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【摘 要】 目的： 评估缩短血培养阳性大肠埃希菌孵育时间进行药敏试验的可行性。方法： 选取101例血培养仪报警阳性的大肠埃希菌标本，接种血平板，置于35℃温箱中孵育6小时和16-18小时，再用标准纸片扩散法（Kirby-Bauer扩散法）进行药敏试验，以孵育16-18小时药敏结果为标准对孵育6小时的药敏试验进行评估。 结果： 血培养阳性标本大肠埃希菌孵育6小时和孵育16-18小时的药敏试验敏感的不符合率1.79%，中介的不符合率16.14%，耐药的不符合率2.79%;16种抗菌药物的药敏试验的符合率98.6%。结论： 缩短血培养阳性大肠埃希菌孵育时间进行药敏试验结果可靠，能更及时、有效地指导临床。
【关键词】 血培养阳性 大肠埃希菌 缩短时间
【中图分类号】 R917 【文献标识码】 A 【文章编号】 1671-5160（2015）01-0302-02
血培养是临床微生物检验的主要项目，有重要的临床意义，[1]-[2]快速准确的得到病原菌鉴定和药敏结果，是临床正确及时进行抗感染治疗的关键。常规血培养结果一般需要2—3天，易延误治疗，全自动鉴定仪血培养结果快，只需要1-2天，但价格昂贵。本实验对血培养阳性的大肠埃希菌标本先接种血平板，缩短孵育时间，孵育6小时后进行药敏实验，并与孵育16-18小时后的大肠埃希菌的药敏实验进行比较，以验证该方法的可行性。
1 材料与方法
1.1 一般资料
菌株挑选自我院2012-01至2013-07月间101份血培养阳性标本的大肠埃希菌。
1.2 仪器与试剂
1.2.1 美国BD公司生产的全自动血液培养箱Baetec9120及配套的血培养瓶，哥伦比亚血琼脂平板由广州市迪景微生物科技有限公司提供，水解酪蛋白（Mueller-Hinton）培养基干粉由英国Oxoid公司提供，所用药敏纸片由英国Oxoid公司提供，选用临床常用抗菌药物：氨苄西林（AMP）、氨曲南（ATM）、氨苄西林/舒巴坦（SAM） 、头孢唑啉（CZ）、头孢他啶（CAZ）、头孢曲松（CRO）、头孢呋辛（CXM） 、头孢吡肟（FEP）、头孢西丁（FOX）、左氧氟沙星（LEV）、环丙沙星（CIP）、美罗培南（MEM）、庆大霉素（CN10）、阿米卡星（AK）、复方新诺明（SXT）、哌拉西林/他唑巴坦（TZP）。
1.2.2 药敏试验方法：标准纸片扩散法（Kirby-Bauer扩散法）。
1.2.3 药敏判断标准：结果判定依据美国临床实验室标准化研究
所（CLSI）制定的标准[3]。
1.2.4 质量控制：水解酪蛋白（Mueller-Hinton）培养基平板厚度4 mm，菌悬液0.5麦氏单位应用DensiCHCK比浊仪控制，质控菌株：大肠埃希菌ATCC25922。
1.3 方法
1.3.1 当血培养箱阳性报警后，取出阳性瓶，划线接种至血平板，置于35±2℃温箱孵育6小时，同时用另外的血平板接种标准菌株（大肠埃希菌ATCC25922）一起置于35±2℃温箱孵育6小时。
1.3.2 阳性瓶需涂片，做革兰染色，根据涂片的结果，方可选取单一阴性杆菌用标准纸片扩散法（Kirby-Bauer扩散法）做药敏实验。
1.3.3 取35±2℃温箱孵育6小时，革兰染色为Gˉ杆菌，氧化酶实验阴性的细菌，挑取菌膜制成菌悬液， DensiCHCK比浊仪控制菌悬液0.5麦氏单位，用灭菌棉签将配制好的菌悬液在15 分钟内均匀接种于水解酪蛋白（Mueller-Hinton）培养基，室温平放3-5 分钟，选择药敏纸片，做药敏试验，每直径100mm培养基放置 5个药敏纸片，严格按照文献[4]操作，同时做标准菌株（大肠埃希菌ATCC25922）的药敏试验，置于35±2℃温箱孵育，16-18小时后，记录药敏结果，用游标卡尺测量抑菌环直径，参照CLSI-2012版标准对抑菌环的直径判读，用敏感（S）、中介（I）、耐药（R）表示。而孵育6小时的菌落和标准菌株（大肠埃希菌ATCC25922）继续孵育于温箱，次日8时（22～23 小时后）再次用标准纸片扩散法（Kirby-Bauer扩散法）做药敏试验，放置相应药敏纸片，置于35±2℃温箱孵育，16-18小时后，记录药敏结果，然后将其两组结果进行比较分析。
表1 大肠埃希菌缩短孵育时间药敏试验不符合率
表2 大肠埃希菌缩短孵育时间药敏试验符合率
