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[摘要]目的：探讨葛根素对人牙周膜干细胞（human periodontal ligament stem cells，hPDLSCs）成骨分化的影响。方法：向体外培养的hPDLSCs中分别加入0.01mmol/L、0.1mmol/L和1mmol/L葛根素作为实验组，另设阳性对照组和空白组。MTT法检测葛根素对hPDLSCs活性影响，采用免疫荧光法、碱性磷酸酶（alkaline phosphotase，ALP）试剂盒、茜素红染色及qRT-PCR对葛根素作用后hPDLSCs生物学特性作初步观察。结果：0.01mmol/L葛根素可明显促进hPDLSCs增殖，免疫荧光染色显示实验组I型胶原蛋白（collagen-I，COL-I）和骨桥蛋白（osteopontin，OPN）均阳性表达；与空白组对比，实验组诱导7天后ALP活性升高，14天后茜素红染色见矿化结节形成，qRT-PCR检测ALP和骨钙蛋白（osteocalcin，OCN）分别在加药后7天和14天表达上调。结论：葛根素能够促进牙周膜干细胞向成骨细胞分化。
[关键词]牙周膜干细胞；葛根素；成骨分化
[中图分类号]Q813.1 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2013）10-1067-05
众所周知，雌激素缺乏会增加患牙周病的危险度引起牙槽骨迅速吸收牙齿松动[1]。葛根素是从豆科植物野葛的干燥根中提取的一种异黄酮类化合物，可作为雌激素的替代药物发挥雌激素样作用[2]。文献报道葛根素能够促进脐带间质干细胞向成骨细胞分化[3]。人牙周膜干细胞（human periodontal ligament stem cells，hPDLSCs）具有多向分化潜能，在适当的条件下，可分化为成骨细胞、成牙骨质细胞、脂肪细胞及神经元样细胞[4]。本研究旨在探讨葛根素对hPDLSCs成骨分化的影响，为临床牙槽骨再生的防治提供新的思路。
1 材料和方法
1.1实验材料：葛根素（陕西天润生化有限公司，HPLC≥98%），二甲基亚砜、胎牛血清、α-MEM培养基、胰酶、Dispase酶、胶原酶（Gibco，美国），免疫磁珠、磁力架（Dynal biotech，美国），STRO-1单克隆抗体、CD146单抗、抗波形丝蛋白单抗、抗广谱角蛋白单抗、抗骨桥蛋白单抗（Novex，美国），抗I型胶原蛋白单抗、山羊抗鼠荧光二抗（Abcam，美国），山羊抗兔荧光二抗（Jackson，美国），地塞米松、维生素C、β-甘油磷酸钠、茜素红、MTT（Sigma，美国），ALP试剂盒（南京建成），DNAase试剂盒（Promega，美国），反转录试剂盒（Takara，日本），qPCR试剂盒（Roche，瑞士）。
1.2 实验方法
1.2.1 hPDLSCs的分离和培养：在供者知情同意的前提下，收集12～16岁因正畸拔除的双尖牙，所选牙齿均无龋坏、根尖周疾病及牙周炎。参考以往的文献[5-6]，将新鲜拔除的牙齿在超净工作台内冲洗干净后，仔细刮取根中1/3的牙周膜组织，加入1ml 6mg/ml的胶原酶和1ml 8mg/ml的Dispase酶（此为四颗牙用量）混匀37℃水浴消化1h左右，1000rpm离心5min后弃上清，细胞重悬于10%胎牛血清的α-MEM培养基中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。待人牙周膜细胞（human periodontal ligament cells，hPDLCs）传至第三代，采用免疫磁珠法分离hPDLSCs：将约1×106/ml的hPDLCs与STRO-1单抗4℃孵育1h，与磁珠4℃孵育30min，在磁力架作用下筛选出STRO-1+hPDLCs并接种于6 孔板内，37℃、5% CO2的孵箱中培养。
