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摘要：本研究通过应用电化学发光免疫分析技术（ECLIA），对45份膀胱癌患者尿液中角蛋白19片段含量进行测定，并与正常对照组和泌尿系良性疾病组及其他肿瘤组进行对照分析，检测出膀胱癌患者尿液中细胞角蛋白19片段的水平，从而探究电化学发光技术检测尿中角蛋白19片段的意义。
关键词：电化学发光技术；尿液检测；角蛋白19片段
前言：尿液细胞学检查和膀胱镜活检是诊断膀胱癌的金标准，然而，前者阳性率较低，，后者为侵入性检查，患者不易接受。因此，我们采用电化学发光技术测定尿中细胞角蛋白19片段，探讨尿CK19片段含量与膀胱癌的关系，旨在为临床提供一种快速、灵敏、无痛性膀胱癌筛查方法。
1.材料和方法
1.1标本的来源
健康人尿标本：取自无泌尿系统疾病的志愿者，其中男性24名，女性23名，年龄14～73岁，平均42岁；膀胱癌尿标本45份，其中原发性膀胱移行细胞癌32例，复发性膀胱移行细胞癌10例13份标本，男性36例，女性6例，年龄26～90岁，平均63岁；尿路感染27例，男性15例，女性12例，年龄23～75岁，平均45岁；肾炎61例，男性31例，女性30例，年龄15～86岁，平均55岁；前列腺炎6例，年龄49～77岁，平均67岁；其他肿瘤15例（食道癌3、肝癌2、肺癌1、乳腺癌1、肠癌2、胃癌2、前列腺癌1、淋巴瘤1、急淋2），男性11例，女性4例，年龄36～80岁，平均57岁。以上57例肿瘤病例中53例经病理确诊，4例经影像学结合临床诊断。
1.2探究方法
标本采集：膀胱镜检前收集尿标本，收集标本前晚9点起禁食禁水，留清晨第1次中段尿约5ml，置于专用管中，颠倒混匀于4e保存，3h内送检。标本处理：将标本离心，1500 r/min5min，取上清液上机检测（或-75e保存）。方法：采用电化学发光免疫分析技术（ECLIA）。电化学发光免疫分析仪（Elecsys 1010型，Roche公司产品），CYFRA21-1 ECLIA试剂盒由Roche公司提供，严格按操作说明书进行操作。放射免疫法（RIA）CYFRA21-1测定：使用ELSA-CYFFRA21-1试剂盒，严格按照试剂说明书操作，在智能放免C测量仪（SN-695型，上海核福光电仪器有限公司）上测定。数理统计：用EXCEL软件统计，均数以€xs，差异显著性用t检验，百分率差异显著性用V2检验。
2.实验结果
正常对照组尿CK19（CYFRA21-1）水平为（11970188）Lg/L，其中男性组（21050188）Lg/L略高于女性组（11890182）Lg/L，两者差异无显著性意义（P=0161）；40岁以上组与40岁以下组尿CK19值接近，分别为（21000185）Lg/L和（11930185）Lg/L，P= 01814，年龄与性别对尿CK19（CYFRA21-1）含量无明显影响。故以99%可信度设定正常值为[319Lg/L。膀胱癌组尿CK19（CYFRA21-1）水平高于其他各组。以319Lg/L为临界值，膀胱癌组阳性率高达93%，明显高于其他各组，差异具有显著性意义。各组尿CK19测定结果。
3.测试结果分析
3.1电化学发光技术检测存在的不足
标本采集和处理方法不当，将出现假阴性、假阳性结果。如采集前大量饮水，尿中CK19被稀释，标本处理不及时，尿中微量的CK19多肽被细菌消耗，或被蛋白酶降解，均可出现假阴性结果；女性患者尿液中易混入阴道分泌物，由于分泌物中含鳞状上皮细胞，如未及时离心而使上皮细胞破坏释放CK19，将产生假阳性结果。因此，作者采取限制水的摄入、及时离心、留取中段尿等措施，使结果具有可比性，提高敏感性降低假阳性率。
3.2电化学发光技术检测尿中角蛋白19片段的意义