注：标准符合率[5]：运用美国临床实验室标准化研究所（CLSI）制定的标准解释规则，实验结果和参照方法的预期结果一致，如S、I、R，为符合。非常重大错误：孵育6小时药敏为S而孵育16-18小时药敏为R。重大错误：孵育6小时药敏为R而孵育16-18小时药敏为S。微小错误：孵育6小时药敏为R或S而孵育18-24小时药敏为I;孵育6小时药敏为I而孵育16-18小时药敏为R或S。
1.4 统计学处理
1.4.1 不符合率：细菌孵育6小时的药敏结果与孵育16-18小时的药敏结果分别以敏感（S）、中介（I）、耐药（R）进行统计，计算不符合率。
1.4.2 符合率：以细菌孵育6小时与孵育16-18小时的药敏结果比较，进行每一种抗菌药物符合以及错误的统计，计算16种抗菌药物符合率及错误率。
2 结果
血培养阳性标本大肠埃希菌孵育6小时后和孵育16-18小时后的药敏试验敏感（S）的不符合率1.79%，中介（I）的不符合率16.14%，耐药（R）的不符合率2.79%;16种抗菌药物符合率98.6%，非常重大错误0，重大错误0.1%，微小错误1.24%，缩短孵育时间进行药敏试验，药敏结果可靠，见表1，表2。 3 讨论
本文101株细菌均为实验室血培养阳性标本经过接种鉴定筛选出来的大肠埃希菌。我院血培养阳性标本中肠杆菌科细菌构成比为：大肠埃希菌101例占74.3%，肺炎克雷伯菌27例占19.8%，阴沟肠杆菌3例占2.2%，粘质沙雷菌3例占2.2%，产气肠杆菌1例占0.7%，奇异变形杆菌1例占0.7%。我们选择最常见，数量最多的大肠埃希菌[6]进行试验和分析。
本实验以CLSI推荐的细菌孵育16-18小时的标准纸片扩散法（Kirby-Bauer扩散法）的药敏结果作为金标准，将孵育6小时的药敏结果与其对比分析，当两种不同孵育时间的药敏结果出现不符合时，会有不同的表现：敏感（S）可能为耐药（R）或中介（I），耐药（R）可能为敏感（S）或中介（I），中介（I）可能为耐药（R）或敏感（S），故计算其不符合率进行分析更有意义，实验中敏感（S）、中介（I）、耐药（R）的不符合率分别为1.79%、16.14%、2.79%，16种抗菌药物试验符合率为98.6%，很明显，缩短孵育时间进行药敏试验符合率高，标准菌株（大肠埃希菌ATCC25922）用两种不同孵育时间进行药敏试验，两者药敏结果一致，正确率达到100%，具有很高的可信度。另外，两种不同孵育时间的药敏结果比较非常重大错误率为0%，重大错误率<0.2%，药敏总错误率<5%，可以接受。通过本次实验知道，对于感染大肠埃希菌的菌血症患者，细菌孵育6小时后做药敏试验，药敏结果可发出药敏报告，比传统孵育16-18小时后做药敏试验提早10-12 小时报告，给病人及早用药治疗提供了方便，为挽救病人的生命争取了宝贵的时间，特别是对烧伤病人、器官移植、手术感染及其他危重病人的感染更显重要性。
大肠埃希菌生长速度快，在阳性报警后孵育6小时便可生长出一定菌膜，但不能分离出单个的菌落，血流感染多由单一细菌引起，多重细菌感染的比例仅为4.4%，血培养阳性直接接种后孵育6小时进行细菌鉴定和药敏试验具备很高的可行性，如果有两种以上细菌，就必须分离纯菌落以后再做药敏实验，所以涂片结果很重要[7]。
传统血培养阳性检测方法是将阳性培养液转种到固体培养基上，经过24 小时次代培养，再经24 小时的鉴定和药敏试验，才能出具报告，检验速度慢[8]。本实验采用缩短孵育时间进行血培养阳性标本药敏试验，24 小时即可得出鉴定及药敏结果，相比传统方法大大缩短了结果报告时间，为临床医治病人争取了更充分的时机和方向;血培养阳性直接鉴定药敏试验，国内鉴定准确率相对较低，步骤繁琐，全自动鉴定仪血培养阳性结果快只需要1-2天，仪器和试剂价格昂贵[9]。
综上所述，本实验大大缩短了血培养阳性报告时间，操作简单不需要精密仪器，方法可靠，应用药物灵活，很适合在各级医院的实验室开展进行。
参考文献
[1]Lai C C， Wang C Y， Liu W L， et aI. Time to bIood cuIturepositivity as a predictor of drug resistance in Acinetobacterbaumannii compIeX bacteremia [J]. Infect， 2011，63（1）：96-98.
