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摘 要 采用改良CTAB法研究经硅胶干燥法和保鲜法保存的五唇兰叶片DNA降解规律，并比较两种保存方法叶片DNA的保存时间，为叶片的野外远距离采集提供指导。结果显示，采取硅胶干燥法进行保存的五唇兰叶片DNA和SOD以及POD的含量下降迅速，第1天DNA的产率已经下降到65.4 ng/g，ISSR引物可以检测出7条清晰的条带，第2天DNA则降解完全，SOD和POD含量2 d内快速较少，第2天分别降到68%和27%；采取叶片保鲜法保存的五唇兰叶片DNA一周内保存完好，产率较高，为71 ng/g左右，ISSR引物可以检测出7条清晰的条带，7 d之后DNA开始降解，ISSR引物扩增出的条带变得模糊，随着叶片衰老进程的加剧以及叶片开始出现腐烂等性状，DNA降解逐渐加速，第13天降解完全，SOD和POD含量的变化呈现出与DNA产率一致的趋势，先上升后下降，在第9天达到峰值。叶片DNA的降解规律和衰老规律呈现出一致性，离体五唇兰叶片DNA降解主要原因来自于叶片衰老的加剧以及期间产生的有毒物质的积累，野外远距离采集五唇兰叶片可采用保鲜法保存以防止DNA的快速降解。
关键词 蝴蝶兰；远距离采样；叶片衰老；DNA降解
中图分类号 S682.3 文献标识码A
Effects of Two Sample Preserving Methods on Genomic
DNA Extraction Quality of Phalaenopsis
pulcherrima（Orchidaceae）
HU Xiangyu1，2， DING Qiong2， SONG Xiqiang1，2 *
WANG Jian2， ZHONG Yunfang1，3
1 Key Laboratory of Protection and Developmental Utilization of Tropical Crop Germplasm Resources（Hainan University），
Ministry of Education， Haikou， Hainan 570228， China
2 College of Horticulture and Landscape Architecture， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China
3 Hainan Evergreen Landscape Technology Limited Company， Haikou， Hainan 570010， China
Abstract A modified CTAB method was used to research the DNA degradation rule of P. pulcherrima leaves saved with silica gel and the low temperature fresh-keeping method respectively. The results showed that DNA degradation of leaves saved with silica gel was rapid， the DNA production rate after one day dropped to 65.4 ng/g， seven clear bands were detected using ISSR primers， and DNA degraded completely after two days； However， DNA of P. pulcherrima leaves saved with low temperature fresh-keeping method could be preserved for one week， and the yield was higher， about 71 ng/g， ISSR primers could detect seven clear bands， after 7 days DNA began to degrade and PCR bands became blurry The rule of DNA degradation and senescence showed consistency. The main reasons for degradation of leaf DNA were intensification of senescence and the accumulation of toxic substances produced during the period. Leaves of P. pulcherrima sampled in the wild can take the method of low temperature to keep fresh.
