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【摘 要】目的：试寻找一种简单可靠的花椒麻味素（酰胺类）含量的常规检测方法。方法：取新鲜自然风干青花椒，干燥粉碎，过60目筛备用，超临界CO2萃取，进行萃取压力（A）、萃取温度（B）、萃取时间（C）三因素上水平响应面实验，寻找合适的萃取方法；取萃取液备用，分别以甲醛滴定法、高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）测定花椒麻味素（酰胺类）含量，评价甲醛法检测效用。结果：最佳萃取压力28.8Mpa、萃取温度45℃、萃取时间89.1min；滴定法测定样品液花椒麻味成分含量m1=2.195HPLC测定含量B；重复试验花椒麻味成分含量得率为原料（2.053±0.147）%。结论：甲醛滴定法测定花椒麻味素（酰胺类）含量效用较高，但需矫正结果，结果影响因素较多，需做好实验质控。
【关键词】花椒；麻味素；酰胺类；含量测定
花椒是我国“八大调味品”之一，是一种常见厨房佐料、中医辅料。我国是花椒种植、消费大国，花椒产业初步形成。花椒主要成分为挥发油、麻味物质、生物碱、木质素等，对花椒成分提取、纯化、分离是花椒深加工、产品开发领域研究热点[1]。花椒中麻味物质是产生特殊麻味的主要成分，多为一些链状不饱和脂肪酰胺，具有麻醉、镇痛、抑菌、杀虫等多种药理功效[2]。花椒麻味物质检测方法较多，主要包括紫外分光光度法、HPLC等，但这些检测方法较复杂，探索一种常规检测方法非常必要，测定花椒麻味素效用。
1材料与方法
1.1材料、仪器与试剂
新鲜青花椒（九叶青），附近市场购买，自然风干，真空包装。试剂甲醇（分析纯、色谱纯），无水乙醚、丙酮、正己烷等。仪器包括DHG-9240电热恒温鼓风干燥箱、HWS-25恒温水浴锅、LC-20A型高效液相色谱仪、电动粉碎机、电子天平、超临界CO2萃取装置，紫外分光光度计、真空冷冻干燥机等。
1.2方法
1.2.1 萃取、分离、纯化
将干燥花椒放入50°电热鼓风干燥箱中干燥，去籽后粉碎，过60目筛备用。进行超临界CO2萃取，以萃取缸萃取，加热→泵入CO2→萃取釜。实验开始时前30min预热罐中CO2，加热后，检测罐中CO2气体压力，使之维持在4Mpa以上，否则及时更换。将150g粉碎后的花椒导入萃取釜，设定条件参数，打开水箱加热，设定参数，打开冷凝机。气体流量21kg/h，温度55℃，压力36MPa，萃取2h。超临界萃取中含有一部分色素，需进行D152树脂脱色，树脂可吸附色素，但对其他物质无影响，取0.5g超临界萃取样品，以20mL70%乙醇溶解，取3ml加入1g D152树脂三角瓶中，恒温培养箱中震荡过夜，留取备用。
1.2.2 测定
（1）甲醛法测定：取滤液50ml放入250mL锥形瓶，滴加2-3滴甲基红提示剂，以1mol/L NaOH溶液至pH=6，除去剩余酸，加入18%甲醛溶液，滴加2-3滴酚酞充分摇匀，静止5min，以0.1mol/L的NaOH滴定至pH=9，记录二次滴定NaOH体积，以计算胺态氮含量，以摩尔质量转换，反映酰胺类花椒麻味素含量。
（2）HPLC：验证试验，色谱柱：Shim-PACK C18（4mm×250mm，5μm），流动相60%甲醇-水溶液，洗脱50min，254nm，40℃，1.0mL/min，进样5μL；计算花椒麻味物质浓度与峰面积关系较好，y=98761x-106843（R2=0.9996），麻味物质含量/（mg/g）=麻味物质量（μg）×稀释倍数（ml）/样品取样量×进样量（μL）。
1.3统计学处理
数据资料以EXCEL录入，转Design Expert 8.0软件处理，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，若服从正态分布组间比较采用t检验，否则采用非参数检验，P<0.05表示差异具有统计学意义。
2结果
2.1超临界萃取条件