电化学发光免疫分析技术是继放射免疫、酶免疫、荧光免疫、化学发光之后发展起来的新一代的更灵敏、更准确的小分子标记免疫分析技术。电化学发光免疫分析法，无论是灵敏度、准确性、精密度均优于Stieber及其他文献所用的放射免疫分析法（RIA）和酶联免疫吸附试验（ELISA），尤其是ECLIA法的线性范围比RIA和ELISA高出3～4个数量级，克服了前带、倒钩等假阴性现象[2-4]。本研究将该方法应用于尿中CK19（CYFRA21-1）测定，发现尿CYFRA21-1测定的批内CV值< 2%，与血清CYFRA21-1测定结果接近。但批间（2个月之内）差异大于血清CYFRA21-1，可能原因是尿液中CK19的稳定性（-30e保存）较差，建议尿标本应及时检测或-70e以下短期保存。本研究结果显示，ECLIA法批内、批间重复性均优于放免法。
3.3尿中角蛋白19片段的探究结果
CK19（CYFRA21-1）是分布于上皮细胞中的细胞角蛋白成分之一，分子量40 000，是可溶性酸性多肽分子。正常状态下含量极低，当细胞癌变时含量升高，且因细胞通透性改变或溶解而被释放，使组织液、血液中浓度上升[4]。膀胱上皮细胞癌变时，由于细胞增生、化生，肿瘤组织向膀胱突出，肿瘤细胞直接脱落于尿液中并在尿中溶解等因素，使细胞内细胞角蛋白（Cytokeratin，CK）成分逸出和降解，尿中CK19水平升高。因此，尿中CK19含量变化比血液中的更直接、更敏感。本研究显示尿CK19对膀胱癌诊断有较高的敏感性（9313%），明显高于Stieber等[5]报道的血清CYFRA21-1对膀胱癌的敏感性（23%）。我们所探讨的尿CK19水平测定，对膀胱癌敏感性虽高，然而特异性较差，无法取代膀胱镜检，但作为筛查和复发监测指标确有其无创伤性、敏感、快速及价廉的优势，我们提议将尿CK19检测作为膀胱癌筛查和术后随访指标。
结语：综上所述，电化学发光免疫分析技术（ECLIA）是继放射免疫、酶免疫、荧光免疫、化学发光免疫之后的新一代标记免疫技术，具有灵敏度高，线性范围宽，快速，应用范围广等特点，可以有效检测出溶解于尿液中的分布于上皮细胞中的尿中细胞角蛋白19片段。
参考文献：
[1]张忠英，林永志，刘莉莉，等.电化学发光技术测定非小细胞癌原在肺癌与肺结核鉴别诊断上的应用.中华结核和呼吸杂志，2001，24：563-564.
关键词：电化学发光技术；尿液检测；角蛋白19片段
前言：尿液细胞学检查和膀胱镜活检是诊断膀胱癌的金标准，然而，前者阳性率较低，，后者为侵入性检查，患者不易接受。因此，我们采用电化学发光技术测定尿中细胞角蛋白19片段，探讨尿CK19片段含量与膀胱癌的关系，旨在为临床提供一种快速、灵敏、无痛性膀胱癌筛查方法。
1.材料和方法
1.1标本的来源
健康人尿标本：取自无泌尿系统疾病的志愿者，其中男性24名，女性23名，年龄14～73岁，平均42岁；膀胱癌尿标本45份，其中原发性膀胱移行细胞癌32例，复发性膀胱移行细胞癌10例13份标本，男性36例，女性6例，年龄26～90岁，平均63岁；尿路感染27例，男性15例，女性12例，年龄23～75岁，平均45岁；肾炎61例，男性31例，女性30例，年龄15～86岁，平均55岁；前列腺炎6例，年龄49～77岁，平均67岁；其他肿瘤15例（食道癌3、肝癌2、肺癌1、乳腺癌1、肠癌2、胃癌2、前列腺癌1、淋巴瘤1、急淋2），男性11例，女性4例，年龄36～80岁，平均57岁。以上57例肿瘤病例中53例经病理确诊，4例经影像学结合临床诊断。
1.2探究方法
标本采集：膀胱镜检前收集尿标本，收集标本前晚9点起禁食禁水，留清晨第1次中段尿约5ml，置于专用管中，颠倒混匀于4e保存，3h内送检。标本处理：将标本离心，1500 r/min5min，取上清液上机检测（或-75e保存）。方法：采用电化学发光免疫分析技术（ECLIA）。电化学发光免疫分析仪（Elecsys 1010型，Roche公司产品），CYFRA21-1 ECLIA试剂盒由Roche公司提供，严格按操作说明书进行操作。放射免疫法（RIA）CYFRA21-1测定：使用ELSA-CYFFRA21-1试剂盒，严格按照试剂说明书操作，在智能放免C测量仪（SN-695型，上海核福光电仪器有限公司）上测定。数理统计：用EXCEL软件统计，均数以€xs，差异显著性用t检验，百分率差异显著性用V2检验。