Key words Phalaenopsis； Long-distance sampling； Leaf senescence； DNA degradation
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.08.017
DNA的提取与纯化是进行分子标记试验最关键的一步，获得高质量的DNA样品是进行PCR扩增的前提[1]。叶片采集之后，离体叶片由于受到内外因素的限制，不可避免地产生衰老。Nodden概括了以往叶片衰老研究结果后提出叶片衰老的中心途径可分为3个时期。诱导期：内外因素导致了叶片衰老的形成，如激素、糖类、水分、温度等；重组期：大分子如蛋白质和脂类开始降解；终止期：叶片衰老的最后时期，细胞自溶反应，核酸如DNA开始降解[2]。 因此，若采集材料后不能马上进行实验，那么就要选取合适的保存方法以延缓叶片的衰老，防止DNA的降解。Doyle 和Dickson[3]曾用解剖学上常用的化学试剂来保存植物材料，但获得DNA均被严重降解，Chase和Hills[4]用硅胶快速干燥法保存金虎尾科（Malpighiacae）等植物叶片，获得DNA与新鲜叶片相似。远距离采样一般无法对新鲜材料立刻提取DNA，干燥的植物样本可以用硅胶浸润，并用塑料袋密封，如果样本干燥不彻底，那么DNA很可能在短时间内降解；采用液氮或干冰低温保存材料，则携带运输不便，不安全，费用也高，一些特殊的材料，比如新生的嫩芽可以在4 ℃存放几天，比较大的组织如树枝可以用湿布包裹，外面套一层塑料，防止脱水[5]。
五唇兰（Phalaenopsis pulcherrima），兰科蝴蝶兰属，东亚特有种，我国仅海南昌江、乐东等地有分布。生于密林或灌丛中，常见于覆有土层的岩石上[6]。五唇兰叶片肉质或厚肉质，采集之后如不采取特殊的保存措施，叶片容易快速的衰老和腐烂，对DNA的提取造成较大的影响。本研究使用改良CTAB法比较了离体叶片分别在硅胶干燥和叶片保鲜保存后DNA的提取质量及其降解规律，拟探究以下问题：（1）两种方法保存的五唇兰叶片衰老的规律；（2）两种方法保存的五唇兰叶片DNA降解规律；（3）叶片衰老和叶片DNA降解之间的关系；（4）五唇兰DNA野外远距离的采样策略。
1 材料与方法
1.1 材料的采集与处理
五唇兰叶片采自海南大学园艺园林学院教学实践基地，采集生长良好、无病菌的叶片。设置两种处理：（1）采集的五唇兰叶片剪成小块（约长6 mm×宽6 mm）立即放入盛有硅胶的封口袋中干燥，硅胶变色后立即更换新硅胶；（2）采集的叶片放入盛有干冰的泡沫盒中，带回实验室放入0 ℃冰箱内。
1.2 方法
1.2.1 五唇兰叶片DNA的提取以及质量的检测
分别于第0、1、2、3、5、7、9、11、13天，采用CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）法[7]提取五唇兰叶片基因组DNA，并用琼脂糖凝胶电泳和分光光度计测定基因组DNA的质量和浓度。DNA浓度（ng）=A260×50×稀释倍数×原液体积/1 000；DNA产率（ng/g）=DNA浓度（ng）/叶片质量（g）。
1.2.2 ISSR-PCR电泳检测五唇兰叶片的DNA质量 使用哥伦比亚大学公布的100套引物中的引物827电泳检测五唇兰叶片DNA提取质量，反应体系为在20 μL的反应体系中，Taq DNA聚合酶1.0 U，Mg2+ 1.5 mmol/L，dNTP 1.80 mmol/L，引物0.5 μmol/L，DNA为30 ng。
1.2.3 五唇兰叶片SOD、POD含量的测定 SOD（Superoxide Dismutase， 即超氧化物歧化酶）含量的测定参考Spychalla和Desborough[8]的方法，POD（Peroxidase， 即过氧化物酶）的含量测定参考Polle等[9]的方法。五唇兰叶片鲜样分别在第1、2、3、5、7、9、11、13天测定SOD和POD的活性，五唇兰干样叶片在第1、2天测定SOD和POD的活性。
1.2.4 五唇兰叶片含水量的测定 采用干燥法测定五唇兰叶片含水量，首先测定叶片鲜重M1，将叶片放置于烘箱中，105 ℃干燥4 h至恒重，测定叶片干重M2，叶片含水量为（M1-M2）/M1。
2 结果与分析
2.1 2种保存方法五唇兰叶片DNA的降解规律
2.1.1 2种保存方法五唇兰叶片DNA质量的变化
