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摘要 2014年-2018年，对海南省蔬菜根结线虫病害进行了田间随机采样调查和病原种类分子鉴定。结果显示，蔬菜根结线虫病在海南18市县均有发生，且大部分旱田连作地块病株率达到80%以上。进一步对采集的295份根结线虫样本种类进行了分子鉴定，共鉴定出象耳豆根结线虫、南方根结线虫和爪哇根结线虫3种病原种。其中，象耳豆根结线虫单一检出率达到62.37%，南方根结线虫单一检出率为23.39%，爪哇根结线虫的检出率仅为576%，象耳豆根结线虫和南方根结线虫复合侵染检出率为8.47%。除五指山市样本以外，海南其余17市县样本均检测到象耳豆根结线虫侵染为害。本研究显示象耳豆根结线虫为海南省蔬菜上的优势病原根结线虫种类，该结果对指导品种布局、制定根结线虫病害的防治策略具有重要意义。
关键词 海南; 根结线虫; 蔬菜; 发生种类; 分布
中图分类号： S 436.3
文献标识码： A
DOI： 10.16688/j.zwbh.2019440
Abstract A systemic investigation of the root-knot nematodes （Meloidogyne spp.） occurring on vegetables in Hainan province was conducted during 2014-2018. The results showed that root-knot nematodes are commonly found in all 18 cities and counties of Hainan province， and the rate of diseased plant was exceeded 80% in most of continuous cropping uplands. A total of 295 samples were collected and assayed for presence of Meloidogyne spp. M.enterolobii， M.incognita and M.javanica were detected at incidences of 62.37%， 23.39% and 5.76%， respectively. In addition， 8.47% samples were M.enterolobii and M.incognita mixtures. Moreover， M.enterolobii was widely distributed in 17 out of 18 counties/cities in Hainan province. These results indicated M.enterolobii now become the predominant specie in vegetables in Hainan， which is helpful for making proper strategies of root-knot nematode diseases control.
Key words Hainan; root-knot nematode; vegetable; species; distribution
根結线虫Meloidogyne spp.是全球农作物生产上重要的病原物之一，危害包括蔬菜、果树和粮食作物在内的3 000多种植物[1-2]。目前，国际上已报道的根结线虫有100余种，其中经济上最为重要，分布最为广泛的主要有南方根结线虫M.incognita、爪哇根结线虫M.javanica、花生根结线虫M.arenaria、北方根结线虫M.hapla和象耳豆根结线虫M.enterolobii等5种病原根结线虫[3]。在我国，北方温带地区蔬菜上最常见的为南方根结线虫和北方根结线虫，而南方热带亚热带地区最常见的有南方根结线虫、爪哇根结线虫、花生根结线虫和象耳豆根结线虫[4-5]。
