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摘要：目的 检测DcR3基因在肺癌组织中的表达，探讨该基因在肺癌发病中的意义。方法 采用SP免疫组织化学方法检测60例肺癌组织（实验组）及60例正常肺组织（对照组）中DcR3基因的表达水平。结果 在60例肺癌组织中，DcR3基因的阳性表达率分别为68.33%，在60例正常肺组织中，其阳性表达率为45.2%，DcR3基因在两组组织中的表达均有显著性差异（P<0.05）。结论DcR3基因在肺癌组织中的表达显著高于正常组织，它可能是一个引起肺癌发病的癌基因，可能作为一个反映肺癌恶性程度的指标。
关键词：DcR3基因 肺癌 表达
中图分类号：R563 文献标识码：A 文章编号：1005-0515（2013）8-036-02
肺癌是严重危害人类健康的恶性肿瘤，居美国肿瘤死因首位。根据全国疾病监测系统报告，自 1990 年起，中国人群的肺癌死亡率以每年 4.5%的速度上升，估计在未来还会上升的更快。由于肺癌5 年存活率很低，仅为10%～15%[1]，所以研究肺癌的发生、发展及治疗已成为当前的一个研究热点，尤其是肺癌发生的分子生物学方面的机制研究成果显著，极大地丰富了对肺癌发生过程的认识。可溶性诱惑受体（decoy receptor 3，DcR3）具有帮助肿瘤的发生，发展和逃避免疫攻击的作用。目前国内外已经检查了许多恶性肿瘤 ， 结 果 发 现 了 大 多 数 恶 性 肿 瘤 均 表 达 DcR3基因[2-3-4-5-6]。本实验主要通过测定DcR3基因在肺癌和正常肺组织中的表达，说明DcR3基因在肺癌发生过程中可能起着重要作用，可能作为一个反映肺癌恶性程度的指标。
1 研究对象
选用我院2000年1月至2012年12月间60例肺癌病例，其中男性35例，女性25例，年龄29-79岁，中位年龄56岁，均经手术病理、纤维支气管镜细胞学及组织学诊断明确。其中鳞癌30例，腺癌12例，小细胞癌9例，肺泡细胞癌5例，混合癌2例，大细胞癌2例，均未接受化疗、放疗及其他抗癌治疗。所有病例均进行询问病史、查体、胸片、胸部CT、腹部B超及同位素骨扫描，部分病例进行头颅或腹部CT扫描，根据1997年国际抗癌联盟（UICC）分期标准进行TMN分期。标本经10%福尔马林固定，石蜡包埋。随访时间3-36月。
2 主要试剂
SP免疫组化染色试剂盒，为北京中杉金桥生物技术有限公司产品；抗人DcR3单克隆抗体（mAb）自行制备。
3.实验方法
1将切片依次浸入盛有二甲苯、梯度酒精的玻璃缸中脱蜡后水化（二甲苯Ⅰ30分钟→二甲苯Ⅱ15分钟→二甲苯Ⅲ15分钟→100%乙醇Ⅰ3分钟→100%乙醇Ⅱ3分钟→95%乙醇3分钟→75%乙醇3分钟→蒸馏水冲洗→lx PBS再洗一次）。
2 3%H2O2（90%1xPBS+10ml 30% H2O2配制）室温孵育10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性，1xPBS冲洗5分钟x2次。
3.将切片置于修复架上，浸入盛有0.01M构椽酸钠缓冲液（PH6.0）的烧杯中，高火加热至90摄氏度后记时2分钟，然后转至解冻10分钟，接着将烧杯端离热源，室温冷却20一30分钟，取出切片，蒸馏水冲洗，1xPBS冲洗5分钟x3次。
4.滴加10%正常羊血清37摄氏度封闭孵育1小时，倾去血清，勿洗以封闭非特异性背景着色。
5滴加抗人DcR3单克隆抗体，4摄氏度孵育过夜。
6第二天从冰箱中取出标本，恢复至室温后1xPBS冲洗5分钟x3次。
7滴加生物素标记的羊抗鼠二抗，37.C孵育1小时，1xPBS冲洗5分钟x3次。
8.滴加辣根过氧化物酶标记的三抗链霉卵白素，37摄氏度孵育1小时，lxPBS冲洗5分钟x3次。
9用新配制（1xPBSlml+微量的DAB+1ūl 30% H2O2）的DAB〔5%v/v）避光显色5-15分钟，于光学显微镜下观察，有信号时可用自来水冲洗终止反应，10%苏木素稍稍衬染（自来水冲洗），1%盐酸一酒精分色（可滴片并直接浸泡在lx PBS里，然后用水冲洗）。