1.2.2 hPDLSCs的鉴定：将筛选出的STRO-1+hPDLCs制备成细胞爬片，免疫荧光法进行STRO-1 、CD146、波形丝蛋白（Vimentin）及角蛋白（Cytokertin）染色，阴性对照以PBS代替一抗，荧光显微镜下观察。
1.2.3 MTT法检测葛根素对hPDLSCs活性的影响：将hPDLSCs按1×103/孔接种于96孔板，待细胞贴壁后分别更换为含0.01mmol/L、0.1mmol/L、1mmol/L葛根素的α-MEM培养基（每孔200μl），每组设5个复孔，同时设不含葛根素的空白对照组。继续培养24h后， 各孔加入MTT 20μl，置37 ℃、5% CO2培养箱培养4h，弃上清液， 每孔加入DMSO溶液150μl，混匀后用酶标仪检测其在570 nm 处的吸光度值。
1.2.4 葛根素对hPDLSCs成骨分化的影响
1.2.4.1 免疫荧光染色：分别取实验组培养7天和14天的细胞制备爬片，免疫荧光法进行成骨标志COL-I及OPN染色，阴性对照以PBS代替一抗，未加葛根素组作为空白对照，荧光显微镜下观察。
1.2.4.2 ALP活性测定：将hPDLSCs接种于24孔板，待70%～80%汇合后，实验组更换为含0.01mmol/L、0.1mmol/L、1mmol/L葛根素培养基，同时设空白组（不含葛根素的α-MEM培养基）和阳性对照组（成骨诱导液：含10%FBS的α-MEM、100nmol/L的地塞米松、0.05mmol/L的抗坏血酸、10mmol/L的 β-甘油磷酸钠[7]），继续培养7天后（每两天更换培养基），按照ALP试剂盒说明书操作在酶标仪520nm波长处测定各孔的吸光度并计算出ALP浓度。
1.2.4.3 矿化结节形成检测：将hPDLSCs接种于6孔板，待70%～80%汇合后，同上设置实验组、空白组、阳性对照组，培养14天后，弃培养液，4%多聚甲醛室温固定15min，PBS（pH=4.2）冲洗2次，2%（w/v）茜素红溶液在37℃孵育箱内染色20min后PBS冲洗3次，镜下观察矿化结节的形成情况。 1.2.4.4 qRT-PCR检测成骨相关基因的表达情况：将hPDLSCs接种于12孔板，待70%～80%汇合后，实验组、空白组、阳性对照组更换相应培养液，分别在培养7天和14天后收集细胞并以TRIzol提取总RNA，用DNAase处理后测其在波长260nm和280nm处的吸光度比值，介于1.8～2.0纯度的RNA用反转录试剂盒合成cDNA。荧光定量PCR采用LightCycler480系统，步骤为：变性95℃ 60s，退火58℃ 30s，延伸72℃ 30s，共扩增40个循环。成骨相关基因引物及内参基因GAPDH序列为：ALP引物序列：F：TTCAAACCGAGATACAAGCACT，R：GGGCCAGACCAA AGATAGAG；OCN引物序列：F：GCAGCCACCGAGACACCAT，R：AGAGCGACACCCTAGACCG；内参基因GAPDH引物序列：F：AGGTCGGAGTCAACGGATTTG，R：AGGCTGTTGTCATAC TTCTCAT。
1.3 统计学分析：采用SPSS16.0 软件对组间进行单因素方差分析，并比较各组间的差异，P<0.05即认为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 hPDLSCs分离和培养：本实验采用酶消化法从人牙周膜中分离出原代hPDLCs进行培养，3～7天后见细胞爬出，呈梭形成纤维细胞状，两周左右可达80%汇合。用免疫磁珠法筛选出hPDLSCs，接种于24孔板，约两周长满孔底80%。hPDLSCs形态与hPDLCs相似，为梭形、多角形或不规则形，呈旋涡状或放射状排列（图1A）。筛选前后分别进行细胞计数，结果显示STRO-1+细胞约占细胞总数的2%。
