【摘 要】
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细胞焦亡是一种具有促炎性的细胞程序性死亡过程,可分为依赖Caspase-1的经典途径和依赖Caspase-4/5/11的非经典途径,广泛参与肿瘤、感染性疾病、代谢性疾病等疾病的发生与发展.为构建经典途径细胞焦亡的体外模型,通过PCR扩增目的 基因Pro-Caspase-1、H-GSDMD-FL和H-GSDMD-P30,分别连接到相应的载体中,构建重组真核表达质粒p3×FLAG-CMV-Caspase-1、Myc-CMV-hGSDMD-FL和pcDNA3.1-Myc-hGSDMD-p30.利用Li-po80
【机 构】
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浙江大学动物科学学院,浙江杭州310058
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细胞焦亡是一种具有促炎性的细胞程序性死亡过程,可分为依赖Caspase-1的经典途径和依赖Caspase-4/5/11的非经典途径,广泛参与肿瘤、感染性疾病、代谢性疾病等疾病的发生与发展.为构建经典途径细胞焦亡的体外模型,通过PCR扩增目的 基因Pro-Caspase-1、H-GSDMD-FL和H-GSDMD-P30,分别连接到相应的载体中,构建重组真核表达质粒p3×FLAG-CMV-Caspase-1、Myc-CMV-hGSDMD-FL和pcDNA3.1-Myc-hGSDMD-p30.利用Li-po8000TM试剂将重组质粒转染到HEK293T细胞中,通过Western blot方法验证蛋白表达情况;进一步将质粒共转染至HEK293T细胞24 h后,检测上清中LDH释放情况,提取蛋白后通过Western blot方法验证蛋白表达及切割情况,并且进行PI染色观察细胞膜破坏情况,验证经典途径的细胞焦亡体外模型是否成功构建.结果 显示,重组真核表达质粒均成功构建,p3×FLAG-CMV-Caspase-1和Myc-CMV-hGSDMD-FL可在HEK293T细胞中成功表达.质粒共转染后Western blot检测到GSDMD-FL被Caspase-1切割,切割条带与GSDMD-p30大小相符,上清中LDH水平明显升高,与GSDMD-p30单独转染结果相似,PI染色结果也与上述情况一致,表明HEK293T细胞中经典途径细胞焦亡模型的成功构建,为进一步探究焦亡激活机制以及开发相关药物提供了体外模型.
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