2.实验结果
正常对照组尿CK19（CYFRA21-1）水平为（11970188）Lg/L，其中男性组（21050188）Lg/L略高于女性组（11890182）Lg/L，两者差异无显著性意义（P=0161）；40岁以上组与40岁以下组尿CK19值接近，分别为（21000185）Lg/L和（11930185）Lg/L，P= 01814，年龄与性别对尿CK19（CYFRA21-1）含量无明显影响。故以99%可信度设定正常值为[319Lg/L。膀胱癌组尿CK19（CYFRA21-1）水平高于其他各组。以319Lg/L为临界值，膀胱癌组阳性率高达93%，明显高于其他各组，差异具有显著性意义。各组尿CK19测定结果。
3.测试结果分析
3.1电化学发光技术检测存在的不足
标本采集和处理方法不当，将出现假阴性、假阳性结果。如采集前大量饮水，尿中CK19被稀释，标本处理不及时，尿中微量的CK19多肽被细菌消耗，或被蛋白酶降解，均可出现假阴性结果；女性患者尿液中易混入阴道分泌物，由于分泌物中含鳞状上皮细胞，如未及时离心而使上皮细胞破坏释放CK19，将产生假阳性结果。因此，作者采取限制水的摄入、及时离心、留取中段尿等措施，使结果具有可比性，提高敏感性降低假阳性率。
3.2电化学发光技术检测尿中角蛋白19片段的意义
电化学发光免疫分析技术是继放射免疫、酶免疫、荧光免疫、化学发光之后发展起来的新一代的更灵敏、更准确的小分子标记免疫分析技术。电化学发光免疫分析法，无论是灵敏度、准确性、精密度均优于Stieber及其他文献所用的放射免疫分析法（RIA）和酶联免疫吸附试验（ELISA），尤其是ECLIA法的线性范围比RIA和ELISA高出3～4个数量级，克服了前带、倒钩等假阴性现象[2-4]。本研究将该方法应用于尿中CK19（CYFRA21-1）测定，发现尿CYFRA21-1测定的批内CV值< 2%，与血清CYFRA21-1测定结果接近。但批间（2个月之内）差异大于血清CYFRA21-1，可能原因是尿液中CK19的稳定性（-30e保存）较差，建议尿标本应及时检测或-70e以下短期保存。本研究结果显示，ECLIA法批内、批间重复性均优于放免法。
3.3尿中角蛋白19片段的探究结果
CK19（CYFRA21-1）是分布于上皮细胞中的细胞角蛋白成分之一，分子量40 000，是可溶性酸性多肽分子。正常状态下含量极低，当细胞癌变时含量升高，且因细胞通透性改变或溶解而被释放，使组织液、血液中浓度上升[4]。膀胱上皮细胞癌变时，由于细胞增生、化生，肿瘤组织向膀胱突出，肿瘤细胞直接脱落于尿液中并在尿中溶解等因素，使细胞内细胞角蛋白（Cytokeratin，CK）成分逸出和降解，尿中CK19水平升高。因此，尿中CK19含量变化比血液中的更直接、更敏感。本研究显示尿CK19对膀胱癌诊断有较高的敏感性（9313%），明显高于Stieber等[5]报道的血清CYFRA21-1对膀胱癌的敏感性（23%）。我们所探讨的尿CK19水平测定，对膀胱癌敏感性虽高，然而特异性较差，无法取代膀胱镜检，但作为筛查和复发监测指标确有其无创伤性、敏感、快速及价廉的优势，我们提议将尿CK19检测作为膀胱癌筛查和术后随访指标。
结语：综上所述，电化学发光免疫分析技术（ECLIA）是继放射免疫、酶免疫、荧光免疫、化学发光免疫之后的新一代标记免疫技术，具有灵敏度高，线性范围宽，快速，应用范围广等特点，可以有效检测出溶解于尿液中的分布于上皮细胞中的尿中细胞角蛋白19片段。
参考文献：
[1]张忠英，林永志，刘莉莉，等.电化学发光技术测定非小细胞癌原在肺癌与肺结核鉴别诊断上的应用.中华结核和呼吸杂志，2001，24：563-564.