2.2 hPDLSCs鉴定：免疫荧光法检测示筛选出的细胞STRO-1、CD146 均呈阳性表达（图1B、C），提示其具有干细胞特性。Cytokertin呈阴性表达，Vimentin呈阳性表达（图1D），说明筛选出的细胞为中胚层来源的间充质细胞，无外胚层来源的细胞污染。
2.3 葛根素对hPDLSCs增殖影响：MTT检测结果显示，hPDLSCs在0.01mmol/L、0.1mmol/L和1mmol/L葛根素作用24h后，各实验组OD值均大于空白组，且0.01mmol/L组差异有统计学意义（图2）。提示0.01mmol/L葛根素有促进hPDLSCs增殖作用，而其他两浓度组对细胞未产生毒性作用。
2.4 葛根素对hPDLSCs成骨分化的影响
2.4.1 免疫荧光染色：将实验组hPDLSCs进行免疫荧光染色，结果显示成骨表面标志COL-I和OPN分别在葛根素作用7天和14天后呈阳性表达（图3A、B），空白组及PBS阴性对照组呈阴性表达，提示葛根素可使hPDLSCs向成骨细胞分化。
2.4.2 ALP活性：如图4示，与空白组相比，葛根素各浓度组在加药7天后细胞内ALP水平明显升高，差异具有统计学意义，与阳性对照组相比差异不显著，提示葛根素可促进hPDLSCs成骨分化。
2.4.3 矿化结节形成：各组细胞培养14天后进行茜素红染色，结果显示，实验组及阳性对照组均见大量矿化结节形成，其中0.1mmol/L葛根素组与阳性对照组的矿化结节大小及数量相当，但0.01mmol/L和1mmol/L葛根素组的矿化结节数少于阳性对照组（图3C～G）。
2.4.4 RT-PCR：RT-PCR分别检测早期和晚期成骨相关基因ALP和OCN。ALP表达变化为：在加药第7天时各浓度葛根素组和阳性对照组均呈上调趋势，其中0.1mmol/L组上调显著，为空白对照组的4.8倍；在加药第14天时各浓度葛根素组的ALP表达量与空白对照组相比未见明显变化。OCN表达变化为：在加药第7天时各组OCN表达量没有明显变化；在加药第14天时各浓度葛根素组和阳性对照组OCN表达量均显著上调，其中0.1mmol/L组上调最为显著，为空白对照组的5.6倍（图5）。
3 讨论
牙周膜干细胞是牙周组织中的成体干细胞，自从2004年Seo[6]成功地将其分离出来，它便以多向分化潜能及牙周高相关性成为牙周组织工程理想的种子细胞，近几年来已成为牙周再生医学研究领域的热点课题[8]。研究表明PDLSCs上表达雌激素受体（ER-α、ER-β），且受雌激素的调控[9]，进一步研究发现ER-β是雌激素调控牙周膜细胞增殖与成骨分化的主要受体[10]。ZhangB等从反面证明卵巢切除大鼠牙周膜干细胞成骨分化能力受损[11]。
雌激素替代疗法被认为是一种有效的防治骨质疏松促进骨形成的方法，但是长期使用雌激素会极大地提高乳腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌等的发病率[12]。而植物类雌激素能够有效地弥补了这一缺陷，如黄酮类中草药淫羊藿苷在一定浓度范围内可促进人牙周膜细胞增殖及骨向分化[13]。同属黄酮类的药物葛根素亦能够发挥雌激素样作用即促进骨密度增加和骨矿沉积[14]。近年来，国内越来越多的学者开始探索葛根素在骨代谢方面的作用。