背景:前期研究应用玻璃化冻存脂肪干细胞-脱钙骨支架复合物1周,得到玻璃化冻存液合适的配比成分。延长玻璃化冻存时间至12周,是否仍能保持细胞活力以及成骨能力值得进一步研究。目的:探讨短时(1周)、长时(12周)玻璃化冻存对组织工程骨中脂肪干细胞增殖活性和成骨能力的影响。方法:分离新西兰大白兔脂肪干细胞,扩增至第3代,接种于猪松质骨来源的脱钙骨,成骨诱导1周。将构建的组织工程骨,转移至含有玻璃化冻存液(30%二甲基亚砜,70%LG-DMEM,0.8 mol/L海藻糖)的2 m L冻存管中,将冻存管投入液氮冻存。分别于冻存后1周和12周,复苏1,3,7,11,13 d,用活死双染试剂染色,共聚焦显微镜观察脂肪干细胞在脱钙骨上的生长情况。复苏1,3,5,7,9,11,13 d,用Hochest33258法检测支架材料上的细胞数目。复苏1,4,7,10,14,21 d,用PNP微板法检测碱性磷酸酶活力,Real-time PCR检测成骨基因Runx2,OCN,COL-1,ALP的表达。结果与结论:(1)细胞活死双染结果显示,冻存1周或12周后,复苏1 d时红染的死细胞较冻存前红染的死细胞多,复苏3 d后绿染的活细胞逐渐增多;(2)Hochest33258结果表明,与冻存前的细胞数相比,冻存1周或者12周后,复苏第1,3天的细胞数目有所降低,复苏3 d后细胞数目开始持续增加,复苏第5天细胞数目恢复至冻存前水平;(3)复苏后1,4 d,碱性磷酸酶活力降低但是与冻存前比较差异无显著性意义,复苏4 d后碱性磷酸酶活力持续升高;(4)复苏后1,4 d,成骨基因Runx2,Col-1,ALP,OCN表达降低但是与冻存前相比差异无显著性意义,复苏4 d后成骨基因表达持续升高;(5)玻璃化冻存1周与12周比较,复苏后的细胞活力和成骨活性差异均无显著性意义;(6)实验初步证实,玻璃化冻存可以保持组织工程骨的细胞活力与成骨活性;冻存时间(1,12周)对复苏后组织工程骨的成骨能力没有显著影响。