海南省地处热带，冬季露地蔬菜种植面积近20万hm2，是我国重要的南菜北运基地。陈绵才等[6]2001年对海南主要蔬菜基地抽样调查结果表明，几乎所有瓜类、茄果类和豆类蔬菜均遭受根结线虫危害，鉴定种类主要为南方根结线虫、爪哇根结线虫和花生根结线虫，其中南方根结线虫为优势种。近些年来，随着种植年限不断增加和重茬连作，海南蔬菜根结线虫危害日趋加重，且象耳豆根结线虫已发展成为主要的病原根结线虫种类[7-8]。为进一步明确海南蔬菜根结线虫发生及其分布， 2014年-2018年对海南蔬菜根结线虫进行了田间采样调查和种类鉴定，以期为根结线虫病害绿色防控提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 取样调查
2014年-2018年，对海南省18个市县（除三沙市以外）的冬季瓜菜主产区进行随机取样调查，每田块调查10株根系，统计发病率。将具有“根结”症状的病根编号，标注采集信息带回实验室分离根结线虫。
1.2 线虫分离
将病根表面泥土清洗干净，置于1%食用色素亮蓝液中浸泡染色1 min[9]，随后用清水轻轻冲洗去掉染色液，在解剖镜下挑取卵囊和雌成虫。雌虫用于会阴花纹的制作和DNA的提取，卵囊接种于感病番茄（品种为‘特级大明星’）上进行种群活体保存。
1.3 线虫DNA提取
参照万新龙等[10]所描述的方法，略有修改。挑取单雌虫置于含有10 μL灭菌双蒸水的PCR管中，点动离心后放入液氮中速冻30 s，用灭菌玻璃棒将雌虫研磨破碎。加入8 μL10×PCR Buffer（TaKaRa），2 μL蛋白酶K（20 mg/mL），轻弹混匀后在PCR仪中65℃温育90 min，接着95℃保温10 min。样品于13 000 r/min离心1 min，取其上清液用于PCR扩增或者于-20℃保存备用。 1.4 线虫SCAR标记特异性引物扩增
利用根结线虫的SCAR标记引物扩增特异性条带，其中南方根结线虫MiF/MiR引物（5′-GTGAGGATTCAGCTCCCCAG-3′/5′-ACGAGGAACATACT-
TCTCCGTCC-3′）退火温度为62℃[11];爪哇根结线虫MjF/MjR 引物（5′-ACGCTAGAATTCGACCCTGG-3′/5′-GGTACCAGAAGCAGCCATGC-3′）
退火温度为60℃[11];象耳豆根结线虫MeF/MeR引物（5′-AACTTTTGTGAAAGTGCCGCTG-3′/5′-TCAGTTCAGGCAGGATCAACC-3′）退火温度为58℃[12];花生根结线虫引物MaF/MaR（5′-TCGAGGGCATCTAATAAAGG-3′/5′-GGGCTGAATATTCAAAGGAA-3′）退火温度为56℃[13]。扩增总体系为50 L，其中10×PCR Buffer 5 μL， dNTPs 4 μL，Mg2 3 μL， 上、下游引物各1 μL， rTaq 酶0.25 μL，DNA 模板5 μL，灭菌双蒸水30.75 μL。
2 结果与分析
2.1 海南冬季蔬菜根结线虫病发生情況
根结线虫病害在海南冬季蔬菜上普遍发生，18市县均采集到根结线虫样本，受害寄主包括茄科、豆科、葫芦科和十字花科在内的多种瓜菜和叶菜（图1）。在发病率上，蔬菜连作田（旱地/坡地）高于稻菜轮作田（水田），大部分连作地块株发病率达到100%，而稻菜轮作田发病率均低于50%（表1）。
2.2 根结线虫种类分子鉴定
通过提取采集的各根结线虫种群单雌虫DNA，结合利用不同种类根结线虫的特异性引物，共鉴定出象耳豆根结线虫、南方根结线虫和爪哇根结线虫3种根结线虫。表2为本研究根结线虫代表性种群的鉴定结果。利用象耳豆根结线虫特异引物（MeF/MeR）扩增，DZ5、SY7、WC3和LG3种群获得长度约为300 bp的单一条带（图2a）;HK3、SY9、WC5和WC6种群获得南方根结线虫特异性条带，长度约为900 bp（图2b）;利用爪哇根结线虫特异引物（MjF/MjR）扩增，仅DA5种群获得长度约为500 bp的单一条带（图2c）。此外，利用花生根结线虫特异引物（MaF/MaR）扩增，所有种群均无条带（图2d）。
2.3 不同种类根结线虫的检出率
由表3可知，总共鉴定295份根结线虫样本，象耳豆根结线虫和南方根结线虫分别有184份和69份（不包含混合发生种群），检出率分别为62.37%和23.39%。爪哇根结线虫的检出率仅为5.76%。此外，象耳豆根结线虫和南方根结线虫混合发生的样本检出率为8.48%。
