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目的：探讨两步酶法分离小鼠睾丸支持细胞以及在体外培养、纯化、鉴定过程中的优越性。方法：选取7-8d雄性昆明小鼠，用胶原酶Ⅳ及胰蛋白酶两步酶法分离小鼠睾丸组织获得支持细胞，利用细胞差速贴壁特性纯化支持细胞，利用倒置显微镜、PI染色、特异性抗体标记的方法从多个维度鉴定小鼠睾丸支持细胞。结果：培养72h后支持细胞呈片状平铺于培养皿底层，相互接触，连接成片。用波形蛋白特异性鉴定证实本实验分离所获得的小鼠睾丸支持细胞。经过PI染色提示这些支持细胞为具有活性的支持细胞。结论：本研究提示两部酶法是一种简便且高效的分离小