蔡花[3]等研究表明葛根素对脐带间充质干细胞增殖及成骨分化有促进作用；李斌斌[15]等将葛根素分别作用于成骨细胞和破骨细胞发现葛根素通过抑制骨吸收刺激骨形成来调控骨代谢，其中抑制骨吸收的效果较强；金为旭[16]将葛根素注射于拔牙窝周围发现其能够抑制剩余牙槽嵴的吸收并保存牙槽嵴的高度。但关于葛根素对hPDLSCs成骨分化的调控作用尚未见报道。本实验采用免疫磁珠法成功地分离出hPDLSCs，并通过免疫荧光染色检测证实其表达干细胞表面标志物STRO-1和CD146。当加入不同浓度的葛根素时，MTT结果显示随着浓度的增高细胞增殖率递减，0.01mmol/L组明显促进hPDLSCs的增殖，而其他两组与空白组无显著差异，以往的研究已发现葛根素在低浓度时促进而超过1.2mmol/L即开始抑制细胞增殖[2-3]，本实验所选三个浓度均未对hPDLSCs造成毒性作用。含有β-甘油磷酸钠、维生素C、地塞米松的成骨诱导液是间充质干细胞向成骨细胞分化所必需[7]，可诱导hPDLSCs分化为成骨细胞，这一过程大致分为两个阶段，即基质成熟（成骨早期）和矿化完成（成骨晚期）。分化早期伴随着PDLSCs增殖减弱，基质成熟的标志物--ALP逐渐增高，到了晚期基质开始矿化，OCN表达升高，矿化结节大量形成，如果早期细胞过度增殖则无法顺利进入下一阶段[17]。本实验以成骨诱导液作为阳性对照，观察葛根素对PDLSCs成骨分化的作用。加药作用7天后，ALP活性升高， RT-PCR检测进一步证实早期ALP表达显著上调。加药作用14天后，与空白组对比，OCN表达明显上调，茜素红染色亦可见大量矿化结节形成。免疫荧光染色检测显示成骨表面标志COL-I及OPN均阳性表达。对比分析本次实验组的三个浓度，0.1mmol/L葛根素组成骨表现强于其他两浓度组，分析可能是因为0.01mmol/L的葛根素明显促进hPDLSCs的增殖阻碍其向下一阶段即成骨分化发展，而1mmol/L的葛根素对hPDLSCs的增殖和分化均产生了轻微的抑制作用，但具体的作用机制还有待进一步的研究。 本研究首次表明：在适当的浓度作用下，葛根素可有效地促进hPDLSCs向成骨细胞分化，为其应用于口腔临床防治牙槽骨吸收提供了理论基础。
[参考文献]
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[16]金为旭，苗波.局部注射葛根素对鼠拔牙后剩余牙槽嵴吸收影响的实验研究[J].北京口腔医学，2010，18（2）：77-79.
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[收稿日期]2013-04-13 [修回日期]2013-05-10
编辑/张惠娟
[关键词]牙周膜干细胞；葛根素；成骨分化
[中图分类号]Q813.1 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2013）10-1067-05
众所周知，雌激素缺乏会增加患牙周病的危险度引起牙槽骨迅速吸收牙齿松动[1]。葛根素是从豆科植物野葛的干燥根中提取的一种异黄酮类化合物，可作为雌激素的替代药物发挥雌激素样作用[2]。文献报道葛根素能够促进脐带间质干细胞向成骨细胞分化[3]。人牙周膜干细胞（human periodontal ligament stem cells，hPDLSCs）具有多向分化潜能，在适当的条件下，可分化为成骨细胞、成牙骨质细胞、脂肪细胞及神经元样细胞[4]。本研究旨在探讨葛根素对hPDLSCs成骨分化的影响，为临床牙槽骨再生的防治提供新的思路。
1 材料和方法