[2]Lai C C， Wang C Y， Liu W L， et aI. Time to bIood cuIturepositivity as a predictor of drug resistance in Acinetobacterbaumannii compIeX bacteremia [J]. Infect， 2011，62 （2）：190-191.
[3]Clinical and Laboratory Standards.M100-S20 Performance standards for antimicrobial Susceptibility testing; twentieth informational supplement [S].USA：CLSI，2010.
[4]叶应妩，王毓三，申子瑜.全国临床检验操作规程.3版.南京：东南大学出版社，2006：896—897.
[5]田月如，阮裴怡等.革兰阴性菌引起的血培养阳性标本的直接鉴定药敏试验.中华微生物和免疫学杂志，2011，31（3）：220-224。
[6]林晓晖，梁卫芳等. 275例血培养阳性标本的病原菌构成及耐药性分析.中国抗生素杂志，2011， 36 （12）：943-947.
[7]毛惠娜，陈国军等.菌血症血培养阳性标本直接药敏实验与常规药敏法比较.武警医学.2011，，22（2）：180-181
[8]刘汉芳，扈会整等.非苛养菌药物敏感试验孵育不同时问后的结果分析研究.现代检验医学杂志，2010，25（3）：110-112
[9]钟玲玲 基层医院血培养阳性标本细菌鉴定和药敏试验的临床研究.首都医药，2011.10（下）：15-16
通讯作者：彭素香，E-mail：[email protected]
【关键词】 血培养阳性 大肠埃希菌 缩短时间
【中图分类号】 R917 【文献标识码】 A 【文章编号】 1671-5160（2015）01-0302-02
血培养是临床微生物检验的主要项目，有重要的临床意义，[1]-[2]快速准确的得到病原菌鉴定和药敏结果，是临床正确及时进行抗感染治疗的关键。常规血培养结果一般需要2—3天，易延误治疗，全自动鉴定仪血培养结果快，只需要1-2天，但价格昂贵。本实验对血培养阳性的大肠埃希菌标本先接种血平板，缩短孵育时间，孵育6小时后进行药敏实验，并与孵育16-18小时后的大肠埃希菌的药敏实验进行比较，以验证该方法的可行性。
1 材料与方法
1.1 一般资料
菌株挑选自我院2012-01至2013-07月间101份血培养阳性标本的大肠埃希菌。
1.2 仪器与试剂
1.2.1 美国BD公司生产的全自动血液培养箱Baetec9120及配套的血培养瓶，哥伦比亚血琼脂平板由广州市迪景微生物科技有限公司提供，水解酪蛋白（Mueller-Hinton）培养基干粉由英国Oxoid公司提供，所用药敏纸片由英国Oxoid公司提供，选用临床常用抗菌药物：氨苄西林（AMP）、氨曲南（ATM）、氨苄西林/舒巴坦（SAM） 、头孢唑啉（CZ）、头孢他啶（CAZ）、头孢曲松（CRO）、头孢呋辛（CXM） 、头孢吡肟（FEP）、头孢西丁（FOX）、左氧氟沙星（LEV）、环丙沙星（CIP）、美罗培南（MEM）、庆大霉素（CN10）、阿米卡星（AK）、复方新诺明（SXT）、哌拉西林/他唑巴坦（TZP）。
1.2.2 药敏试验方法：标准纸片扩散法（Kirby-Bauer扩散法）。
1.2.3 药敏判断标准：结果判定依据美国临床实验室标准化研究
所（CLSI）制定的标准[3]。
1.2.4 质量控制：水解酪蛋白（Mueller-Hinton）培养基平板厚度4 mm，菌悬液0.5麦氏单位应用DensiCHCK比浊仪控制，质控菌株：大肠埃希菌ATCC25922。
1.3 方法