低温鲜样保存的五唇兰叶片，保存7 d，质量良好，提取的DNA电泳条带清晰、明亮。第7天后DNA开始逐渐降解，至第13天降解完全，此时无电泳条带（图1-a～e）；而采用硅胶干燥保存的五唇兰叶片，第2天DNA降解完全（图1-f～g）。
2.2 2种保存方法五唇兰叶片DNA产率的变化
低温鲜样保存法的五唇兰叶片在前7 d DNA的提取产率基本上无变化，维持在71%左右，从第7天开始叶片DNA产率急剧下降，第13天DNA产率为0，DNA分解完全；而硅胶干燥保存的五唇兰叶片则在第1天DNA产率就已经下降到65.4 ng/g，第2天DNA产率为0，此时DNA分解完全（表1）。
2.3 2种方法保存五唇兰叶片DNA PCR扩增结果的变化
采取低温鲜样保存法的五唇兰叶片前7天PCR扩增效果较好，扩增出了7条清晰的条带，而第9天扩增的条带较为模糊，条带数量也减少到5条（图2-a、b），因此采取低温鲜样保存法的五唇兰叶片适宜在一周内提取DNA并进行PCR扩增；而采取硅胶干燥保存法的五唇兰叶片在第1天可以扩增出7条清晰的条带，但第2天则无法扩增出条带（图2-c）。
2.4 2种保存方法五唇兰叶片的衰老规律
2.4.1 2种保存方法五唇兰叶片SOD和POD含量的变化 采用低温鲜样保存法的五唇兰叶片SOD和POD的含量都呈现出先上升后下降的趋势，峰值出现在第9天，之后由于叶片开始出现腐烂现象，SOD和POD的含量开始下降（图3）；而采取干燥保存法的五唇兰叶片SOD和POD的含量则在2 d内急剧下降，第2天SOD和POD的含量已经下降到很低（图4）。
2.5 2种保存方法五唇兰叶片含水量的变化
采用低温鲜样保存法的五唇兰叶片含水量在13 d之内呈现稳定的趋势，维持在90%～95%之间，13 d之内的含水量无明显差异（p>0.05）；而采取干燥保存法的叶片含水量两天内虽然有所下降，但是含水量仍在80%以上（图5）。
3 讨论与结论
3.1 采取鲜样保存法的五唇兰叶片衰老和DNA降解之间的关系 超氧物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）等可清除活性氧自由基，从而防止自由基的毒害，称其为保护酶系统[10]。正常情况下SOD、POD活性相对稳定，而在衰老过程中SOD、POD活性逐渐升高，清除植物体内过量的活性氧，保护膜结构，从而能在一定程度上延缓植物器官的衰老过程[11]。
叶片衰老的诱导和重组阶段，一些大分子如蛋白质、脂类产生降解，但DNA不被分解[12]，在叶片衰老的终止阶段，细胞开始产生自溶性反应，可以检测到例如染色质浓缩以及DNA片段化等细胞凋亡的显著特征[13-14]。本研究第8～13天，采取低温鲜样保存的五唇兰叶片属于叶片衰老的终止阶段，在此阶段叶片开始腐烂，DNA产率快速减少（p<0.05），SOD和POD含量开始有略微的增高（第8～9天），之后急剧下降，研究结果与朱诚等[12]以及Wollaston等[15]的研究结果一致，因此低温鲜样保存法使五唇兰叶片保存一周而DNA不被降解。
3.2 采取硅胶干燥保存法的五唇兰叶片衰老和DNA降解之间的关系
环境湿度的降低能够明显的促进DNA的降解[16]，环境湿度最终通过影响叶片含水量而间接影响叶片DNA的降解。
现阶段，为了使叶片DNA不被降解，硅胶快速干燥保存已经成为一种非常有用的叶片方法，前人已经使用硅胶干燥叶片来保存叶片并获得了良好的研究结果[17-19]。然而，五唇兰叶片肉质，硅胶无法对叶片进行快速干燥，采取硅胶干燥保存方法的五唇兰叶片第2天仍具有很高的含水量（81.2%），五唇兰叶片含水量的降低对叶片本身形成了干旱胁迫，加快了叶片衰老的进程，叶片衰老在两天之内快速完成，期间SOD和POD活性快速降低，DNA急剧降解。
3.3 五唇兰叶片野外采集之后的保存
野外采集叶片时由于采取真空法以及液氮保存法较为困难，因此对于较薄且水分容易散失的叶片，一般采取硅胶快速干燥法进行保存，既经济又方便。然而五唇兰叶片含水量较高，且叶片表面角质层较厚，因此采取硅胶干燥法无法快速的去除叶片的水分，从而形成干旱胁迫，加剧了衰老的进程，促进DNA的快速降解。因此对于五唇兰这种肉质叶片以及叶片角质层较厚从而无法使水分快速散失的植物，采取保鲜的方法对植物的叶片进行保鲜保存是一种非常简便又经济的方法，比如将叶片放入盛有干冰的冰盒以及如有条件可以放入0 ℃或者4 ℃冰箱等可保存7 d。