10.逐级酒精脱水，二甲苯透明（75%乙醇3分钟→95%乙醇3分钟→100%乙醇I 3分钟→100%乙醇Ⅱ3分钟→二甲苯I 3分钟→二甲苯Ⅱ3分钟）。
11.中性树胶加盖玻片封片。
12.加一抗时把对照片用1XPBS代替IA6抗体分别作实验组和对照组对照。
4.结果判定
每例标本选择9个高倍镜视野（40X，向同一方向移动切片，不重复，不重叠，细致观察），按阳性细胞数占视野中总细胞数的百分比3级（一）：无阳性着色或阳性细胞数<5%为阴性；（+）：阳性细胞数在5%-50%之间为阳性；（++）：阳性细胞数>5%0为强阳性"计算阳性率时以（/一）与（0一+）之和为总阳性细胞数。结果判定采用双盲对照法。
5统计学分析
数据采用SPSS17.0统计软件进行统计学分析，用x2检验及等级相关性分析进行数据处理P<0.05有统计学意义。
6 结果
在60例肺癌组织中，DcR3基因的阳性表达数目为41例，阳性表达率为（41/60）68.33%，在60例正常肺组织中，其阳性表达数目为27例，阳性表达率为45.2%。DcR3基因在两组组织中的表达均有显著性差异（P<0.05）。
7 讨论
肺癌可以分为两大类：（一）非小细胞肺癌。1，鳞状上皮细胞癌（简称鳞癌）包括梭形细胞癌。典型的鳞癌细胞大， 呈多形性，胞浆丰富，有角化倾向，核畸形，染色深，细胞间桥多见，常呈鳞状上皮样排列。分化较好，恶性度较低。2，腺癌，包括腺泡状腺癌、乳头状腺癌、细支气管-肺泡细胞癌、实体癌粘液形成。典型的腺癌呈腺管或乳头状结构，细胞大小比较一致，圆形或椭圆形，胞浆丰富，常含有粘液，核大，色深，常有核仁，核膜比较清楚。3，大细胞癌，包括巨细胞癌、透明细胞癌。细胞较大，大小不一，常呈多角形或不规则形，呈实行巢状排列，常见大片出血性坏死，核大，核仁明显，核分裂象常见，胞浆丰富。4，其他 腺鳞癌、类癌、支气管腺体癌等。（二）小细胞肺癌，包括燕麦细胞型、中间细胞型、复合燕麦细胞型。癌细胞多为类圆形或菱形，胞浆少，类似淋巴细胞。分化差，恶性度最高。DcR3 的表达量与肿瘤的恶性度及组织类型有关。从 DcR3 的作用机制上看，它与肿瘤的发生，肿瘤的免疫逃避具有密切的联系，根据 DcR3 的这种表达特点，我们可已通过对它表达量作出初步的组织类型判断，从而来指导临床的诊断，治疗，预后评价及肿瘤复发。 参考文献：
1.BynleKJ，CoxqSwinsonD.Towardstagemodel for perabel non-small LungCaneer，2001：34：583-89
2 Shi G， Wu Y， Zhang J. Death decoy receptor TR6/DcR3 inhibitsT-cell chemotaxis in vitro and in vivo. J Immunol. 2003 Oct1，171（7）：3407-14.
3 Hosoe， S.，Kawaguchi， T.； Naka， Y.； Genomic amplificationof a decoy receptor for Fas ligand （DcR3） in lung cancers at various clinical stages，Lung Cancer Volume： 29， Issue： 1，Supplement 1， September， 2000， 196.
4 Hwang SL， Lin CL， Cheng .Serum concentration of soluble decay receptor 3 in glioma patients before and after surgery. Kaohsiung J Med Sci. 2004 Mar，20（3）：124-7.
5. Shi G， Mao J， Yu G. Tumor Vaccine Based on Cell Surface Expression of DcR3/TR6. J Immunol. 2005 Apr 15，174（8）：4727-35.