1.1实验材料：葛根素（陕西天润生化有限公司，HPLC≥98%），二甲基亚砜、胎牛血清、α-MEM培养基、胰酶、Dispase酶、胶原酶（Gibco，美国），免疫磁珠、磁力架（Dynal biotech，美国），STRO-1单克隆抗体、CD146单抗、抗波形丝蛋白单抗、抗广谱角蛋白单抗、抗骨桥蛋白单抗（Novex，美国），抗I型胶原蛋白单抗、山羊抗鼠荧光二抗（Abcam，美国），山羊抗兔荧光二抗（Jackson，美国），地塞米松、维生素C、β-甘油磷酸钠、茜素红、MTT（Sigma，美国），ALP试剂盒（南京建成），DNAase试剂盒（Promega，美国），反转录试剂盒（Takara，日本），qPCR试剂盒（Roche，瑞士）。
1.2 实验方法
1.2.1 hPDLSCs的分离和培养：在供者知情同意的前提下，收集12～16岁因正畸拔除的双尖牙，所选牙齿均无龋坏、根尖周疾病及牙周炎。参考以往的文献[5-6]，将新鲜拔除的牙齿在超净工作台内冲洗干净后，仔细刮取根中1/3的牙周膜组织，加入1ml 6mg/ml的胶原酶和1ml 8mg/ml的Dispase酶（此为四颗牙用量）混匀37℃水浴消化1h左右，1000rpm离心5min后弃上清，细胞重悬于10%胎牛血清的α-MEM培养基中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。待人牙周膜细胞（human periodontal ligament cells，hPDLCs）传至第三代，采用免疫磁珠法分离hPDLSCs：将约1×106/ml的hPDLCs与STRO-1单抗4℃孵育1h，与磁珠4℃孵育30min，在磁力架作用下筛选出STRO-1+hPDLCs并接种于6 孔板内，37℃、5% CO2的孵箱中培养。
1.2.2 hPDLSCs的鉴定：将筛选出的STRO-1+hPDLCs制备成细胞爬片，免疫荧光法进行STRO-1 、CD146、波形丝蛋白（Vimentin）及角蛋白（Cytokertin）染色，阴性对照以PBS代替一抗，荧光显微镜下观察。
1.2.3 MTT法检测葛根素对hPDLSCs活性的影响：将hPDLSCs按1×103/孔接种于96孔板，待细胞贴壁后分别更换为含0.01mmol/L、0.1mmol/L、1mmol/L葛根素的α-MEM培养基（每孔200μl），每组设5个复孔，同时设不含葛根素的空白对照组。继续培养24h后， 各孔加入MTT 20μl，置37 ℃、5% CO2培养箱培养4h，弃上清液， 每孔加入DMSO溶液150μl，混匀后用酶标仪检测其在570 nm 处的吸光度值。
1.2.4 葛根素对hPDLSCs成骨分化的影响
1.2.4.1 免疫荧光染色：分别取实验组培养7天和14天的细胞制备爬片，免疫荧光法进行成骨标志COL-I及OPN染色，阴性对照以PBS代替一抗，未加葛根素组作为空白对照，荧光显微镜下观察。
1.2.4.2 ALP活性测定：将hPDLSCs接种于24孔板，待70%～80%汇合后，实验组更换为含0.01mmol/L、0.1mmol/L、1mmol/L葛根素培养基，同时设空白组（不含葛根素的α-MEM培养基）和阳性对照组（成骨诱导液：含10%FBS的α-MEM、100nmol/L的地塞米松、0.05mmol/L的抗坏血酸、10mmol/L的 β-甘油磷酸钠[7]），继续培养7天后（每两天更换培养基），按照ALP试剂盒说明书操作在酶标仪520nm波长处测定各孔的吸光度并计算出ALP浓度。
