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滩涂适生金银花组培体系的构建与优化
李诗卉， 刘榕焱， 叶 琦， 李 梅， 王长海， 赵耕毛*（南京农业大学资源与环境科学学院江苏省海洋生物学重点实验室，江苏南京 210095）
摘要 [目的]构建并优化滩涂适生金银花的组培体系。[方法]以具有活力的金银花茎段、叶芽和叶片为材料，采用混合水平的正交试验设计，以MS为基本培养基，与不同浓度比例的NAA、IBA、6BA、KT等植物生长调节剂构成金银花诱导愈伤组织、丛芽分化、生根的组合方案，对金银花组织培养快繁技术开展系统研究。[结果]外植体类型影响愈伤组织的产生，叶芽的愈伤组织诱导分化率显著高于茎段和叶片（P<0.05），诱导出的愈伤组织结构紧密。不同植物生长调节剂组合的培养基对愈伤组织的诱导率也有显著影响（P<0.05）。愈伤组织在培养基MS+0.05 mg/L 6BA+1.0 mg/L NAA中生长良好，具备较高的分化能力。含有低浓度的生长素和分裂素的培养基MS+0.1 mg/L 6BA+0.05 mg/L NAA更有利于金银花愈伤组织诱导丛芽分化，能够从数量和质量上改善分化出的丛芽素质。在诱导根分化的培养基MS+0.03 mg/L NAA+1.00 mg/L IBA中，根的分化效率明显提高，丛根更为密集，有利于扩大繁殖系数。[结论]试验为金银花提供了从“外植体选择→诱导愈伤组织→丛芽分化→生根”等整个过程中优化的组培快繁体系，为耐盐金银花滩涂规模化种植提供了技术支撑。
關键词 金银花（FLOS LONICERAE JAPONICAE）；组织培养；愈伤组织；正交试验
中图分类号 S567.7+9 文献标识码
A 文章编号 0517-6611（2014）08-02282-04
The Construction and Optimization of Tissue Culture System of Beach Suitable Honeysuckle
LI Shihui， ZHAO Gengmao et al （Jiangsu Key Laboratory of Marine Biology， School of Resource and Environmental Science， Nanjing Agricultural University， Nanjing， Jiangsu 210095）
Abstract [Objective] To construct and optimize tissue culture system of beach suitable honeysuckle. [Method] The mature stem foliar bud and blade were used as the explants using the mixed level orthogonal experiment design， and the combining medium schemes for inducing callus， differentiation and rooting， etc. were designed with different concentration of NAA IBA 6BA KT based on the MS culture medium， and the system of tissue culture and rapid propagation of honeysuckle was studied. [Result] The results showed that the callus development was effectively influenced by explants’ types， and hormone concentrations of media. The callus
