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摘要：研究建立高效液相色谱法（HPLC）快速检测蔬菜中还原型维生素C含量的方法，并通过二流苏糖醇（DDT）还原脱氢型维生素C，从而得到总维生素C、脱氢型维生素C含量。以3%偏磷酸为提取液，乙腈-0.015 mol/L磷酸二氢铵溶液（体积比85 ∶ 15）为流动相，流速为1.5 mL/min，采用Waters C-18（150 mm×3.9 mm，5 μm）反相色谱分离，用紫外检测器于254 nm波长下检测。结果表明：在1～500 mg/L浓度范围内线性良好（r=0.999 6），所有蔬菜样品检测相对标准偏差为0.63%～1.83%，平均加标回收率为99.89%。用该方法测定蔬菜中维生素C含量，结果稳定、重现性良好，适用于维生素C含量范围较大及颜色各异的多种蔬菜。
关键词：高效液相色谱法（HPLC）；二流苏糖醇（DDT）；蔬菜；总维生素C；还原型维生素C
中图分类号： S132；O652.63 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2016）07-0304-03
维生素C是一种人类必需的营养素[1]，其主要形式为L-还原型、L-脱氢型，最主要的功能是参与胶原蛋白质的合成，动物缺乏维生素C会造成坏血病[2]。作为一种抗氧化剂和高活性物质，维生素C参与许多新陈代谢过程，可以保护人体免于自由基的威胁，具有提高免疫力，预防癌症、心脏病、中风，保护牙齿和牙龈，抗衰老等许多生理作用[2-4]。有研究表明：一定剂量的维生素C可抗细胞DNA损伤[5]；在老鼠铅中毒的同时及其后，补充维生素C可降低血铅浓度[6]；此外，维生素C还具有预防乙醇对脑、肝损伤的作用[7]。人类自身不能够制造维生素C，其广泛的食物来源为各类新鲜果蔬，并且蔬菜中的总维生素C含量相比还原型维生素C更能够表征蔬菜的营养价值。因此，建立能够快速检测蔬菜中总维生素C含量的方法十分重要，能为人们的膳食营养提供更为确切的参考，从而有效预防和抵制因体内缺少维生素C而带来的不利影响，提高人们的工作效率和生活质量。
维生素C的测定方法有多种，各有优缺点。如《中华人民共和国药典》规定的碘量法因其试验操作时不易把握酸度、碘易挥发等，使得测定结果准确度降低，不适于微量分析；而大多数水果、蔬菜的提取液具有一定色泽，又使得以颜色变化来辨别其滴定终点的国标法2，6-二氯靛酚滴定法（GB/T 6195—1986《水果、蔬菜维生素C含量测定法（2，6-二氯靛酚滴定法）》）具有一定的局限性；此外，还包括容量法、苯肼比色法、荧光光度法、电位法、紫外分光光度法等，但是这些方法或存在所需试剂较多、试剂不稳定、操作繁琐等缺点[8-10]，或只能测定还原型维生素C含量，不能测定具有同样生理功能的脱氢型维生素C含量，如荧光法、苯肼比色法[11]。
高效液相色谱（HPLC）是近年来发展起来的一种快速高效且稳定可靠、发展较快的分离技术，因其处理样品简单快速，且能同时测定几种维生素而被广泛应用于食品药品中维生素含量的测定[8-17]。但是，该方法目前主要测定的是还原型维生素C[11]，而对蔬菜中同样具有生理功能的脱氢型维生素C含量的检测报道较少。本研究通过利用二硫苏糖醇（DTT）能够将脱氢型维生素C还原而不具有生理活性的二酮古洛糖酸则不会被还原[17-18]，并且与高效液相色谱法结合，可测定出还原型维生素C、总维生素C含量，从而得出脱氢型维生素C含量，以总维生素C含量表征蔬菜的营养价值更为准确。
1 材料与方法
1.1 试剂与材料
乙腈，色谱纯；磷酸二氢铵，分析纯；维生素C标准品，分析纯，维生素C含量≥99.7%，国药集团化学试剂有限公司；偏磷酸，分析纯；二硫苏糖醇（DTT）；超纯水，笔者所在实验室自制；0.45 μm滤膜，国药集团化学试剂有限公司。小白菜、番茄，市购。