1.2.4.3 矿化结节形成检测：将hPDLSCs接种于6孔板，待70%～80%汇合后，同上设置实验组、空白组、阳性对照组，培养14天后，弃培养液，4%多聚甲醛室温固定15min，PBS（pH=4.2）冲洗2次，2%（w/v）茜素红溶液在37℃孵育箱内染色20min后PBS冲洗3次，镜下观察矿化结节的形成情况。 1.2.4.4 qRT-PCR检测成骨相关基因的表达情况：将hPDLSCs接种于12孔板，待70%～80%汇合后，实验组、空白组、阳性对照组更换相应培养液，分别在培养7天和14天后收集细胞并以TRIzol提取总RNA，用DNAase处理后测其在波长260nm和280nm处的吸光度比值，介于1.8～2.0纯度的RNA用反转录试剂盒合成cDNA。荧光定量PCR采用LightCycler480系统，步骤为：变性95℃ 60s，退火58℃ 30s，延伸72℃ 30s，共扩增40个循环。成骨相关基因引物及内参基因GAPDH序列为：ALP引物序列：F：TTCAAACCGAGATACAAGCACT，R：GGGCCAGACCAA AGATAGAG；OCN引物序列：F：GCAGCCACCGAGACACCAT，R：AGAGCGACACCCTAGACCG；内参基因GAPDH引物序列：F：AGGTCGGAGTCAACGGATTTG，R：AGGCTGTTGTCATAC TTCTCAT。
1.3 统计学分析：采用SPSS16.0 软件对组间进行单因素方差分析，并比较各组间的差异，P<0.05即认为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 hPDLSCs分离和培养：本实验采用酶消化法从人牙周膜中分离出原代hPDLCs进行培养，3～7天后见细胞爬出，呈梭形成纤维细胞状，两周左右可达80%汇合。用免疫磁珠法筛选出hPDLSCs，接种于24孔板，约两周长满孔底80%。hPDLSCs形态与hPDLCs相似，为梭形、多角形或不规则形，呈旋涡状或放射状排列（图1A）。筛选前后分别进行细胞计数，结果显示STRO-1+细胞约占细胞总数的2%。
2.2 hPDLSCs鉴定：免疫荧光法检测示筛选出的细胞STRO-1、CD146 均呈阳性表达（图1B、C），提示其具有干细胞特性。Cytokertin呈阴性表达，Vimentin呈阳性表达（图1D），说明筛选出的细胞为中胚层来源的间充质细胞，无外胚层来源的细胞污染。
2.3 葛根素对hPDLSCs增殖影响：MTT检测结果显示，hPDLSCs在0.01mmol/L、0.1mmol/L和1mmol/L葛根素作用24h后，各实验组OD值均大于空白组，且0.01mmol/L组差异有统计学意义（图2）。提示0.01mmol/L葛根素有促进hPDLSCs增殖作用，而其他两浓度组对细胞未产生毒性作用。
2.4 葛根素对hPDLSCs成骨分化的影响
2.4.1 免疫荧光染色：将实验组hPDLSCs进行免疫荧光染色，结果显示成骨表面标志COL-I和OPN分别在葛根素作用7天和14天后呈阳性表达（图3A、B），空白组及PBS阴性对照组呈阴性表达，提示葛根素可使hPDLSCs向成骨细胞分化。
2.4.2 ALP活性：如图4示，与空白组相比，葛根素各浓度组在加药7天后细胞内ALP水平明显升高，差异具有统计学意义，与阳性对照组相比差异不显著，提示葛根素可促进hPDLSCs成骨分化。
2.4.3 矿化结节形成：各组细胞培养14天后进行茜素红染色，结果显示，实验组及阳性对照组均见大量矿化结节形成，其中0.1mmol/L葛根素组与阳性对照组的矿化结节大小及数量相当，但0.01mmol/L和1mmol/L葛根素组的矿化结节数少于阳性对照组（图3C～G）。
2.4.4 RT-PCR：RT-PCR分别检测早期和晚期成骨相关基因ALP和OCN。ALP表达变化为：在加药第7天时各浓度葛根素组和阳性对照组均呈上调趋势，其中0.1mmol/L组上调显著，为空白对照组的4.8倍；在加药第14天时各浓度葛根素组的ALP表达量与空白对照组相比未见明显变化。OCN表达变化为：在加药第7天时各组OCN表达量没有明显变化；在加药第14天时各浓度葛根素组和阳性对照组OCN表达量均显著上调，其中0.1mmol/L组上调最为显著，为空白对照组的5.6倍（图5）。
