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[摘 要]毛细管电泳电化学检测联用的简单、快速和低成本的方法用于单胺的分离和检测。在本文中，研究了影响单胺分离和在线富集的参数，与传统的进样相比，单胺的检测灵敏度大大提高。这种改进的方法用于人尿中单胺的直接分析。
[关键词]毛细管电泳；电化学检测；单胺；
中图分类号：G31 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2019）11-0233-01
一、引言
单胺如儿茶酚胺（多巴胺、肾上腺素、降肾上腺素）及生物体液中的血清素水平的测量，在疾病诊断中具有重要的作用，尿液中的儿茶酚胺可协助各种疾病的诊断，如嗜铬细胞瘤、神经节瘤、 神经细胞瘤和神经紊乱等[1，2]，尿样排泄物中血清素的检测用于诊断神经紊乱和癌瘤[3]，尽管许多方法如放射性同位素结合酶法、酶联免役吸附试验、伏安法和热透镜光谱法已报道用于这些胺类的检测，主导技术是高效液相色谱]结合灵敏电化学]或荧光检测。然而，由于样品基质复杂和儿茶酚胺浓度低，在HPLC分析之前净化处理和预富集或衍生作用是必要的，但是在回收过程中HPLC有成本高、工作程序烦琐和分析物损失等缺点。
CE已经成为液相分离领域的一种非常重要的补充技术，CE的主要优点是它能够在短时间内用相对简单的仪器提供极高的分离效率。由于样品容量小，与HPLC相比，灵敏度是其对极低浓度目标分析物分析的主要局限。
样品堆积是改善CE中灵敏度的最普遍的方法之一，包括场放大样品堆积、动态pH交界、等速电泳堆积和淋洗。其中FASS是最简单和最为广泛的应用技术，FASS是根据样品区带和运行缓冲液间电导不同来影响预富集。低电导样品基质将流经高电场强度，且分析物离子将比背景电解质离子移动地快，因而，大量分析物离子在不影响分离效率前提下被注入毛细管，FASS提供了最大的灵敏性，应用于许多化合物的检测，Hu报道了通过CE同FASS和安培检测联用来检测儿茶酚胺化合物的方法，然而，此改进法没有应用于实际样品。众所周知，FASS同CE和安培检测联用，并无检测尿中单胺的报道。在本文，FASS同CE-AD联用首次应用于人尿中单胺的分析，显然，FASS可实现人尿中单胺的快速分析。通过CE与高选择性安培检测法和高灵敏FASS联用，提供了一种复杂生物样品中单胺分离检测的简单、高效和灵敏的方法。
二、 实验部分
1、 CE体系
本文使用的CE分离体系，包括一个高压电源和一个罩在电化学检测仪上的法拉第屏蔽笼，使用66cm×25?m I.D.熔硅毛细管进行分离，安培检测法在恒电位下使用电化学分析仪毛细管末端检测模式，用一个三电极体系完成电化学检测法，所有检测电位均对SCE而言。
2、 试剂和溶液
5-HT、DA、E、NE和异丙醇（作为内标）均为分析纯，用0.1mol/L高氯酸配制5.00×10-2mol/L各单胺贮存溶液且储存于-20℃冰箱中。其它试剂均为分析纯，
3、 碳纤维微盘阵列电极的制备
碳纤维微盘阵列电极用一根大约长60?m、直径6?m碳纤维制成。首先，经丙酮浸泡后的碳纤维小心地插入熔硅毛细管中，直到伸出毛细管另一端约1cm，碳纤维的另一端用碳粉导电粘合剂与一根铜线相连，最后与铜线相连的石英毛细管插入到一根玻璃毛细管。在使用前，电极表面用金刚砂纸抛光，并用超声仪在乙醇和水中分别清洗。
4、 人尿样品的制备
取自一健康男性的尿液样品收集于一个含盐酸作为防腐剂的瓶中，将样品贮存于-20℃冰箱中，在分析之前，样品解冻到室温并离心以去除沉淀蛋白质和其它微小颗粒。
5、 操作步骤