1.2 仪器与设备
Waters e2695型高效液相色谱，美国；Waters DELTA-PAK C18色谱柱，日本；Waters 2998 PAD紫外檢测器；DP-01隔膜真空泵，天津市东康科技有限公司；KQ2200型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；MILLI-Q型超纯水装置。
1.3 试验方法
1.3.1 色谱条件 Waters DELTA-PAK C18色谱柱，柱长150 mm，内径3.9 mm，颗粒大小5 μm；检测波长为254 nm。根据本试验高效液相色谱仪的性能特点，选择乙腈 -0.015 mol/L NH4H2PO4（体积比85 ∶ 15）作为流动相；流速为1.5 mL/min，进样量10 μL，柱温25 ℃；以保留时间定性，待液相色谱稳定后进样分析，以峰面积定量。
1.3.2 样品制备 称取新鲜小白菜、番茄样品各4.00 g，迅速剪碎后加入少量3%偏磷酸研磨制成匀浆，用3%偏磷酸定容至100 mL棕色容量瓶中，过滤，再吸取一部分滤液过 0.45 μm 微孔滤膜，然后按“1.3.1”节色谱条件进行HPLC测定，所得数值为还原型维生素C含量。脱氢型维生素C含量=维生素C总量-还原型维生素C含量，前提是将样品中脱氢型维生素C还原为还原型维生素C。因此，另吸取 0.5 mL 滤液，加入1.00 mL 1%二硫苏糖醇溶液（DTT），反应还原 0.5 h 后，过0.45 μm 滤膜进样，同样按“1.3.1”节色谱条件进行测定，所测数值为样品溶液中的总维生素C量。
1.3.3 线性关系分析 准确称取50 mg维生素C，用1.5%偏磷酸溶液定容至100 mL棕色容量瓶中，得到500 mg/L维生素C标准储备液；将其逐级稀释得到50、10 mg/L标准溶液，过0.45 μm滤膜，调整进样量，稀释得到1、5、10、20、30、50、100、200、300、400、500 mg/L系列浓度对应的峰面积，以峰面积的积分值对进样浓度（mg/L）进行直线回归。 1.3.4 精密度试验 取所制得样品4个，重复进样5次，测定维生素C含量的精密度。
1.3.5 回收率试验 采用加标回收法，取2.00 mL匀浆样品，分别加入2.00 mL浓度为50、100、500 mg/L的維生素C标准品，重复进样3次，取3次测定的平均值作为测定结果。将测定结果扣除样品溶液的测定值，从而得到加入标准物质的回收率，其计算公式为：
回收率=（加标试样测定值-试样测定值）/加标量×100%。
1.3.6 最低检测限的计算 以产生3倍仪器噪声水平的进样量为检出限。
2 结果与分析
2.1 维生素C提取剂的选择
考察不同提取剂（3%草酸、3%偏磷酸）对维生素C峰型的影响，结果表明：当选择3%草酸作为本研究蔬菜样品提取剂时，出现维生素C峰尖圆滑不尖锐、基线不平等现象；而以3%偏磷酸作为提取剂能够得到更好的峰形（图1），因此选择3%偏磷酸作为蔬菜样品提取剂。
2.2 流动相的选择
考察乙腈-0.015 mol/L NH4H2PO4不同比例（体积比 50 ∶ 50、75 ∶ 25、85 ∶ 15）对检测时维生素C的峰形、保留时间等出峰情况的影响。结果表明：当选择乙腈-0.015 mol/L NH4H2PO4（体积比85 ∶ 15）作为流动相时，不仅出峰时间提前，峰形也更好，也不存在峰形重叠等问题，因此选择乙腈-0.015 mol/L NH4H2PO4（体积比85 ∶ 15）作为流动相。
2.3 色谱条件的选择
用Waters 2998 PAD紫外检测器检测发现，维生素C在245～255 nm波长下吸光度较高，在254 nm吸光度最大，因此选择254 nm作为检测波长。在超过样品的检测时间（4 min）后的6 min内，没有发现有明显的信号强度，因此确定样品检测时间为4 min。由图2可以看出，所有样品均能实现基线分离，而且峰形能满足测定要求，维生素C的保留时间为0.866～0.929 min，检测限为0.86 μg/L。