致 谢 海南大学园艺园林学院蒙真铖和武华周同学参与了部分工作，特致谢忱！
参考文献
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责任编辑：沈德发
关键词 蝴蝶兰；远距离采样；叶片衰老；DNA降解
中图分类号 S682.3 文献标识码A
Effects of Two Sample Preserving Methods on Genomic
DNA Extraction Quality of Phalaenopsis
pulcherrima（Orchidaceae）
HU Xiangyu1，2， DING Qiong2， SONG Xiqiang1，2 *
WANG Jian2， ZHONG Yunfang1，3
1 Key Laboratory of Protection and Developmental Utilization of Tropical Crop Germplasm Resources（Hainan University），
Ministry of Education， Haikou， Hainan 570228， China
2 College of Horticulture and Landscape Architecture， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China
3 Hainan Evergreen Landscape Technology Limited Company， Haikou， Hainan 570010， China
Abstract A modified CTAB method was used to research the DNA degradation rule of P. pulcherrima leaves saved with silica gel and the low temperature fresh-keeping method respectively. The results showed that DNA degradation of leaves saved with silica gel was rapid， the DNA production rate after one day dropped to 65.4 ng/g， seven clear bands were detected using ISSR primers， and DNA degraded completely after two days； However， DNA of P. pulcherrima leaves saved with low temperature fresh-keeping method could be preserved for one week， and the yield was higher， about 71 ng/g， ISSR primers could detect seven clear bands， after 7 days DNA began to degrade and PCR bands became blurry The rule of DNA degradation and senescence showed consistency. The main reasons for degradation of leaf DNA were intensification of senescence and the accumulation of toxic substances produced during the period. Leaves of P. pulcherrima sampled in the wild can take the method of low temperature to keep fresh.
Key words Phalaenopsis； Long-distance sampling； Leaf senescence； DNA degradation
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.08.017