在每次运行前，将细管进行活化，使工作电极和毛细管末端成一条直线，然后将20kV电压应用于毛细管两端及检测电位用于工作电极，电渗电流达到恒定值后，将标准溶液或样品电動进样测定
三、 结果与讨论
1、 单胺分离条件的改进
经研究，发现5-HT和DA、NE和E的峰是两组重叠峰。由于pH值影响电渗流和分析物所带电荷，所以运行缓冲溶液的pH值被视为影响CE的最重要的参数，因此选择运行缓冲溶液的最佳pH值是极为重要的。随着pH值的增加，RE，NE增加而R5-HT，DA降低，最佳pH值出现在5.9-6.1区间，此时RE，NE和R5-HT，DA均大于1.5，因此选择pH5.9作为最佳pH值。
除pH值外，运行缓冲溶液的浓度是另一个重要参数，它不仅影响分析物的分离度和迁移时间，而且影响峰电流。在最佳缓冲pH5.9浓度在40-200 mmol/L范围内研究运行缓冲溶液浓度对分离的影响，随着缓冲溶液浓度增加，分析物分离度逐渐提高，当缓冲液浓度为160mmol/L时，所有分析物均能完全分离因此，选择160mmol/L磷酸盐缓冲液。
2、 优化样品溶剂的性质和组成
在FASS中，样品溶液的电导率比运行缓冲液的低。理论上，堆积量与缓冲液和样品溶液电导率之差成比例。由于样品的电导率低，样品溶液中添加有机溶剂可增加灵敏度。因此，我们通过溶于水-甲醇或水-乙腈的分析物进样，研究了FASS方法中样品溶剂两种
常用有机添加剂（甲醇、乙腈）。经研究我们选择水-乙腈混合液作为样品溶剂。在恒定进样电压和时间下，研究样品溶剂中乙腈含量的影响，在本文中选择90%乙腈来研究进样参数的影响。
3、 FASS进样参数的优化
进样电压和进样时间都是增加堆积量的因素，为了研究FASS法中不同进样参数对样品进样量的影响，使用溶于水-乙腈（10/90，v/v）的混合标准样品。分别选择10s和15kV的进样时间和电压。经各个参数对分离和进样量影响的研究后，结合各参数的最佳值，即160mmol/L磷酸钠、pH5.9、15kV×10s电动进样和样品溶于水-乙腈（10/90，v/v）混合液。
4、 尿中单胺的定量分析
（1） 重现性和线性范围
通过FASS分析实际样品，应考虑尿液盐含量高对灵敏度提高产生的不利影响。尿样稀释是必需的，实验发现，在选定的条件下，对分析物浓度而言，通过研究相对峰高可获得良好的线性关系。该方法可获得物质对迁移时间和相对峰高度的良好重现性。实验结果证实了通过CE-FASS法分析单胺的可靠性。
（2） 样品分析
10?L健康男性尿液用含内标的水-乙腈溶液稀释到1mL，样品混合液在上述最佳条件下进样和分离，通过与标准溶液迁移时间和加有标准溶液的加标样品进行峰鉴定，可看出5-HT、DA和IP都能从样品基质中很好的分离，而NE和E能从背景干扰中部分分离。由于样品溶液中这些单胺带正电荷，所以使用FASS样品进样，可以排除这些单胺中大量带负电荷的干扰物，因此，在每次运行迁移所需时间内，除那些单胺外仅有少数其它峰，尿中儿茶酚胺和血清素的浓度可根据内标校正曲线计算而得，通过内标标定法获得人尿中5-HT、DA、NE和E的浓度。
四、 结论
本文建立了FASS技术与CE-AD结合用于人尿中单胺检测，该方法可检测更低水平的分析物且提供临床使用的一些信息。与传统HPLC-安培检测法相比，FASS-CE-AD具有分离效率高、分析时间短、仪器相对简单和在线样品预浓缩等优点，且FASS-CE-AD与离线样品淋洗和/或进一步预富集相结合可减少干扰和提高灵敏度，可用于临床分析。
参考文献
[1] P.E.Cryer，Clin.Endocrinol.Metab.14（1985）203.