2.4 标准工作曲线
以1、5、10、20、30、50、100、200、300、400、500 mg/L系列浓度对应峰面积的积分值对进样浓度（mg/L）进行直线回归。以浓度（x，mg/L）为自变量、峰面积（y）为因变量，方程式：y=167 33x-262 03，r=0.999 6，说明标准曲线在1～500 mg/L范围内线性良好，维生素C标准品的色谱结果见图2，标准曲线见图3。
2.5 蔬菜中维生素C含量的测定
由图4、图5可以看出，经过DTT的还原，总维生素C的峰高高于还原型维生素C。由表1小白菜、番茄中还原型维生素C、总维生素C、氧化型维生素C的检测结果可见，各提取液中维生素C的保留时间在0.898～ 0.995 min。
2.6 精密度试验
对同一小白菜、番茄提取液分别连续进样5次，由表2可见，精密度试验标准差为0.49～3.29，变异系数为0.63%～1.83%，表明该方法重现性较好。
2.7 回收率试验
各取3份2 mL维生素C含量为25.106 mg/kg的小白菜提取液、维生素C含量为18.248 mg/kg的番茄提取液，分别加入2 mL不同浓度的维生素C标准液，测定混合液中维生素C含量，每种混合液测定3次，取其平均值。由表3可见，回收率范围为96.58%～103.59%，平均回收率为99.89%。
3 讨论与结论
维生素C在pH值>7.6以上的溶液中非常不稳定，但是在pH值<4的酸性溶液中较稳定，3%草酸、3%偏磷酸皆满足pH值
磷酸与维生素C的这些特点，本研究采用3%偏磷酸提取番茄、小白菜中的维生素C后，其峰形更为尖锐、基线相对平稳，可见以3%偏磷酸作为提取剂能够得到更好的峰形。但是，由于偏磷酸不稳定，需要现配现用才能保证提取效果。
利用高效液相色谱与二硫苏糖醇还原维生素C相结合，对小白菜、番茄的还原型维生素C、总维生素C含量进行测定。结果表明，新鲜小白菜中含有还原型维生素C含量为 62.297 mg/100 g，总维生素C含量为273.390 mg/100 g；新鲜番茄中还原型维生素C含量为45.888 mg/100 g，总维生素C含量为197.406 mg/100 g。总维生素C、还原型维生素C二者之差为脱氢型维生素C，本研究中小白菜、番茄的脱氢型维生素C含量分别为211.092、151.518 mg/100 g。可以看出，在本研究的小白菜、番茄中，脱氢型维生素C含量在总维生素C含量中占很大的比重，而脱氢型维生素C与还原型维生素C同样具有生理功能，对人体健康的贡献不可忽视。本研究认为，只利用高效液相色谱法测定的还原型维生素C不足以说明蔬菜中维生素C的营养状态，应利用二硫苏糖醇的还原作用，得到的总维生素C含量更能表征蔬菜的营养价值。
本研究标准工作曲线的相关系数r=0.999 6，曲线在1～500 mg/L范围内线性良好，说明曲线的线性关系较好，且测定浓度范围较广，分析中受样品中其他杂质的影响较小。测定小白菜、番茄中维生素C的含量，回收率为96.58%～10359%，说明该方法具有所需试剂少、稳定、操作简便等特点。从本研究还可以看出，精密度试验的相对标准偏差小于2%，说明该方法重复性、再现性都是比较高的；而且从样品色谱图中看出，该方法分析维生素C的含量大约需要3 min，具有灵敏、快速的特点。本研究所用的这个分析方法是可靠的，它适用于维生素C含量范围较大及颜色各异的广泛蔬菜中还原型维生素C、总维生素C含量的测定。
参考文献：
[1]郝学宁，郝嫱嫱，刘雪莲. HPLC法测定果蔬中维生素C[J]. 现代农业科技，2011（3）：30-31. [2]王立家，李宽阁，刘淑兰，等. 维生素C的营养功能及应用[J]. 畜牧兽医科技信息，2009（2）：106-107.