萃取压力（A）/Mpa：26.5、28、29.5，萃取温度（B）/℃：42.5、45.0、47.5，萃取时间（C）/min：75、90、105，进行三因素上水平响应面实验，设计15个实验方案，获得萃取液再以HPLC法测定150g花椒麻味物质，含量分别为2.124g、1.909g、1.642g、1.774g、3.185g、2.287g、3.284g、2.848g、2.301g、2.576g、2.514g、1.935g、2.534g、2.474g、2.484g，建立回归模型，R=2.51+0.19A-0.27B-8.084E-0.03C-0.33AB+0.11AC+0.091BC-0.47A2+0.43B2-0.15C2，并进行方差分析，P=0.1142>0.05，差异不显著，提示二次回归模型有效，回归方程显著性检验P=0.002，差异具体统计学意义，模型成立，条件对麻味物质提出率大小分别为萃取温度（B）>萃取压力（A）>萃取时间（C），AB、AC存在极显著交互作用，软件分析最佳萃取压力28.8Mpa、萃取温度45℃、萃取时间89.1min。重复试验10次，150g花椒萃取花椒麻味物质含量为（3.072±0.045）g，提取率74.5%，达到较高水平。
2.2 不同方法测定花椒麻味成分含量
滴定法测定样品液花椒麻味成分含量m1（23.439±0.142）mg/g，HPLC测定m2（51.471±0.041）mg/g。测定法测定值与HPLC测定值存在系统误差，且存在误差，且存在线性关系，拟合优度检验t=0.009，P=0.001<0.05，提示差异具有统计学意义，线性关系存在，m1校正值=2.195m1（R2=0.987）。
重复试验15次，以HPLC为最终检测结果，进行验证，该花椒麻味成分得率为原料的（2.048±0.097）%，以滴定法测定花椒麻味成分含量得率为原料（2.053±0.147）%，差异无统计学意义（P>0.05）。
3讨论
多数研究表明，超临界萃取率是当前提出率最高的几种提取方法，较浸提法、超声提取法提取效率更高。本次研究验中，超临界CO2提取率达到74.5%，可满足检测需要。当前，花椒麻味成分含量测定HPLC、气质联用法（GC-MS）等，都适用于实验室检测，精度高，本次研究HPLC为定量检测标准。
甲醛滴定法测定样品液花椒麻味成分含量与HPLC测定结果存在线性关系，检测结果稳定性强，拟合优度检验，差异具有统计学意义（P<0.05），故可通过矫正甲醛滴定检测结果换算成HPLC测定结果，反映样品中真实含有的麻味成分含量。需注意的是，花椒中麻味成分含量影响因素较多，包括保存时间、环境温度、提取与萃取、检测技术标准等，以甲醛滴定法测定结果变异系数0.006>HPLC测定7.771×10-4，甲醛法精度可能存在不足情况，可能与该法试验中质控影响因素较多有关。甲醛滴定法试验中肉眼观察到项目较多，且实验开放性强，造成实验无创。
综上所述：甲醛滴定法测定花椒麻味素（酰胺类）含量效用较高，但需矫正结果，还需在做好实验室质控。
参考文献
[1]张华，叶萌青花椒的分类地位及成分研究现状[J].北方园艺，2010（14）：199-203.
[2]石雪萍，张卫明，张鸣镝花椒总生物碱镇痛、抗炎、止痒作用研究[J].中国野生植物资源，2011，30（1）：46-49.
【关键词】花椒；麻味素；酰胺类；含量测定
花椒是我国“八大调味品”之一，是一种常见厨房佐料、中医辅料。我国是花椒种植、消费大国，花椒产业初步形成。花椒主要成分为挥发油、麻味物质、生物碱、木质素等，对花椒成分提取、纯化、分离是花椒深加工、产品开发领域研究热点[1]。花椒中麻味物质是产生特殊麻味的主要成分，多为一些链状不饱和脂肪酰胺，具有麻醉、镇痛、抑菌、杀虫等多种药理功效[2]。花椒麻味物质检测方法较多，主要包括紫外分光光度法、HPLC等，但这些检测方法较复杂，探索一种常规检测方法非常必要，测定花椒麻味素效用。
1材料与方法
1.1材料、仪器与试剂
新鲜青花椒（九叶青），附近市场购买，自然风干，真空包装。试剂甲醇（分析纯、色谱纯），无水乙醚、丙酮、正己烷等。仪器包括DHG-9240电热恒温鼓风干燥箱、HWS-25恒温水浴锅、LC-20A型高效液相色谱仪、电动粉碎机、电子天平、超临界CO2萃取装置，紫外分光光度计、真空冷冻干燥机等。
1.2方法
1.2.1 萃取、分离、纯化
将干燥花椒放入50°电热鼓风干燥箱中干燥，去籽后粉碎，过60目筛备用。进行超临界CO2萃取，以萃取缸萃取，加热→泵入CO2→萃取釜。实验开始时前30min预热罐中CO2，加热后，检测罐中CO2气体压力，使之维持在4Mpa以上，否则及时更换。将150g粉碎后的花椒导入萃取釜，设定条件参数，打开水箱加热，设定参数，打开冷凝机。气体流量21kg/h，温度55℃，压力36MPa，萃取2h。超临界萃取中含有一部分色素，需进行D152树脂脱色，树脂可吸附色素，但对其他物质无影响，取0.5g超临界萃取样品，以20mL70%乙醇溶解，取3ml加入1g D152树脂三角瓶中，恒温培养箱中震荡过夜，留取备用。