induction and plant regeneration of foliar bud were significantly higher than the mature stem and blades’， and it also can induce callus with compact constitution. The result also showed that the culture medium with different Plant Growth Regulators combination had great effect on the inducing rate， the best medium for callus induction was MS+6BA 0.05 mg/L+NAA 1.0 mg/L. MS with low concentration of auxin and cytokinin is adapt to inducing the differentiation of tufted bud by the callus of Honeysuckle， which is MS+NAA 0.03 mg/L+IBA 1.00 mg/L. The MS， MS+NAA 0.03 mg/L+IBA 1.00 mg/L， which induce the differentiation of roots can significantly improve the inducing rate of roots， make the tufted roots more compact and improve the propagative rate. [Conclusion] A technical system of tissue culture and rapid propagation of honeysuckle involves the optimum medium of every experiment step and the operating rules（the choice of explantsthe induction of callusthe differentiation of tufted bud rooting） is provided in this study. Key words FLOS LONICERAE JAPONICAE； Tissue culture； Callus； Orthogonal test
金银花（FLOS LONICERAE JAPONICAE）为忍冬科植物忍冬（Lonicera japonica Thunb.）的干燥花蕾或带初开的花，含有挥发油、黄酮类、三萜皂苷、有机酸及无机元素等，具有抑菌、抗病毒、解热、抗炎、保肝和抗艾滋病等作用[1]。近年来，在中国逐渐被用作园林绿化观赏、地被建设的优良材料，还是极具开发潜力的药用、经济植物资源，同时优异耐盐、抗旱基因也有待开发。课题组在耐盐金银花前期研究基础上，着重介绍金银花外植体的选择、愈伤组织培养的方法，并改良了金银花愈伤组织诱导丛芽、丛根的培养方法，以建立完善的金银花组培快繁体系[10]。笔者对金银花组织培养快繁的技术进行研究，以期为耐盐金银花种苗产业化和规模化滩涂种植提供技术保障。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 研究對象。试验材料为当年生金银花茎段、叶芽和叶片，时间为春季[4]。材料选自安徽亳州。
1.1.2 主要试剂。所用试剂均为国产分析纯，市售。
1.2 方法
1.2.1 外植体消毒处理。取金银花茎段、叶芽和叶片，叶片切成0.5 cm×0.5 cm大小[3]，叶芽部位保留1.0 cm，茎段剪取1.5～2.0 cm[2]，振荡洗涤后，用去离子水中浸泡15～20 min，放入超净工作台里，紫外灯照射5 min，无菌水震荡洗涤1次。再用浓度75%乙醇和浓度4%次氯酸钠消毒[8]，消毒时间如表1；无菌水冲洗6次，用无菌滤纸吸干外植体表面的水分。
1.2.2 诱导愈伤组织。以MS培养基为基本培养基，添加不同浓度的生长调节剂，共设计25种愈伤组织诱导培养基M1M25（表2）。所有培养基内均添加1.5 g蔗糖，0.35 g琼脂，调至pH 5.8[4]。分装于植物分化培养罐中，每罐50 ml，封口后在116 ℃条件下灭菌30 min，待培养基冷凝后，紫外线表面灭菌30 min，接种。在每种浓度处理中，每种材料接种3个罐子，每个罐子每种材料接种4个，重复3次。处理完后，组培苗均放在光照强度2 000 lx下28 ℃光照12 h/d，光照强度0 lx下25 ℃光照12 h/d的光照培养箱中培养[5]。
1.2.3 诱导丛芽分化。以MS培养基为基本培养基，添加不同浓度生长调节剂[9]，共设计24种丛芽诱导培养基Y1Y24（表3）。在无菌条件工作条件下，将长势良好、结构紧实、质地青绿的愈伤组织块取出，放在无菌滤纸上吸去多余水分，去除边角褐化或玻璃化严重的区域，接种。在每种浓度处理中，每种材料接种3个罐子，每个罐子每种材料接种4个，重复3次。