DNA的提取与纯化是进行分子标记试验最关键的一步，获得高质量的DNA样品是进行PCR扩增的前提[1]。叶片采集之后，离体叶片由于受到内外因素的限制，不可避免地产生衰老。Nodden概括了以往叶片衰老研究结果后提出叶片衰老的中心途径可分为3个时期。诱导期：内外因素导致了叶片衰老的形成，如激素、糖类、水分、温度等；重组期：大分子如蛋白质和脂类开始降解；终止期：叶片衰老的最后时期，细胞自溶反应，核酸如DNA开始降解[2]。 因此，若采集材料后不能马上进行实验，那么就要选取合适的保存方法以延缓叶片的衰老，防止DNA的降解。Doyle 和Dickson[3]曾用解剖学上常用的化学试剂来保存植物材料，但获得DNA均被严重降解，Chase和Hills[4]用硅胶快速干燥法保存金虎尾科（Malpighiacae）等植物叶片，获得DNA与新鲜叶片相似。远距离采样一般无法对新鲜材料立刻提取DNA，干燥的植物样本可以用硅胶浸润，并用塑料袋密封，如果样本干燥不彻底，那么DNA很可能在短时间内降解；采用液氮或干冰低温保存材料，则携带运输不便，不安全，费用也高，一些特殊的材料，比如新生的嫩芽可以在4 ℃存放几天，比较大的组织如树枝可以用湿布包裹，外面套一层塑料，防止脱水[5]。
五唇兰（Phalaenopsis pulcherrima），兰科蝴蝶兰属，东亚特有种，我国仅海南昌江、乐东等地有分布。生于密林或灌丛中，常见于覆有土层的岩石上[6]。五唇兰叶片肉质或厚肉质，采集之后如不采取特殊的保存措施，叶片容易快速的衰老和腐烂，对DNA的提取造成较大的影响。本研究使用改良CTAB法比较了离体叶片分别在硅胶干燥和叶片保鲜保存后DNA的提取质量及其降解规律，拟探究以下问题：（1）两种方法保存的五唇兰叶片衰老的规律；（2）两种方法保存的五唇兰叶片DNA降解规律；（3）叶片衰老和叶片DNA降解之间的关系；（4）五唇兰DNA野外远距离的采样策略。
1 材料与方法
1.1 材料的采集与处理
五唇兰叶片采自海南大学园艺园林学院教学实践基地，采集生长良好、无病菌的叶片。设置两种处理：（1）采集的五唇兰叶片剪成小块（约长6 mm×宽6 mm）立即放入盛有硅胶的封口袋中干燥，硅胶变色后立即更换新硅胶；（2）采集的叶片放入盛有干冰的泡沫盒中，带回实验室放入0 ℃冰箱内。
1.2 方法
1.2.1 五唇兰叶片DNA的提取以及质量的检测
分别于第0、1、2、3、5、7、9、11、13天，采用CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）法[7]提取五唇兰叶片基因组DNA，并用琼脂糖凝胶电泳和分光光度计测定基因组DNA的质量和浓度。DNA浓度（ng）=A260×50×稀释倍数×原液体积/1 000；DNA产率（ng/g）=DNA浓度（ng）/叶片质量（g）。
1.2.2 ISSR-PCR电泳检测五唇兰叶片的DNA质量 使用哥伦比亚大学公布的100套引物中的引物827电泳检测五唇兰叶片DNA提取质量，反应体系为在20 μL的反应体系中，Taq DNA聚合酶1.0 U，Mg2+ 1.5 mmol/L，dNTP 1.80 mmol/L，引物0.5 μmol/L，DNA为30 ng。
1.2.3 五唇兰叶片SOD、POD含量的测定 SOD（Superoxide Dismutase， 即超氧化物歧化酶）含量的测定参考Spychalla和Desborough[8]的方法，POD（Peroxidase， 即过氧化物酶）的含量测定参考Polle等[9]的方法。五唇兰叶片鲜样分别在第1、2、3、5、7、9、11、13天测定SOD和POD的活性，五唇兰干样叶片在第1、2天测定SOD和POD的活性。
1.2.4 五唇兰叶片含水量的测定 采用干燥法测定五唇兰叶片含水量，首先测定叶片鲜重M1，将叶片放置于烘箱中，105 ℃干燥4 h至恒重，测定叶片干重M2，叶片含水量为（M1-M2）/M1。
2 结果与分析
2.1 2种保存方法五唇兰叶片DNA的降解规律
2.1.1 2种保存方法五唇兰叶片DNA质量的变化
低温鲜样保存的五唇兰叶片，保存7 d，质量良好，提取的DNA电泳条带清晰、明亮。第7天后DNA开始逐渐降解，至第13天降解完全，此时无电泳条带（图1-a～e）；而采用硅胶干燥保存的五唇兰叶片，第2天DNA降解完全（图1-f～g）。