1.2.2 测定
（1）甲醛法测定：取滤液50ml放入250mL锥形瓶，滴加2-3滴甲基红提示剂，以1mol/L NaOH溶液至pH=6，除去剩余酸，加入18%甲醛溶液，滴加2-3滴酚酞充分摇匀，静止5min，以0.1mol/L的NaOH滴定至pH=9，记录二次滴定NaOH体积，以计算胺态氮含量，以摩尔质量转换，反映酰胺类花椒麻味素含量。
（2）HPLC：验证试验，色谱柱：Shim-PACK C18（4mm×250mm，5μm），流动相60%甲醇-水溶液，洗脱50min，254nm，40℃，1.0mL/min，进样5μL；计算花椒麻味物质浓度与峰面积关系较好，y=98761x-106843（R2=0.9996），麻味物质含量/（mg/g）=麻味物质量（μg）×稀释倍数（ml）/样品取样量×进样量（μL）。
1.3统计学处理
数据资料以EXCEL录入，转Design Expert 8.0软件处理，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，若服从正态分布组间比较采用t检验，否则采用非参数检验，P<0.05表示差异具有统计学意义。
2结果
2.1超临界萃取条件
萃取压力（A）/Mpa：26.5、28、29.5，萃取温度（B）/℃：42.5、45.0、47.5，萃取时间（C）/min：75、90、105，进行三因素上水平响应面实验，设计15个实验方案，获得萃取液再以HPLC法测定150g花椒麻味物质，含量分别为2.124g、1.909g、1.642g、1.774g、3.185g、2.287g、3.284g、2.848g、2.301g、2.576g、2.514g、1.935g、2.534g、2.474g、2.484g，建立回归模型，R=2.51+0.19A-0.27B-8.084E-0.03C-0.33AB+0.11AC+0.091BC-0.47A2+0.43B2-0.15C2，并进行方差分析，P=0.1142>0.05，差异不显著，提示二次回归模型有效，回归方程显著性检验P=0.002，差异具体统计学意义，模型成立，条件对麻味物质提出率大小分别为萃取温度（B）>萃取压力（A）>萃取时间（C），AB、AC存在极显著交互作用，软件分析最佳萃取压力28.8Mpa、萃取温度45℃、萃取时间89.1min。重复试验10次，150g花椒萃取花椒麻味物质含量为（3.072±0.045）g，提取率74.5%，达到较高水平。
2.2 不同方法测定花椒麻味成分含量
滴定法测定样品液花椒麻味成分含量m1（23.439±0.142）mg/g，HPLC测定m2（51.471±0.041）mg/g。测定法测定值与HPLC测定值存在系统误差，且存在误差，且存在线性关系，拟合优度检验t=0.009，P=0.001<0.05，提示差异具有统计学意义，线性关系存在，m1校正值=2.195m1（R2=0.987）。
重复试验15次，以HPLC为最终检测结果，进行验证，该花椒麻味成分得率为原料的（2.048±0.097）%，以滴定法测定花椒麻味成分含量得率为原料（2.053±0.147）%，差异无统计学意义（P>0.05）。
3讨论
多数研究表明，超临界萃取率是当前提出率最高的几种提取方法，较浸提法、超声提取法提取效率更高。本次研究验中，超临界CO2提取率达到74.5%，可满足检测需要。当前，花椒麻味成分含量测定HPLC、气质联用法（GC-MS）等，都适用于实验室检测，精度高，本次研究HPLC为定量检测标准。
甲醛滴定法测定样品液花椒麻味成分含量与HPLC测定结果存在线性关系，检测结果稳定性强，拟合优度检验，差异具有统计学意义（P<0.05），故可通过矫正甲醛滴定检测结果换算成HPLC测定结果，反映样品中真实含有的麻味成分含量。需注意的是，花椒中麻味成分含量影响因素较多，包括保存时间、环境温度、提取与萃取、检测技术标准等，以甲醛滴定法测定结果变异系数0.006>HPLC测定7.771×10-4，甲醛法精度可能存在不足情况，可能与该法试验中质控影响因素较多有关。甲醛滴定法试验中肉眼观察到项目较多，且实验开放性强，造成实验无创。
综上所述：甲醛滴定法测定花椒麻味素（酰胺类）含量效用较高，但需矫正结果，还需在做好实验室质控。
参考文献
[1]张华，叶萌青花椒的分类地位及成分研究现状[J].北方园艺，2010（14）：199-203.
[2]石雪萍，张卫明，张鸣镝花椒总生物碱镇痛、抗炎、止痒作用研究[J].中国野生植物资源，2011，30（1）：46-49.