1.3.1 当血培养箱阳性报警后，取出阳性瓶，划线接种至血平板，置于35±2℃温箱孵育6小时，同时用另外的血平板接种标准菌株（大肠埃希菌ATCC25922）一起置于35±2℃温箱孵育6小时。
1.3.2 阳性瓶需涂片，做革兰染色，根据涂片的结果，方可选取单一阴性杆菌用标准纸片扩散法（Kirby-Bauer扩散法）做药敏实验。
1.3.3 取35±2℃温箱孵育6小时，革兰染色为Gˉ杆菌，氧化酶实验阴性的细菌，挑取菌膜制成菌悬液， DensiCHCK比浊仪控制菌悬液0.5麦氏单位，用灭菌棉签将配制好的菌悬液在15 分钟内均匀接种于水解酪蛋白（Mueller-Hinton）培养基，室温平放3-5 分钟，选择药敏纸片，做药敏试验，每直径100mm培养基放置 5个药敏纸片，严格按照文献[4]操作，同时做标准菌株（大肠埃希菌ATCC25922）的药敏试验，置于35±2℃温箱孵育，16-18小时后，记录药敏结果，用游标卡尺测量抑菌环直径，参照CLSI-2012版标准对抑菌环的直径判读，用敏感（S）、中介（I）、耐药（R）表示。而孵育6小时的菌落和标准菌株（大肠埃希菌ATCC25922）继续孵育于温箱，次日8时（22～23 小时后）再次用标准纸片扩散法（Kirby-Bauer扩散法）做药敏试验，放置相应药敏纸片，置于35±2℃温箱孵育，16-18小时后，记录药敏结果，然后将其两组结果进行比较分析。
表1 大肠埃希菌缩短孵育时间药敏试验不符合率
表2 大肠埃希菌缩短孵育时间药敏试验符合率
注：标准符合率[5]：运用美国临床实验室标准化研究所（CLSI）制定的标准解释规则，实验结果和参照方法的预期结果一致，如S、I、R，为符合。非常重大错误：孵育6小时药敏为S而孵育16-18小时药敏为R。重大错误：孵育6小时药敏为R而孵育16-18小时药敏为S。微小错误：孵育6小时药敏为R或S而孵育18-24小时药敏为I;孵育6小时药敏为I而孵育16-18小时药敏为R或S。
1.4 统计学处理
1.4.1 不符合率：细菌孵育6小时的药敏结果与孵育16-18小时的药敏结果分别以敏感（S）、中介（I）、耐药（R）进行统计，计算不符合率。
1.4.2 符合率：以细菌孵育6小时与孵育16-18小时的药敏结果比较，进行每一种抗菌药物符合以及错误的统计，计算16种抗菌药物符合率及错误率。
2 结果
血培养阳性标本大肠埃希菌孵育6小时后和孵育16-18小时后的药敏试验敏感（S）的不符合率1.79%，中介（I）的不符合率16.14%，耐药（R）的不符合率2.79%;16种抗菌药物符合率98.6%，非常重大错误0，重大错误0.1%，微小错误1.24%，缩短孵育时间进行药敏试验，药敏结果可靠，见表1，表2。 3 讨论
本文101株细菌均为实验室血培养阳性标本经过接种鉴定筛选出来的大肠埃希菌。我院血培养阳性标本中肠杆菌科细菌构成比为：大肠埃希菌101例占74.3%，肺炎克雷伯菌27例占19.8%，阴沟肠杆菌3例占2.2%，粘质沙雷菌3例占2.2%，产气肠杆菌1例占0.7%，奇异变形杆菌1例占0.7%。我们选择最常见，数量最多的大肠埃希菌[6]进行试验和分析。
本实验以CLSI推荐的细菌孵育16-18小时的标准纸片扩散法（Kirby-Bauer扩散法）的药敏结果作为金标准，将孵育6小时的药敏结果与其对比分析，当两种不同孵育时间的药敏结果出现不符合时，会有不同的表现：敏感（S）可能为耐药（R）或中介（I），耐药（R）可能为敏感（S）或中介（I），中介（I）可能为耐药（R）或敏感（S），故计算其不符合率进行分析更有意义，实验中敏感（S）、中介（I）、耐药（R）的不符合率分别为1.79%、16.14%、2.79%，16种抗菌药物试验符合率为98.6%，很明显，缩短孵育时间进行药敏试验符合率高，标准菌株（大肠埃希菌ATCC25922）用两种不同孵育时间进行药敏试验，两者药敏结果一致，正确率达到100%，具有很高的可信度。另外，两种不同孵育时间的药敏结果比较非常重大错误率为0%，重大错误率<0.2%，药敏总错误率<5%，可以接受。通过本次实验知道，对于感染大肠埃希菌的菌血症患者，细菌孵育6小时后做药敏试验，药敏结果可发出药敏报告，比传统孵育16-18小时后做药敏试验提早10-12 小时报告，给病人及早用药治疗提供了方便，为挽救病人的生命争取了宝贵的时间，特别是对烧伤病人、器官移植、手术感染及其他危重病人的感染更显重要性。
