯化，获得足量的重组蛋白后将其作为抗原免疫家兔，获得抗血清。用重组蛋白亲和纯化抗血清中的ERA-1多克隆抗体。利用野生型拟南芥、ERA-1敲除突变系和ERA-1过表达系的叶片总蛋白进行免疫印迹试验，检测ERA-1多克隆抗体的特异性，发现纯化后的ERA-1多克隆抗体（1 ∶1 000体积比稀释）能特异地检测到拟南芥中的ERA-1蛋白。本试验成功制备了ERA-1蛋白的多克隆抗体，可以用于今后对ERA-1基因功能的研究。
　　关键词：拟南芥ERA-1；原核表达；蛋白纯化；抗血清；多克隆抗体制备
　　中图分类号： Q946.1文献标志码： A文章编号：1002-1302（2017）08-0033-03
　　ERA（Eecherichia coli ras-like protein，简称ERA）基因最早在大肠杆菌中发现，因其蛋白序列与真核生物的大鼠肉瘤（Ras）蛋白相似度高，所以命名为ERA[1]。但随后的研究表明，ERA与Ras蛋白序列相似性主要集中于N端的GTP酶结构域，而其C端与包括Ras在内的其他小GTP酶不具有同源性，因而把它列为一类新的小GTP酶。对大肠杆菌ERA功能的研究表明，该基因是大肠杆菌生存繁殖所必需的[2]。大肠杆菌ERA表达量降低突变体表现为细胞分裂异常、细胞增长呈丝状、拟核数目增多，表明ERA在染色体分离后，胞质分裂前发挥重要作用[3-4]。另有研究表明，ERA的C端能与核糖体16S RNA结合，对核糖体小亚基的组装成熟起重要作用[5-6]。细菌的ERA蛋白序列具有高度保守性，不同种类细菌的ERA蛋白可以互补大肠杆菌ERA的功能[7-8]。
　　真核生物的ERA基因起源于原核生物，真核生物的ERA蛋白序列與原核生物具有高度相似性，大多分布于线粒体或叶绿体中[9]。人类ERA同源蛋白ERAL1定位于线粒体[10]，能与线粒体12S rRNA结合，参与核糖体小亚基的组装[11]。ERAL1功能缺陷细胞从G1期进入到S期受阻，进而引发细胞凋亡[12]。拟南芥ERA家族有2个成员ERA-1及ERA-2，亚细胞定位研究表明ERA-1定位于叶绿体，而ERA-2定位于线粒体[13]。目前植物中ERA的功能尚未见报道，为了方便研究ERA-1在拟南芥叶绿体中的功能，将拟南芥ERA-1基因在大肠杆菌中表达，获得重组ERA-1蛋白经过纯化后免疫家兔制备多克隆抗体。ERA-1多克隆抗体的成功制备，为后续研究ERA-1的生物学功能提供了条件。
　　1材料与方法
　　1.1材料
　　野生型拟南芥、era-1-1纯合突变体、ERA-1过表达株系（ERA-1OE-1、ERA-1OE-13、ERA-1OE-4、ERA-1OE-5）均为Columbia-0生态型背景，由笔者所在实验室保存。
　　试验中使用的限制性内切酶、T4连接酶等各种酶类均购自TaKaRa。琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒等购自天根生化科技（北京）有限公司。His标签蛋白纯化柱填料Ni琼脂糖凝胶6 Fast Flow购自GE Healthcare Life Science。完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂为Sigma公司产品；HRP标记的羊抗兔抗体G