2.4 不同种类根结线虫分布区域
由表3可知，象耳豆根结线虫在海南各市县广泛发生分布，除五指山县采集的样品以外，其余17市县均检测到象耳豆根结线虫的寄生为害。南方根结线虫在海口、文昌、澄迈、儋州、昌江、三亚和定安等7个市县发生分布。而爪哇根结线虫仅在定安和五指山有检出。
3 讨论
由于独特的热带气候条件，根结线虫在海南无越冬休眠期，造成世代重叠现象普遍。根结线虫一旦发生，在短时间内可大量繁殖累积，并持续危害造成作物重大产量损失，严重时可达80%以上[6]。本研究在海南全省范围的调查发现，根结线虫除了危害葫芦科、茄科和豆科蔬菜等高感寄主以外，还扩散至叶菜类蔬菜，表明根结线虫病危害范围不断扩大，已成为海南蔬菜产业可持续性发展不可忽视的限制因子。而水稻-蔬菜轮作田病株率明显低于蔬菜连作地块，表明水旱轮作是防治根结线虫病害非常有效的农业措施，在条件允许的情况下，可采取水旱轮作制度，降低土壤中根结线虫基数，从而减轻病害的发生。
本研究共鉴定出象耳豆根结线虫、南方根结线虫和爪哇根结线虫3种根结线虫危害海南冬季蔬菜。其中，象耳豆根结线虫检出率超过60%，已取代南方根结线虫成为蔬菜上的优势根结线虫种类。象耳豆根结线虫具备高度致病性和极其广泛的寄主范围，被国际公认为是最具危害性的病原根结线虫种类[14]。目前，生产上广泛应用的番茄（Mi）和辣椒（N）抗性品种，主要对南方根结线虫、爪哇根结线虫和花生根结线虫具有抗性作用[15]。象耳豆根结线虫能够克服Mi和N基因介导的抗性反应，在抗性辣椒和番茄品种上侵染和快速繁殖，而且至今仍然缺乏对该线虫有效的抗性品种资源[16]。因此，象耳豆根结线虫比南方根结线虫和爪哇根结线虫等种类具有更好的寄主适应性和种间竞争优势，这也很可能是其快速扩散并演替成为优势种类的原因之一。
当前，海南种植户生产上对蔬菜根结线虫的防控主要依赖化学农药，例如辛硫磷和二嗪磷等毒性较高的杀虫剂。但是，长期单一使用化学农药导致农药残留、环境污染和抗药性等问题突出，不符合现代生态农业的发展需求。本研究结果明确了海南蔬菜根结线虫种类及其分布，对于指导农户采取适宜的轮作制度、品种布局等绿色防控措施具有重要的指导意义。在此基础上，还需进一步结合轮作倒茬[17]、土壤阳光消毒[18]、生物熏蒸[19]和生防菌剂[20]等有效措施综合防控根结线虫危害，从而确保海南蔬菜产业的健康发展。
参考文献
[1] ABAD P， FAVERY B， ROSSO M， et al. Root-knot nematode parasitism and host response： molecular basis of a sophisticated interaction [J]. Molecular Plant Pathology， 2003， 4（4）：217-224.
[2] JONES J T， HAEGEMAN A， DANCHIN E G J， et al. Top 10 plant-parasitic nematodes in molecular plant pathology [J]. Molecular Plant Pathology， 2013， 14（9）：946-961. [3] RALMI N H A A， KHANDAKER M M， MAT N. Occurrence and control of root knot nematode in crops： A review [J]. Australian Journal of Crop Science， 2016， 10（12）：1649-1654.
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[6] 陈绵才， 谢圣华， 肖彤斌， 等. 海南岛冬季蔬菜根结线虫病的发生及其防治研究[J]. 沈阳农业大学学报， 2001， 32（3）：186-188.
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[8] 龙海波， 孙燕芳， 白成， 等. 海南省象耳豆根结线虫的鉴定研究[J]. 热带作物学报， 2015， 36（2）：371-376.