2.2 2种保存方法五唇兰叶片DNA产率的变化
低温鲜样保存法的五唇兰叶片在前7 d DNA的提取产率基本上无变化，维持在71%左右，从第7天开始叶片DNA产率急剧下降，第13天DNA产率为0，DNA分解完全；而硅胶干燥保存的五唇兰叶片则在第1天DNA产率就已经下降到65.4 ng/g，第2天DNA产率为0，此时DNA分解完全（表1）。
2.3 2种方法保存五唇兰叶片DNA PCR扩增结果的变化
采取低温鲜样保存法的五唇兰叶片前7天PCR扩增效果较好，扩增出了7条清晰的条带，而第9天扩增的条带较为模糊，条带数量也减少到5条（图2-a、b），因此采取低温鲜样保存法的五唇兰叶片适宜在一周内提取DNA并进行PCR扩增；而采取硅胶干燥保存法的五唇兰叶片在第1天可以扩增出7条清晰的条带，但第2天则无法扩增出条带（图2-c）。
2.4 2种保存方法五唇兰叶片的衰老规律
2.4.1 2种保存方法五唇兰叶片SOD和POD含量的变化 采用低温鲜样保存法的五唇兰叶片SOD和POD的含量都呈现出先上升后下降的趋势，峰值出现在第9天，之后由于叶片开始出现腐烂现象，SOD和POD的含量开始下降（图3）；而采取干燥保存法的五唇兰叶片SOD和POD的含量则在2 d内急剧下降，第2天SOD和POD的含量已经下降到很低（图4）。
2.5 2种保存方法五唇兰叶片含水量的变化
采用低温鲜样保存法的五唇兰叶片含水量在13 d之内呈现稳定的趋势，维持在90%～95%之间，13 d之内的含水量无明显差异（p>0.05）；而采取干燥保存法的叶片含水量两天内虽然有所下降，但是含水量仍在80%以上（图5）。
3 讨论与结论
3.1 采取鲜样保存法的五唇兰叶片衰老和DNA降解之间的关系 超氧物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）等可清除活性氧自由基，从而防止自由基的毒害，称其为保护酶系统[10]。正常情况下SOD、POD活性相对稳定，而在衰老过程中SOD、POD活性逐渐升高，清除植物体内过量的活性氧，保护膜结构，从而能在一定程度上延缓植物器官的衰老过程[11]。
叶片衰老的诱导和重组阶段，一些大分子如蛋白质、脂类产生降解，但DNA不被分解[12]，在叶片衰老的终止阶段，细胞开始产生自溶性反应，可以检测到例如染色质浓缩以及DNA片段化等细胞凋亡的显著特征[13-14]。本研究第8～13天，采取低温鲜样保存的五唇兰叶片属于叶片衰老的终止阶段，在此阶段叶片开始腐烂，DNA产率快速减少（p<0.05），SOD和POD含量开始有略微的增高（第8～9天），之后急剧下降，研究结果与朱诚等[12]以及Wollaston等[15]的研究结果一致，因此低温鲜样保存法使五唇兰叶片保存一周而DNA不被降解。
3.2 采取硅胶干燥保存法的五唇兰叶片衰老和DNA降解之间的关系
环境湿度的降低能够明显的促进DNA的降解[16]，环境湿度最终通过影响叶片含水量而间接影响叶片DNA的降解。
现阶段，为了使叶片DNA不被降解，硅胶快速干燥保存已经成为一种非常有用的叶片方法，前人已经使用硅胶干燥叶片来保存叶片并获得了良好的研究结果[17-19]。然而，五唇兰叶片肉质，硅胶无法对叶片进行快速干燥，采取硅胶干燥保存方法的五唇兰叶片第2天仍具有很高的含水量（81.2%），五唇兰叶片含水量的降低对叶片本身形成了干旱胁迫，加快了叶片衰老的进程，叶片衰老在两天之内快速完成，期间SOD和POD活性快速降低，DNA急剧降解。
3.3 五唇兰叶片野外采集之后的保存
野外采集叶片时由于采取真空法以及液氮保存法较为困难，因此对于较薄且水分容易散失的叶片，一般采取硅胶快速干燥法进行保存，既经济又方便。然而五唇兰叶片含水量较高，且叶片表面角质层较厚，因此采取硅胶干燥法无法快速的去除叶片的水分，从而形成干旱胁迫，加剧了衰老的进程，促进DNA的快速降解。因此对于五唇兰这种肉质叶片以及叶片角质层较厚从而无法使水分快速散失的植物，采取保鲜的方法对植物的叶片进行保鲜保存是一种非常简便又经济的方法，比如将叶片放入盛有干冰的冰盒以及如有条件可以放入0 ℃或者4 ℃冰箱等可保存7 d。
致 谢 海南大学园艺园林学院蒙真铖和武华周同学参与了部分工作，特致谢忱！
参考文献
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责任编辑：沈德发