[2] B.Kagedal，D.S.Goldstein，J.Chromatogr.429（1988）177.
[关键词]毛细管电泳；电化学检测；单胺；
中图分类号：G31 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2019）11-0233-01
一、引言
单胺如儿茶酚胺（多巴胺、肾上腺素、降肾上腺素）及生物体液中的血清素水平的测量，在疾病诊断中具有重要的作用，尿液中的儿茶酚胺可协助各种疾病的诊断，如嗜铬细胞瘤、神经节瘤、 神经细胞瘤和神经紊乱等[1，2]，尿样排泄物中血清素的检测用于诊断神经紊乱和癌瘤[3]，尽管许多方法如放射性同位素结合酶法、酶联免役吸附试验、伏安法和热透镜光谱法已报道用于这些胺类的检测，主导技术是高效液相色谱]结合灵敏电化学]或荧光检测。然而，由于样品基质复杂和儿茶酚胺浓度低，在HPLC分析之前净化处理和预富集或衍生作用是必要的，但是在回收过程中HPLC有成本高、工作程序烦琐和分析物损失等缺点。
CE已经成为液相分离领域的一种非常重要的补充技术，CE的主要优点是它能够在短时间内用相对简单的仪器提供极高的分离效率。由于样品容量小，与HPLC相比，灵敏度是其对极低浓度目标分析物分析的主要局限。
样品堆积是改善CE中灵敏度的最普遍的方法之一，包括场放大样品堆积、动态pH交界、等速电泳堆积和淋洗。其中FASS是最简单和最为广泛的应用技术，FASS是根据样品区带和运行缓冲液间电导不同来影响预富集。低电导样品基质将流经高电场强度，且分析物离子将比背景电解质离子移动地快，因而，大量分析物离子在不影响分离效率前提下被注入毛细管，FASS提供了最大的灵敏性，应用于许多化合物的检测，Hu报道了通过CE同FASS和安培检测联用来检测儿茶酚胺化合物的方法，然而，此改进法没有应用于实际样品。众所周知，FASS同CE和安培检测联用，并无检测尿中单胺的报道。在本文，FASS同CE-AD联用首次应用于人尿中单胺的分析，显然，FASS可实现人尿中单胺的快速分析。通过CE与高选择性安培检测法和高灵敏FASS联用，提供了一种复杂生物样品中单胺分离检测的简单、高效和灵敏的方法。
二、 实验部分
1、 CE体系
本文使用的CE分离体系，包括一个高压电源和一个罩在电化学检测仪上的法拉第屏蔽笼，使用66cm×25?m I.D.熔硅毛细管进行分离，安培检测法在恒电位下使用电化学分析仪毛细管末端检测模式，用一个三电极体系完成电化学检测法，所有检测电位均对SCE而言。
2、 试剂和溶液
5-HT、DA、E、NE和异丙醇（作为内标）均为分析纯，用0.1mol/L高氯酸配制5.00×10-2mol/L各单胺贮存溶液且储存于-20℃冰箱中。其它试剂均为分析纯，
3、 碳纤维微盘阵列电极的制备
碳纤维微盘阵列电极用一根大约长60?m、直径6?m碳纤维制成。首先，经丙酮浸泡后的碳纤维小心地插入熔硅毛细管中，直到伸出毛细管另一端约1cm，碳纤维的另一端用碳粉导电粘合剂与一根铜线相连，最后与铜线相连的石英毛细管插入到一根玻璃毛细管。在使用前，电极表面用金刚砂纸抛光，并用超声仪在乙醇和水中分别清洗。
4、 人尿样品的制备
取自一健康男性的尿液样品收集于一个含盐酸作为防腐剂的瓶中，将样品贮存于-20℃冰箱中，在分析之前，样品解冻到室温并离心以去除沉淀蛋白质和其它微小颗粒。
5、 操作步骤
在每次运行前，将细管进行活化，使工作电极和毛细管末端成一条直线，然后将20kV电压应用于毛细管两端及检测电位用于工作电极，电渗电流达到恒定值后，将标准溶液或样品电動进样测定