1.2.4 诱导根分化。以MS培养基为基本培养基，添加不同浓度生长调节剂，共设计24种愈伤组织诱导培养基G1G24（表4）[6]。在无菌条件工作条件下，转接已分化出丛芽的愈伤组织块。在每种浓度处理中，每种材料接种3个罐子，每个罐子每种材料接种4个，重复3次。
1.2.5 试验数据处理。将试验中统计出来的数据按以下方法进行处理[7]：愈伤组织诱导率（%）=（产生愈伤组织总数/接种的外植体总数）×100；不定芽诱导率（%）=（产生不定芽的愈伤组织/接种的愈伤组织总数）×100；生根率（%）=（生根的不定芽数/接种的不定芽数）×100；运用数理统分析软件IBM SPSS Statistics 20进行方差分析。
2 结果与分析
2.1 不同类型的外植体对诱导愈伤组织的效果的影响 图1表明，叶芽在接种后第7天，所有叶芽切口均有膨大现象，并出现颗粒状愈伤组织。而叶片切口处有膨大现象最早是第6天，9 d后所有叶片切口具有膨大现象，15 d后有颗粒状的愈伤组织出现。叶芽比叶片出现愈伤组织的时间早2～7 d，并且，叶芽产生的愈伤组织其生长势明显优于叶片。对比发现，用茎段作外植体，诱导速度明显低于叶芽和叶片。
图1 外植株对愈伤组织的影响
2.2 培养基内激素对诱导愈伤组织的影响 由表5可知，6BA浓度为0时，NAA是在0.80～1.0 mg/L浓度范围内诱导效果较好，其中以浓度1.00 mg/L NAA的效果最佳，30 d内的诱导率高达88.45%。随浓度升高诱导率下降，与NAA浓度为1.00 mg/L产生了显著差异（P<0.05）；浓度低于0.50 mg/L，诱导效果欠佳，与NAA浓度为1.00 mg/L产生极显著差异（P<0.01）。NAA浓度为0时，6BA的作用效果随浓度梯度的增大而减少，为浓度0.05 mg/L 6BA与2.00 mg/L的诱导率产生了极显著的差异（P<0.01）。
2.4 培养基内激素对诱导根分化的影响 将带有不定丛芽的愈伤组织块转接到诱导根分化的培养基20 d后，带有不定丛芽的愈伤组织均有长出不定根（表8）。
在培养基MS+ 0.03 mg/L NAA+1.00 mg/L IBA上，20 d内根的分化最多、最快，分化率高达93.30%（图5）。NAA浓度相同时，随着IBA浓度的变化，根分化率产生了显著差异，随着NAA浓度梯度递增，分化丛根的愈伤组织块数量总体减少，根分化率降低。
3 结论与讨论
叶芽相对于叶片和茎段外植体诱导愈伤组织的速度快，成活率高。诱导出来的愈伤组织结构紧实、质地青翠。生长调节剂6BA与NAA结合使用的诱导率会高于单个生长调节剂，从而筛选出金银花诱导愈伤组织的最佳培养基为MS+0.05 mg/L 6BA+1.0 mg/L NAA。
金银花诱导不定丛芽的最佳培养基为MS+0.1 mg/L 6BA+0.05 mg/L NAA。低浓度的6BA不会引起细胞的过度分裂，造成幼苗叶子枯黄的现象。激动素KT会加速细胞分裂，形成稀疏泛黄的苗株，不宜施用于幼芽的愈伤组织块。
金银花诱导不定丛根的最佳培养基为MS+0.03 mg/L NAA+1.00 mg/L IBA，低浓度的NAA配合生长素IBA，更利于侧根的形成。
参考文献
[1]
茅青，曹东，贾宪生.灰毡毛忍冬化学成分的研究[J].药学学报，1993，28（4）：273-278.
[2] 王晓明，李永欣，聂启英.金银花组织培养的研究进展[J].湖南林业科技，2006（4）：1-3.
[3] 赵贤慧，刘庆华，王奎玲，等.诱导红金银花愈伤组织的影响因素研究[J].山东林业科技，2007（1）：9-11.
[4] 刘连芬，钱关泽.金银花愈伤组织的诱导和分化[J]. 聊城大学学报：自然科学版，2007（4）： 48-50，107.
[5] 易霭琴，王晓明，宋庆安，等.灰毡毛忍冬（金银花）组培苗移栽技术研究[J]. 湖南林业科技，2005（3）：34-35.
[6] 王晓明，李永欣，易霭琴，等.灰毡毛忍冬新品种组培高效增殖体系的建立[J].林业科技开发，2006，20（6）：62-64.
[7] 韩蓉，于晓英，郑梦龙，等.湘蕾金银花叶柄、茎段的离体培养与植株再生[J]. 中国园艺文摘，2012（12）：1-3，18.
[8] 赵贤慧，刘庆华，张德锋.红金银花组织培养外植体灭菌的研究[J]. 江苏林业科技，2007（1）：23-25.
[9] 曹芳莉. 灰毡毛忍冬（金银花）愈伤组织及多倍体的诱导[D].长沙：中南林业科技大学，2008.
[10] 梁小敏，罗赣丰，吴淼生.金银花快繁技术比较研究[J].安徽农业科学，2008（32）：13964-13965.
[11] 王慧俐，江小红.灰毡毛忍冬（ 金银花） 的组织培养研究[J]. 安徽农业科学，2013（30）：11952-11953，11964.
