目的建立一种灵敏、快速、稳定的超高效液相色谱串联质谱（UPLC-MS/MS）法测定人血清中苯妥英的浓度,并探讨其在苯妥英治疗药物监测（TDM）中的应用。方法在血清添加同位素内标苯妥英-D₁₀,经乙腈沉淀蛋白后,以Shim-pack XR-ODSⅢ（50 mm×2.0 mm,1.6μm）为分析柱进行反相色谱分离,以0.1%乙酸水溶液、乙腈为流动相进行梯度洗脱,流速为0.3 mL·min^-1;以电喷雾离子化串联四级杆质谱、正离子多反应监测进行定量检测,监测离子反应分别为m/z 253.3→182.2（苯妥英）,m/z 263.3→192.3(内标苯妥英-D₁₀)。用建立的方法参加2018年上半年卫生部临床检验中心茶碱TDM室间质量评价。结果 UPLC-MS/MS法检测苯妥英的线性范围为0.016～2.051 mg·L^-1,批内和批间精密度分别为1.68%～4.98%和1.49%～3.82%,准确度均为85%～115%。样本的提取回收率≥93%,基质效应≥97%。室温放置6 h、自动进样器放置18 h的稳定性均良好。UPLC-MS/MS法测定结果参与室间质评样本均合格。结论该UPLC-MS/MS法采用同位素内标法,具有前处理简单、检测快速、特异性好和灵敏度高的特点,测定结果符合全国室间质量评价要求,可用于苯妥英的临床TDM。