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[12]LONG Hai， LIU Hao， XU Jianhua. Development of a PCR Diagnostic for the root-knot nematode Meloidogyne enterolobii [J]. Acta Phytopathologica Sinica， 2006，36（2）：109-115.
[13]DONG K， DEAN R A， FORTNUM B A， et al. Development of PCR primers to identify species of root-knot nematodes： Meloidogyne arenaria， M.hapla， M.incognita and M.javanica [J]. Nematropica， 2001， 31（2）：271-280.
[14]CASTAGNONESERENO P. Meloidogyne enterolobii （=M.mayaguensis）： profile of an emerging， highly pathogenic， root-knot nematode species [J]. Nematology， 2012， 14（2）：133-138.
[15]彭德良， 唐文華. 番茄抗根结线虫Mi基因研究进展[J]. 沈阳农业大学学报， 2001， 32（3）：220-223.
[16]KIEWNICK S， DESSIMOZ M， FRANCK L. Effects of the Mi-1 and the N root-knot nematode-resistance gene on infection and reproduction of Meloidogyne enterolobii on tomato and pepper cultivars [J]. Journal of Nematology， 2009， 41（2）：134-139.
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[18]冯推紫， 裴月令， 孙燕芳， 等. 阳光消毒防治海南冬季辣椒根结线虫病效果评价[J]. 福建农业学报， 2018， 33（11）： 1172-1175.
[19]黄文坤， 张桂娟， 张超， 等. 生物熏蒸结合阳光消毒治理温室根结线虫技术[J]. 植物保护， 2010， 36（1）： 139-142.
[20]杨婷， 呼健洋， 林斌， 等. 复合微生物菌剂对生菜根结线虫田间防治效果[J]. 中国生物防治学报， 2017， 33（6）：826-832.
（责任编辑：杨明丽）
关键词 海南; 根结线虫; 蔬菜; 发生种类; 分布
中图分类号： S 436.3
文献标识码： A
DOI： 10.16688/j.zwbh.2019440
Abstract A systemic investigation of the root-knot nematodes （Meloidogyne spp.） occurring on vegetables in Hainan province was conducted during 2014-2018. The results showed that root-knot nematodes are commonly found in all 18 cities and counties of Hainan province， and the rate of diseased plant was exceeded 80% in most of continuous cropping uplands. A total of 295 samples were collected and assayed for presence of Meloidogyne spp. M.enterolobii， M.incognita and M.javanica were detected at incidences of 62.37%， 23.39% and 5.76%， respectively. In addition， 8.47% samples were M.enterolobii and M.incognita mixtures. Moreover， M.enterolobii was widely distributed in 17 out of 18 counties/cities in Hainan province. These results indicated M.enterolobii now become the predominant specie in vegetables in Hainan， which is helpful for making proper strategies of root-knot nematode diseases control.