李诗卉， 刘榕焱， 叶 琦， 李 梅， 王长海， 赵耕毛*（南京农业大学资源与环境科学学院江苏省海洋生物学重点实验室，江苏南京 210095）
摘要 [目的]构建并优化滩涂适生金银花的组培体系。[方法]以具有活力的金银花茎段、叶芽和叶片为材料，采用混合水平的正交试验设计，以MS为基本培养基，与不同浓度比例的NAA、IBA、6BA、KT等植物生长调节剂构成金银花诱导愈伤组织、丛芽分化、生根的组合方案，对金银花组织培养快繁技术开展系统研究。[结果]外植体类型影响愈伤组织的产生，叶芽的愈伤组织诱导分化率显著高于茎段和叶片（P<0.05），诱导出的愈伤组织结构紧密。不同植物生长调节剂组合的培养基对愈伤组织的诱导率也有显著影响（P<0.05）。愈伤组织在培养基MS+0.05 mg/L 6BA+1.0 mg/L NAA中生长良好，具备较高的分化能力。含有低浓度的生长素和分裂素的培养基MS+0.1 mg/L 6BA+0.05 mg/L NAA更有利于金银花愈伤组织诱导丛芽分化，能够从数量和质量上改善分化出的丛芽素质。在诱导根分化的培养基MS+0.03 mg/L NAA+1.00 mg/L IBA中，根的分化效率明显提高，丛根更为密集，有利于扩大繁殖系数。[结论]试验为金银花提供了从“外植体选择→诱导愈伤组织→丛芽分化→生根”等整个过程中优化的组培快繁体系，为耐盐金银花滩涂规模化种植提供了技术支撑。
關键词 金银花（FLOS LONICERAE JAPONICAE）；组织培养；愈伤组织；正交试验
中图分类号 S567.7+9 文献标识码
A 文章编号 0517-6611（2014）08-02282-04
The Construction and Optimization of Tissue Culture System of Beach Suitable Honeysuckle
LI Shihui， ZHAO Gengmao et al （Jiangsu Key Laboratory of Marine Biology， School of Resource and Environmental Science， Nanjing Agricultural University， Nanjing， Jiangsu 210095）
Abstract [Objective] To construct and optimize tissue culture system of beach suitable honeysuckle. [Method] The mature stem foliar bud and blade were used as the explants using the mixed level orthogonal experiment design， and the combining medium schemes for inducing callus， differentiation and rooting， etc. were designed with different concentration of NAA IBA 6BA KT based on the MS culture medium， and the system of tissue culture and rapid propagation of honeysuckle was studied. [Result] The results showed that the callus development was effectively influenced by explants’ types， and hormone concentrations of media. The callus
induction and plant regeneration of foliar bud were significantly higher than the mature stem and blades’， and it also can induce callus with compact constitution. The result also showed that the culture medium with different Plant Growth Regulators combination had great effect on the inducing rate， the best medium for callus induction