3 讨论
牙周膜干细胞是牙周组织中的成体干细胞，自从2004年Seo[6]成功地将其分离出来，它便以多向分化潜能及牙周高相关性成为牙周组织工程理想的种子细胞，近几年来已成为牙周再生医学研究领域的热点课题[8]。研究表明PDLSCs上表达雌激素受体（ER-α、ER-β），且受雌激素的调控[9]，进一步研究发现ER-β是雌激素调控牙周膜细胞增殖与成骨分化的主要受体[10]。ZhangB等从反面证明卵巢切除大鼠牙周膜干细胞成骨分化能力受损[11]。
雌激素替代疗法被认为是一种有效的防治骨质疏松促进骨形成的方法，但是长期使用雌激素会极大地提高乳腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌等的发病率[12]。而植物类雌激素能够有效地弥补了这一缺陷，如黄酮类中草药淫羊藿苷在一定浓度范围内可促进人牙周膜细胞增殖及骨向分化[13]。同属黄酮类的药物葛根素亦能够发挥雌激素样作用即促进骨密度增加和骨矿沉积[14]。近年来，国内越来越多的学者开始探索葛根素在骨代谢方面的作用。蔡花[3]等研究表明葛根素对脐带间充质干细胞增殖及成骨分化有促进作用；李斌斌[15]等将葛根素分别作用于成骨细胞和破骨细胞发现葛根素通过抑制骨吸收刺激骨形成来调控骨代谢，其中抑制骨吸收的效果较强；金为旭[16]将葛根素注射于拔牙窝周围发现其能够抑制剩余牙槽嵴的吸收并保存牙槽嵴的高度。但关于葛根素对hPDLSCs成骨分化的调控作用尚未见报道。本实验采用免疫磁珠法成功地分离出hPDLSCs，并通过免疫荧光染色检测证实其表达干细胞表面标志物STRO-1和CD146。当加入不同浓度的葛根素时，MTT结果显示随着浓度的增高细胞增殖率递减，0.01mmol/L组明显促进hPDLSCs的增殖，而其他两组与空白组无显著差异，以往的研究已发现葛根素在低浓度时促进而超过1.2mmol/L即开始抑制细胞增殖[2-3]，本实验所选三个浓度均未对hPDLSCs造成毒性作用。含有β-甘油磷酸钠、维生素C、地塞米松的成骨诱导液是间充质干细胞向成骨细胞分化所必需[7]，可诱导hPDLSCs分化为成骨细胞，这一过程大致分为两个阶段，即基质成熟（成骨早期）和矿化完成（成骨晚期）。分化早期伴随着PDLSCs增殖减弱，基质成熟的标志物--ALP逐渐增高，到了晚期基质开始矿化，OCN表达升高，矿化结节大量形成，如果早期细胞过度增殖则无法顺利进入下一阶段[17]。本实验以成骨诱导液作为阳性对照，观察葛根素对PDLSCs成骨分化的作用。加药作用7天后，ALP活性升高， RT-PCR检测进一步证实早期ALP表达显著上调。加药作用14天后，与空白组对比，OCN表达明显上调，茜素红染色亦可见大量矿化结节形成。免疫荧光染色检测显示成骨表面标志COL-I及OPN均阳性表达。对比分析本次实验组的三个浓度，0.1mmol/L葛根素组成骨表现强于其他两浓度组，分析可能是因为0.01mmol/L的葛根素明显促进hPDLSCs的增殖阻碍其向下一阶段即成骨分化发展，而1mmol/L的葛根素对hPDLSCs的增殖和分化均产生了轻微的抑制作用，但具体的作用机制还有待进一步的研究。 本研究首次表明：在适当的浓度作用下，葛根素可有效地促进hPDLSCs向成骨细胞分化，为其应用于口腔临床防治牙槽骨吸收提供了理论基础。
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[收稿日期]2013-04-13 [修回日期]2013-05-10
编辑/张惠娟