Key words Hainan; root-knot nematode; vegetable; species; distribution
根結线虫Meloidogyne spp.是全球农作物生产上重要的病原物之一，危害包括蔬菜、果树和粮食作物在内的3 000多种植物[1-2]。目前，国际上已报道的根结线虫有100余种，其中经济上最为重要，分布最为广泛的主要有南方根结线虫M.incognita、爪哇根结线虫M.javanica、花生根结线虫M.arenaria、北方根结线虫M.hapla和象耳豆根结线虫M.enterolobii等5种病原根结线虫[3]。在我国，北方温带地区蔬菜上最常见的为南方根结线虫和北方根结线虫，而南方热带亚热带地区最常见的有南方根结线虫、爪哇根结线虫、花生根结线虫和象耳豆根结线虫[4-5]。
海南省地处热带，冬季露地蔬菜种植面积近20万hm2，是我国重要的南菜北运基地。陈绵才等[6]2001年对海南主要蔬菜基地抽样调查结果表明，几乎所有瓜类、茄果类和豆类蔬菜均遭受根结线虫危害，鉴定种类主要为南方根结线虫、爪哇根结线虫和花生根结线虫，其中南方根结线虫为优势种。近些年来，随着种植年限不断增加和重茬连作，海南蔬菜根结线虫危害日趋加重，且象耳豆根结线虫已发展成为主要的病原根结线虫种类[7-8]。为进一步明确海南蔬菜根结线虫发生及其分布， 2014年-2018年对海南蔬菜根结线虫进行了田间采样调查和种类鉴定，以期为根结线虫病害绿色防控提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 取样调查
2014年-2018年，对海南省18个市县（除三沙市以外）的冬季瓜菜主产区进行随机取样调查，每田块调查10株根系，统计发病率。将具有“根结”症状的病根编号，标注采集信息带回实验室分离根结线虫。
1.2 线虫分离
将病根表面泥土清洗干净，置于1%食用色素亮蓝液中浸泡染色1 min[9]，随后用清水轻轻冲洗去掉染色液，在解剖镜下挑取卵囊和雌成虫。雌虫用于会阴花纹的制作和DNA的提取，卵囊接种于感病番茄（品种为‘特级大明星’）上进行种群活体保存。
1.3 线虫DNA提取
参照万新龙等[10]所描述的方法，略有修改。挑取单雌虫置于含有10 μL灭菌双蒸水的PCR管中，点动离心后放入液氮中速冻30 s，用灭菌玻璃棒将雌虫研磨破碎。加入8 μL10×PCR Buffer（TaKaRa），2 μL蛋白酶K（20 mg/mL），轻弹混匀后在PCR仪中65℃温育90 min，接着95℃保温10 min。样品于13 000 r/min离心1 min，取其上清液用于PCR扩增或者于-20℃保存备用。 1.4 线虫SCAR标记特异性引物扩增
利用根结线虫的SCAR标记引物扩增特异性条带，其中南方根结线虫MiF/MiR引物（5′-GTGAGGATTCAGCTCCCCAG-3′/5′-ACGAGGAACATACT-
TCTCCGTCC-3′）退火温度为62℃[11];爪哇根结线虫MjF/MjR 引物（5′-ACGCTAGAATTCGACCCTGG-3′/5′-GGTACCAGAAGCAGCCATGC-3′）
退火温度为60℃[11];象耳豆根结线虫MeF/MeR引物（5′-AACTTTTGTGAAAGTGCCGCTG-3′/5′-TCAGTTCAGGCAGGATCAACC-3′）退火温度为58℃[12];花生根结线虫引物MaF/MaR（5′-TCGAGGGCATCTAATAAAGG-3′/5′-GGGCTGAATATTCAAAGGAA-3′）退火温度为56℃[13]。扩增总体系为50 L，其中10×PCR Buffer 5 μL， dNTPs 4 μL，Mg2 3 μL， 上、下游引物各1 μL， rTaq 酶0.25 μL，DNA 模板5 μL，灭菌双蒸水30.75 μL。
2 结果与分析
2.1 海南冬季蔬菜根结线虫病发生情況
根结线虫病害在海南冬季蔬菜上普遍发生，18市县均采集到根结线虫样本，受害寄主包括茄科、豆科、葫芦科和十字花科在内的多种瓜菜和叶菜（图1）。在发病率上，蔬菜连作田（旱地/坡地）高于稻菜轮作田（水田），大部分连作地块株发病率达到100%，而稻菜轮作田发病率均低于50%（表1）。