was MS+6BA 0.05 mg/L+NAA 1.0 mg/L. MS with low concentration of auxin and cytokinin is adapt to inducing the differentiation of tufted bud by the callus of Honeysuckle， which is MS+NAA 0.03 mg/L+IBA 1.00 mg/L. The MS， MS+NAA 0.03 mg/L+IBA 1.00 mg/L， which induce the differentiation of roots can significantly improve the inducing rate of roots， make the tufted roots more compact and improve the propagative rate. [Conclusion] A technical system of tissue culture and rapid propagation of honeysuckle involves the optimum medium of every experiment step and the operating rules（the choice of explantsthe induction of callusthe differentiation of tufted bud rooting） is provided in this study. Key words FLOS LONICERAE JAPONICAE； Tissue culture； Callus； Orthogonal test
金银花（FLOS LONICERAE JAPONICAE）为忍冬科植物忍冬（Lonicera japonica Thunb.）的干燥花蕾或带初开的花，含有挥发油、黄酮类、三萜皂苷、有机酸及无机元素等，具有抑菌、抗病毒、解热、抗炎、保肝和抗艾滋病等作用[1]。近年来，在中国逐渐被用作园林绿化观赏、地被建设的优良材料，还是极具开发潜力的药用、经济植物资源，同时优异耐盐、抗旱基因也有待开发。课题组在耐盐金银花前期研究基础上，着重介绍金银花外植体的选择、愈伤组织培养的方法，并改良了金银花愈伤组织诱导丛芽、丛根的培养方法，以建立完善的金银花组培快繁体系[10]。笔者对金银花组织培养快繁的技术进行研究，以期为耐盐金银花种苗产业化和规模化滩涂种植提供技术保障。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 研究對象。试验材料为当年生金银花茎段、叶芽和叶片，时间为春季[4]。材料选自安徽亳州。
1.1.2 主要试剂。所用试剂均为国产分析纯，市售。
1.2 方法
1.2.1 外植体消毒处理。取金银花茎段、叶芽和叶片，叶片切成0.5 cm×0.5 cm大小[3]，叶芽部位保留1.0 cm，茎段剪取1.5～2.0 cm[2]，振荡洗涤后，用去离子水中浸泡15～20 min，放入超净工作台里，紫外灯照射5 min，无菌水震荡洗涤1次。再用浓度75%乙醇和浓度4%次氯酸钠消毒[8]，消毒时间如表1；无菌水冲洗6次，用无菌滤纸吸干外植体表面的水分。
1.2.2 诱导愈伤组织。以MS培养基为基本培养基，添加不同浓度的生长调节剂，共设计25种愈伤组织诱导培养基M1M25（表2）。所有培养基内均添加1.5 g蔗糖，0.35 g琼脂，调至pH 5.8[4]。分装于植物分化培养罐中，每罐50 ml，封口后在116 ℃条件下灭菌30 min，待培养基冷凝后，紫外线表面灭菌30 min，接种。在每种浓度处理中，每种材料接种3个罐子，每个罐子每种材料接种4个，重复3次。处理完后，组培苗均放在光照强度2 000 lx下28 ℃光照12 h/d，光照强度0 lx下25 ℃光照12 h/d的光照培养箱中培养[5]。
1.2.3 诱导丛芽分化。以MS培养基为基本培养基，添加不同浓度生长调节剂[9]，共设计24种丛芽诱导培养基Y1Y24（表3）。在无菌条件工作条件下，将长势良好、结构紧实、质地青绿的愈伤组织块取出，放在无菌滤纸上吸去多余水分，去除边角褐化或玻璃化严重的区域，接种。在每种浓度处理中，每种材料接种3个罐子，每个罐子每种材料接种4个，重复3次。
1.2.4 诱导根分化。以MS培养基为基本培养基，添加不同浓度生长调节剂，共设计24种愈伤组织诱导培养基G1G24（表4）[6]。在无菌条件工作条件下，转接已分化出丛芽的愈伤组织块。在每种浓度处理中，每种材料接种3个罐子，每个罐子每种材料接种4个，重复3次。