大肠埃希菌生长速度快，在阳性报警后孵育6小时便可生长出一定菌膜，但不能分离出单个的菌落，血流感染多由单一细菌引起，多重细菌感染的比例仅为4.4%，血培养阳性直接接种后孵育6小时进行细菌鉴定和药敏试验具备很高的可行性，如果有两种以上细菌，就必须分离纯菌落以后再做药敏实验，所以涂片结果很重要[7]。
传统血培养阳性检测方法是将阳性培养液转种到固体培养基上，经过24 小时次代培养，再经24 小时的鉴定和药敏试验，才能出具报告，检验速度慢[8]。本实验采用缩短孵育时间进行血培养阳性标本药敏试验，24 小时即可得出鉴定及药敏结果，相比传统方法大大缩短了结果报告时间，为临床医治病人争取了更充分的时机和方向;血培养阳性直接鉴定药敏试验，国内鉴定准确率相对较低，步骤繁琐，全自动鉴定仪血培养阳性结果快只需要1-2天，仪器和试剂价格昂贵[9]。
综上所述，本实验大大缩短了血培养阳性报告时间，操作简单不需要精密仪器，方法可靠，应用药物灵活，很适合在各级医院的实验室开展进行。
参考文献
[1]Lai C C， Wang C Y， Liu W L， et aI. Time to bIood cuIturepositivity as a predictor of drug resistance in Acinetobacterbaumannii compIeX bacteremia [J]. Infect， 2011，63（1）：96-98.
[2]Lai C C， Wang C Y， Liu W L， et aI. Time to bIood cuIturepositivity as a predictor of drug resistance in Acinetobacterbaumannii compIeX bacteremia [J]. Infect， 2011，62 （2）：190-191.
[3]Clinical and Laboratory Standards.M100-S20 Performance standards for antimicrobial Susceptibility testing; twentieth informational supplement [S].USA：CLSI，2010.
[4]叶应妩，王毓三，申子瑜.全国临床检验操作规程.3版.南京：东南大学出版社，2006：896—897.
[5]田月如，阮裴怡等.革兰阴性菌引起的血培养阳性标本的直接鉴定药敏试验.中华微生物和免疫学杂志，2011，31（3）：220-224。
[6]林晓晖，梁卫芳等. 275例血培养阳性标本的病原菌构成及耐药性分析.中国抗生素杂志，2011， 36 （12）：943-947.
[7]毛惠娜，陈国军等.菌血症血培养阳性标本直接药敏实验与常规药敏法比较.武警医学.2011，，22（2）：180-181
[8]刘汉芳，扈会整等.非苛养菌药物敏感试验孵育不同时问后的结果分析研究.现代检验医学杂志，2010，25（3）：110-112
[9]钟玲玲 基层医院血培养阳性标本细菌鉴定和药敏试验的临床研究.首都医药，2011.10（下）：15-16
通讯作者：彭素香，E-mail：[email protected]