【摘 要】
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目的 构建帕金森病PINK1基因真核表达载体pcDNA3.1-myc/PINK1,检测其转染COS-7细胞后的表达.方法 用PCR方法从人cDNA文库DNA中扩增PINK1全长cDNA.该基因片段两端设计了EcoR I
【基金项目】
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中华国际医学交流基金会和默沙东公司帕金森病专项基金;广东省医学科学研究基金;广东省自然科学基金;国家自然科学基金
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目的 构建帕金森病PINK1基因真核表达载体pcDNA3.1-myc/PINK1,检测其转染COS-7细胞后的表达.方法 用PCR方法从人cDNA文库DNA中扩增PINK1全长cDNA.该基因片段两端设计了EcoR I和BamH I限制性酶切位点.将所得片段连接到T载体上测序证实.利用重组DNA技术将PINK1的cDNA构建到真核表达载体pcDNA3.1-myc-his(-)B上,酶切鉴定.通过脂质体介导的转染技术将所构建的载体导入COS-7细胞中,体外培养,于转染48 h后利用RT-PCR和Western Blotting方法检测目的基因的表达情况.主要观察指标:(1)PINK1基因cDNA扩增产物检测.(2)pcDNA3.1-myc/PINK1重组体酶切鉴定.(3)Western-blotting.结果 经琼脂糖凝胶电泳及测序证实,PCR获得的片段与GenBank中登记的PINK1序列完全相同;pcDNA3.1-myc/CHIP酶切片段的长度与理论大小相符;转染48 h后的COS-7细胞可检测到P1NK1蛋白的表达.结论 PINK1蛋白真核表达载体构建成功,在COS-7细胞中可获得表达.
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