6. Fujita Y， Sakakura C， Shimomura K. Chromosome arm 20qgains and other genomic alterations in esophageal squamous cell C arcinoma， as analyzed by comparative genomic hybridization and
fluorescence in situ hybridization. Hepatogastroenterology. 2003 Nov-Dec，50（54）：1857-63.
关键词：DcR3基因 肺癌 表达
中图分类号：R563 文献标识码：A 文章编号：1005-0515（2013）8-036-02
肺癌是严重危害人类健康的恶性肿瘤，居美国肿瘤死因首位。根据全国疾病监测系统报告，自 1990 年起，中国人群的肺癌死亡率以每年 4.5%的速度上升，估计在未来还会上升的更快。由于肺癌5 年存活率很低，仅为10%～15%[1]，所以研究肺癌的发生、发展及治疗已成为当前的一个研究热点，尤其是肺癌发生的分子生物学方面的机制研究成果显著，极大地丰富了对肺癌发生过程的认识。可溶性诱惑受体（decoy receptor 3，DcR3）具有帮助肿瘤的发生，发展和逃避免疫攻击的作用。目前国内外已经检查了许多恶性肿瘤 ， 结 果 发 现 了 大 多 数 恶 性 肿 瘤 均 表 达 DcR3基因[2-3-4-5-6]。本实验主要通过测定DcR3基因在肺癌和正常肺组织中的表达，说明DcR3基因在肺癌发生过程中可能起着重要作用，可能作为一个反映肺癌恶性程度的指标。
1 研究对象
选用我院2000年1月至2012年12月间60例肺癌病例，其中男性35例，女性25例，年龄29-79岁，中位年龄56岁，均经手术病理、纤维支气管镜细胞学及组织学诊断明确。其中鳞癌30例，腺癌12例，小细胞癌9例，肺泡细胞癌5例，混合癌2例，大细胞癌2例，均未接受化疗、放疗及其他抗癌治疗。所有病例均进行询问病史、查体、胸片、胸部CT、腹部B超及同位素骨扫描，部分病例进行头颅或腹部CT扫描，根据1997年国际抗癌联盟（UICC）分期标准进行TMN分期。标本经10%福尔马林固定，石蜡包埋。随访时间3-36月。
2 主要试剂
SP免疫组化染色试剂盒，为北京中杉金桥生物技术有限公司产品；抗人DcR3单克隆抗体（mAb）自行制备。
3.实验方法
1将切片依次浸入盛有二甲苯、梯度酒精的玻璃缸中脱蜡后水化（二甲苯Ⅰ30分钟→二甲苯Ⅱ15分钟→二甲苯Ⅲ15分钟→100%乙醇Ⅰ3分钟→100%乙醇Ⅱ3分钟→95%乙醇3分钟→75%乙醇3分钟→蒸馏水冲洗→lx PBS再洗一次）。
2 3%H2O2（90%1xPBS+10ml 30% H2O2配制）室温孵育10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性，1xPBS冲洗5分钟x2次。
3.将切片置于修复架上，浸入盛有0.01M构椽酸钠缓冲液（PH6.0）的烧杯中，高火加热至90摄氏度后记时2分钟，然后转至解冻10分钟，接着将烧杯端离热源，室温冷却20一30分钟，取出切片，蒸馏水冲洗，1xPBS冲洗5分钟x3次。
4.滴加10%正常羊血清37摄氏度封闭孵育1小时，倾去血清，勿洗以封闭非特异性背景着色。
5滴加抗人DcR3单克隆抗体，4摄氏度孵育过夜。
6第二天从冰箱中取出标本，恢复至室温后1xPBS冲洗5分钟x3次。
7滴加生物素标记的羊抗鼠二抗，37.C孵育1小时，1xPBS冲洗5分钟x3次。
8.滴加辣根过氧化物酶标记的三抗链霉卵白素，37摄氏度孵育1小时，lxPBS冲洗5分钟x3次。
9用新配制（1xPBSlml+微量的DAB+1ūl 30% H2O2）的DAB〔5%v/v）避光显色5-15分钟，于光学显微镜下观察，有信号时可用自来水冲洗终止反应，10%苏木素稍稍衬染（自来水冲洗），1%盐酸一酒精分色（可滴片并直接浸泡在lx PBS里，然后用水冲洗）。
10.逐级酒精脱水，二甲苯透明（75%乙醇3分钟→95%乙醇3分钟→100%乙醇I 3分钟→100%乙醇Ⅱ3分钟→二甲苯I 3分钟→二甲苯Ⅱ3分钟）。
11.中性树胶加盖玻片封片。
12.加一抗时把对照片用1XPBS代替IA6抗体分别作实验组和对照组对照。
4.结果判定