三、 结果与讨论
1、 单胺分离条件的改进
经研究，发现5-HT和DA、NE和E的峰是两组重叠峰。由于pH值影响电渗流和分析物所带电荷，所以运行缓冲溶液的pH值被视为影响CE的最重要的参数，因此选择运行缓冲溶液的最佳pH值是极为重要的。随着pH值的增加，RE，NE增加而R5-HT，DA降低，最佳pH值出现在5.9-6.1区间，此时RE，NE和R5-HT，DA均大于1.5，因此选择pH5.9作为最佳pH值。
除pH值外，运行缓冲溶液的浓度是另一个重要参数，它不仅影响分析物的分离度和迁移时间，而且影响峰电流。在最佳缓冲pH5.9浓度在40-200 mmol/L范围内研究运行缓冲溶液浓度对分离的影响，随着缓冲溶液浓度增加，分析物分离度逐渐提高，当缓冲液浓度为160mmol/L时，所有分析物均能完全分离因此，选择160mmol/L磷酸盐缓冲液。
2、 优化样品溶剂的性质和组成
在FASS中，样品溶液的电导率比运行缓冲液的低。理论上，堆积量与缓冲液和样品溶液电导率之差成比例。由于样品的电导率低，样品溶液中添加有机溶剂可增加灵敏度。因此，我们通过溶于水-甲醇或水-乙腈的分析物进样，研究了FASS方法中样品溶剂两种
常用有机添加剂（甲醇、乙腈）。经研究我们选择水-乙腈混合液作为样品溶剂。在恒定进样电压和时间下，研究样品溶剂中乙腈含量的影响，在本文中选择90%乙腈来研究进样参数的影响。
3、 FASS进样参数的优化
进样电压和进样时间都是增加堆积量的因素，为了研究FASS法中不同进样参数对样品进样量的影响，使用溶于水-乙腈（10/90，v/v）的混合标准样品。分别选择10s和15kV的进样时间和电压。经各个参数对分离和进样量影响的研究后，结合各参数的最佳值，即160mmol/L磷酸钠、pH5.9、15kV×10s电动进样和样品溶于水-乙腈（10/90，v/v）混合液。
4、 尿中单胺的定量分析
（1） 重现性和线性范围
通过FASS分析实际样品，应考虑尿液盐含量高对灵敏度提高产生的不利影响。尿样稀释是必需的，实验发现，在选定的条件下，对分析物浓度而言，通过研究相对峰高可获得良好的线性关系。该方法可获得物质对迁移时间和相对峰高度的良好重现性。实验结果证实了通过CE-FASS法分析单胺的可靠性。
（2） 样品分析
10?L健康男性尿液用含内标的水-乙腈溶液稀释到1mL，样品混合液在上述最佳条件下进样和分离，通过与标准溶液迁移时间和加有标准溶液的加标样品进行峰鉴定，可看出5-HT、DA和IP都能从样品基质中很好的分离，而NE和E能从背景干扰中部分分离。由于样品溶液中这些单胺带正电荷，所以使用FASS样品进样，可以排除这些单胺中大量带负电荷的干扰物，因此，在每次运行迁移所需时间内，除那些单胺外仅有少数其它峰，尿中儿茶酚胺和血清素的浓度可根据内标校正曲线计算而得，通过内标标定法获得人尿中5-HT、DA、NE和E的浓度。
四、 结论
本文建立了FASS技术与CE-AD结合用于人尿中单胺检测，该方法可检测更低水平的分析物且提供临床使用的一些信息。与传统HPLC-安培检测法相比，FASS-CE-AD具有分离效率高、分析时间短、仪器相对简单和在线样品预浓缩等优点，且FASS-CE-AD与离线样品淋洗和/或进一步预富集相结合可减少干扰和提高灵敏度，可用于临床分析。
参考文献
[1] P.E.Cryer，Clin.Endocrinol.Metab.14（1985）203.
[2] B.Kagedal，D.S.Goldstein，J.Chromatogr.429（1988）177.