【摘 要】
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目的 研究反式激活蛋白(TAT)蛋白转导结构域介导的融合蛋白的跨膜转运,以及氧依赖性降解(ODD)结构域介导融合蛋白在体内外不同氧分压环境中的降解作用.方法 将TAT,ODD以及增
【机 构】
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军事医学科学院毒物药物研究所,北京市疾病预防控制中心
【基金项目】
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国家重点基础研究发展规划(973计划);国家自然科学基金面上项目
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目的 研究反式激活蛋白(TAT)蛋白转导结构域介导的融合蛋白的跨膜转运,以及氧依赖性降解(ODD)结构域介导融合蛋白在体内外不同氧分压环境中的降解作用.方法 将TAT,ODD以及增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因序列进行融合,构建了TAT-ODD-EGFP融合蛋白基因.将该序列克隆到原核表达载体pET28a中,在BL21工程菌中进行表达,通过亲和柱层析法纯化,得到高纯度的融合蛋白.同方法制备EGFP和TAT-EGFP融合蛋白作为对照.在20% O2和1%O2将融合蛋白与A549,H1299和MDA-MB-231细胞系孵育,荧光显微镜下观察融合蛋白在细胞中的分布以及稳定性.小鼠尾静脉注射不同融合蛋白( 10 mg·kg-1),分别在注射后1,6和12 h处死动物,取脏器在荧光显微镜下观察融合蛋白的分布及稳定性.结果 由于EGFP相对分子质量大,无法穿透细胞及组织.TAT可以有效地介导TAT-EGFP进入细胞和动物实体组织,其稳定性不受细胞或组织中氧分压的影响,而TAT-ODD-EGFP进入细胞或组织后,在20% O2条件下迅速降解,但可稳定存在于1% O2细胞及组织中.结论 TAT可以有效地转导融合蛋白穿过细胞膜.引入ODD,20%O2下融合蛋白TAT-ODD-EGFP迅速降解,但可以稳定存在于1% O2细胞和组织中,说明TAT-ODD可以转导蛋白进入并靶向存在于低氧的肿瘤组织中.
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