1.2.5 试验数据处理。将试验中统计出来的数据按以下方法进行处理[7]：愈伤组织诱导率（%）=（产生愈伤组织总数/接种的外植体总数）×100；不定芽诱导率（%）=（产生不定芽的愈伤组织/接种的愈伤组织总数）×100；生根率（%）=（生根的不定芽数/接种的不定芽数）×100；运用数理统分析软件IBM SPSS Statistics 20进行方差分析。
2 结果与分析
2.1 不同类型的外植体对诱导愈伤组织的效果的影响 图1表明，叶芽在接种后第7天，所有叶芽切口均有膨大现象，并出现颗粒状愈伤组织。而叶片切口处有膨大现象最早是第6天，9 d后所有叶片切口具有膨大现象，15 d后有颗粒状的愈伤组织出现。叶芽比叶片出现愈伤组织的时间早2～7 d，并且，叶芽产生的愈伤组织其生长势明显优于叶片。对比发现，用茎段作外植体，诱导速度明显低于叶芽和叶片。
图1 外植株对愈伤组织的影响
2.2 培养基内激素对诱导愈伤组织的影响 由表5可知，6BA浓度为0时，NAA是在0.80～1.0 mg/L浓度范围内诱导效果较好，其中以浓度1.00 mg/L NAA的效果最佳，30 d内的诱导率高达88.45%。随浓度升高诱导率下降，与NAA浓度为1.00 mg/L产生了显著差异（P<0.05）；浓度低于0.50 mg/L，诱导效果欠佳，与NAA浓度为1.00 mg/L产生极显著差异（P<0.01）。NAA浓度为0时，6BA的作用效果随浓度梯度的增大而减少，为浓度0.05 mg/L 6BA与2.00 mg/L的诱导率产生了极显著的差异（P<0.01）。
2.4 培养基内激素对诱导根分化的影响 将带有不定丛芽的愈伤组织块转接到诱导根分化的培养基20 d后，带有不定丛芽的愈伤组织均有长出不定根（表8）。
在培养基MS+ 0.03 mg/L NAA+1.00 mg/L IBA上，20 d内根的分化最多、最快，分化率高达93.30%（图5）。NAA浓度相同时，随着IBA浓度的变化，根分化率产生了显著差异，随着NAA浓度梯度递增，分化丛根的愈伤组织块数量总体减少，根分化率降低。
3 结论与讨论
叶芽相对于叶片和茎段外植体诱导愈伤组织的速度快，成活率高。诱导出来的愈伤组织结构紧实、质地青翠。生长调节剂6BA与NAA结合使用的诱导率会高于单个生长调节剂，从而筛选出金银花诱导愈伤组织的最佳培养基为MS+0.05 mg/L 6BA+1.0 mg/L NAA。
金银花诱导不定丛芽的最佳培养基为MS+0.1 mg/L 6BA+0.05 mg/L NAA。低浓度的6BA不会引起细胞的过度分裂，造成幼苗叶子枯黄的现象。激动素KT会加速细胞分裂，形成稀疏泛黄的苗株，不宜施用于幼芽的愈伤组织块。
金银花诱导不定丛根的最佳培养基为MS+0.03 mg/L NAA+1.00 mg/L IBA，低浓度的NAA配合生长素IBA，更利于侧根的形成。
参考文献
[1]
茅青，曹东，贾宪生.灰毡毛忍冬化学成分的研究[J].药学学报，1993，28（4）：273-278.
[2] 王晓明，李永欣，聂启英.金银花组织培养的研究进展[J].湖南林业科技，2006（4）：1-3.
[3] 赵贤慧，刘庆华，王奎玲，等.诱导红金银花愈伤组织的影响因素研究[J].山东林业科技，2007（1）：9-11.
[4] 刘连芬，钱关泽.金银花愈伤组织的诱导和分化[J]. 聊城大学学报：自然科学版，2007（4）： 48-50，107.
[5] 易霭琴，王晓明，宋庆安，等.灰毡毛忍冬（金银花）组培苗移栽技术研究[J]. 湖南林业科技，2005（3）：34-35.
[6] 王晓明，李永欣，易霭琴，等.灰毡毛忍冬新品种组培高效增殖体系的建立[J].林业科技开发，2006，20（6）：62-64.
[7] 韩蓉，于晓英，郑梦龙，等.湘蕾金银花叶柄、茎段的离体培养与植株再生[J]. 中国园艺文摘，2012（12）：1-3，18.
[8] 赵贤慧，刘庆华，张德锋.红金银花组织培养外植体灭菌的研究[J]. 江苏林业科技，2007（1）：23-25.
[9] 曹芳莉. 灰毡毛忍冬（金银花）愈伤组织及多倍体的诱导[D].长沙：中南林业科技大学，2008.
[10] 梁小敏，罗赣丰，吴淼生.金银花快繁技术比较研究[J].安徽农业科学，2008（32）：13964-13965.
[11] 王慧俐，江小红.灰毡毛忍冬（ 金银花） 的组织培养研究[J]. 安徽农业科学，2013（30）：11952-11953，11964.