每例标本选择9个高倍镜视野（40X，向同一方向移动切片，不重复，不重叠，细致观察），按阳性细胞数占视野中总细胞数的百分比3级（一）：无阳性着色或阳性细胞数<5%为阴性；（+）：阳性细胞数在5%-50%之间为阳性；（++）：阳性细胞数>5%0为强阳性"计算阳性率时以（/一）与（0一+）之和为总阳性细胞数。结果判定采用双盲对照法。
5统计学分析
数据采用SPSS17.0统计软件进行统计学分析，用x2检验及等级相关性分析进行数据处理P<0.05有统计学意义。
6 结果
在60例肺癌组织中，DcR3基因的阳性表达数目为41例，阳性表达率为（41/60）68.33%，在60例正常肺组织中，其阳性表达数目为27例，阳性表达率为45.2%。DcR3基因在两组组织中的表达均有显著性差异（P<0.05）。
7 讨论
肺癌可以分为两大类：（一）非小细胞肺癌。1，鳞状上皮细胞癌（简称鳞癌）包括梭形细胞癌。典型的鳞癌细胞大， 呈多形性，胞浆丰富，有角化倾向，核畸形，染色深，细胞间桥多见，常呈鳞状上皮样排列。分化较好，恶性度较低。2，腺癌，包括腺泡状腺癌、乳头状腺癌、细支气管-肺泡细胞癌、实体癌粘液形成。典型的腺癌呈腺管或乳头状结构，细胞大小比较一致，圆形或椭圆形，胞浆丰富，常含有粘液，核大，色深，常有核仁，核膜比较清楚。3，大细胞癌，包括巨细胞癌、透明细胞癌。细胞较大，大小不一，常呈多角形或不规则形，呈实行巢状排列，常见大片出血性坏死，核大，核仁明显，核分裂象常见，胞浆丰富。4，其他 腺鳞癌、类癌、支气管腺体癌等。（二）小细胞肺癌，包括燕麦细胞型、中间细胞型、复合燕麦细胞型。癌细胞多为类圆形或菱形，胞浆少，类似淋巴细胞。分化差，恶性度最高。DcR3 的表达量与肿瘤的恶性度及组织类型有关。从 DcR3 的作用机制上看，它与肿瘤的发生，肿瘤的免疫逃避具有密切的联系，根据 DcR3 的这种表达特点，我们可已通过对它表达量作出初步的组织类型判断，从而来指导临床的诊断，治疗，预后评价及肿瘤复发。 参考文献：
1.BynleKJ，CoxqSwinsonD.Towardstagemodel for perabel non-small LungCaneer，2001：34：583-89
2 Shi G， Wu Y， Zhang J. Death decoy receptor TR6/DcR3 inhibitsT-cell chemotaxis in vitro and in vivo. J Immunol. 2003 Oct1，171（7）：3407-14.
3 Hosoe， S.，Kawaguchi， T.； Naka， Y.； Genomic amplificationof a decoy receptor for Fas ligand （DcR3） in lung cancers at various clinical stages，Lung Cancer Volume： 29， Issue： 1，Supplement 1， September， 2000， 196.
4 Hwang SL， Lin CL， Cheng .Serum concentration of soluble decay receptor 3 in glioma patients before and after surgery. Kaohsiung J Med Sci. 2004 Mar，20（3）：124-7.
5. Shi G， Mao J， Yu G. Tumor Vaccine Based on Cell Surface Expression of DcR3/TR6. J Immunol. 2005 Apr 15，174（8）：4727-35.
6. Fujita Y， Sakakura C， Shimomura K. Chromosome arm 20qgains and other genomic alterations in esophageal squamous cell C arcinoma， as analyzed by comparative genomic hybridization and
fluorescence in situ hybridization. Hepatogastroenterology. 2003 Nov-Dec，50（54）：1857-63.