2.2 根结线虫种类分子鉴定
通过提取采集的各根结线虫种群单雌虫DNA，结合利用不同种类根结线虫的特异性引物，共鉴定出象耳豆根结线虫、南方根结线虫和爪哇根结线虫3种根结线虫。表2为本研究根结线虫代表性种群的鉴定结果。利用象耳豆根结线虫特异引物（MeF/MeR）扩增，DZ5、SY7、WC3和LG3种群获得长度约为300 bp的单一条带（图2a）;HK3、SY9、WC5和WC6种群获得南方根结线虫特异性条带，长度约为900 bp（图2b）;利用爪哇根结线虫特异引物（MjF/MjR）扩增，仅DA5种群获得长度约为500 bp的单一条带（图2c）。此外，利用花生根结线虫特异引物（MaF/MaR）扩增，所有种群均无条带（图2d）。
2.3 不同种类根结线虫的检出率
由表3可知，总共鉴定295份根结线虫样本，象耳豆根结线虫和南方根结线虫分别有184份和69份（不包含混合发生种群），检出率分别为62.37%和23.39%。爪哇根结线虫的检出率仅为5.76%。此外，象耳豆根结线虫和南方根结线虫混合发生的样本检出率为8.48%。
2.4 不同种类根结线虫分布区域
由表3可知，象耳豆根结线虫在海南各市县广泛发生分布，除五指山县采集的样品以外，其余17市县均检测到象耳豆根结线虫的寄生为害。南方根结线虫在海口、文昌、澄迈、儋州、昌江、三亚和定安等7个市县发生分布。而爪哇根结线虫仅在定安和五指山有检出。
3 讨论
由于独特的热带气候条件，根结线虫在海南无越冬休眠期，造成世代重叠现象普遍。根结线虫一旦发生，在短时间内可大量繁殖累积，并持续危害造成作物重大产量损失，严重时可达80%以上[6]。本研究在海南全省范围的调查发现，根结线虫除了危害葫芦科、茄科和豆科蔬菜等高感寄主以外，还扩散至叶菜类蔬菜，表明根结线虫病危害范围不断扩大，已成为海南蔬菜产业可持续性发展不可忽视的限制因子。而水稻-蔬菜轮作田病株率明显低于蔬菜连作地块，表明水旱轮作是防治根结线虫病害非常有效的农业措施，在条件允许的情况下，可采取水旱轮作制度，降低土壤中根结线虫基数，从而减轻病害的发生。
本研究共鉴定出象耳豆根结线虫、南方根结线虫和爪哇根结线虫3种根结线虫危害海南冬季蔬菜。其中，象耳豆根结线虫检出率超过60%，已取代南方根结线虫成为蔬菜上的优势根结线虫种类。象耳豆根结线虫具备高度致病性和极其广泛的寄主范围，被国际公认为是最具危害性的病原根结线虫种类[14]。目前，生产上广泛应用的番茄（Mi）和辣椒（N）抗性品种，主要对南方根结线虫、爪哇根结线虫和花生根结线虫具有抗性作用[15]。象耳豆根结线虫能够克服Mi和N基因介导的抗性反应，在抗性辣椒和番茄品种上侵染和快速繁殖，而且至今仍然缺乏对该线虫有效的抗性品种资源[16]。因此，象耳豆根结线虫比南方根结线虫和爪哇根结线虫等种类具有更好的寄主适应性和种间竞争优势，这也很可能是其快速扩散并演替成为优势种类的原因之一。
当前，海南种植户生产上对蔬菜根结线虫的防控主要依赖化学农药，例如辛硫磷和二嗪磷等毒性较高的杀虫剂。但是，长期单一使用化学农药导致农药残留、环境污染和抗药性等问题突出，不符合现代生态农业的发展需求。本研究结果明确了海南蔬菜根结线虫种类及其分布，对于指导农户采取适宜的轮作制度、品种布局等绿色防控措施具有重要的指导意义。在此基础上，还需进一步结合轮作倒茬[17]、土壤阳光消毒[18]、生物熏蒸[19]和生防菌剂[20]等有效措施综合防控根结线虫危害，从而确保海南蔬菜产业的健康发展。
参考文献
[1] ABAD P， FAVERY B， ROSSO M， et al. Root-knot nematode parasitism and host response： molecular basis of a sophisticated interaction [J]. Molecular Plant Pathology， 2003， 4（4）：217-224.
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（责任编辑：杨明丽）