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关键词：高效液相色谱法（HPLC）；二流苏糖醇（DDT）；蔬菜；总维生素C；还原型维生素C
中图分类号： S132；O652.63 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2016）07-0304-03
维生素C是一种人类必需的营养素[1]，其主要形式为L-还原型、L-脱氢型，最主要的功能是参与胶原蛋白质的合成，动物缺乏维生素C会造成坏血病[2]。作为一种抗氧化剂和高活性物质，维生素C参与许多新陈代谢过程，可以保护人体免于自由基的威胁，具有提高免疫力，预防癌症、心脏病、中风，保护牙齿和牙龈，抗衰老等许多生理作用[2-4]。有研究表明：一定剂量的维生素C可抗细胞DNA损伤[5]；在老鼠铅中毒的同时及其后，补充维生素C可降低血铅浓度[6]；此外，维生素C还具有预防乙醇对脑、肝损伤的作用[7]。人类自身不能够制造维生素C，其广泛的食物来源为各类新鲜果蔬，并且蔬菜中的总维生素C含量相比还原型维生素C更能够表征蔬菜的营养价值。因此，建立能够快速检测蔬菜中总维生素C含量的方法十分重要，能为人们的膳食营养提供更为确切的参考，从而有效预防和抵制因体内缺少维生素C而带来的不利影响，提高人们的工作效率和生活质量。
维生素C的测定方法有多种，各有优缺点。如《中华人民共和国药典》规定的碘量法因其试验操作时不易把握酸度、碘易挥发等，使得测定结果准确度降低，不适于微量分析；而大多数水果、蔬菜的提取液具有一定色泽，又使得以颜色变化来辨别其滴定终点的国标法2，6-二氯靛酚滴定法（GB/T 6195—1986《水果、蔬菜维生素C含量测定法（2，6-二氯靛酚滴定法）》）具有一定的局限性；此外，还包括容量法、苯肼比色法、荧光光度法、电位法、紫外分光光度法等，但是这些方法或存在所需试剂较多、试剂不稳定、操作繁琐等缺点[8-10]，或只能测定还原型维生素C含量，不能测定具有同样生理功能的脱氢型维生素C含量，如荧光法、苯肼比色法[11]。
高效液相色谱（HPLC）是近年来发展起来的一种快速高效且稳定可靠、发展较快的分离技术，因其处理样品简单快速，且能同时测定几种维生素而被广泛应用于食品药品中维生素含量的测定[8-17]。但是，该方法目前主要测定的是还原型维生素C[11]，而对蔬菜中同样具有生理功能的脱氢型维生素C含量的检测报道较少。本研究通过利用二硫苏糖醇（DTT）能够将脱氢型维生素C还原而不具有生理活性的二酮古洛糖酸则不会被还原[17-18]，并且与高效液相色谱法结合，可测定出还原型维生素C、总维生素C含量，从而得出脱氢型维生素C含量，以总维生素C含量表征蔬菜的营养价值更为准确。
1 材料与方法
1.1 试剂与材料
乙腈，色谱纯；磷酸二氢铵，分析纯；维生素C标准品，分析纯，维生素C含量≥99.7%，国药集团化学试剂有限公司；偏磷酸，分析纯；二硫苏糖醇（DTT）；超纯水，笔者所在实验室自制；0.45 μm滤膜，国药集团化学试剂有限公司。小白菜、番茄，市购。
1.2 仪器与设备
Waters e2695型高效液相色谱，美国；Waters DELTA-PAK C18色谱柱，日本；Waters 2998 PAD紫外檢测器；DP-01隔膜真空泵，天津市东康科技有限公司；KQ2200型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；MILLI-Q型超纯水装置。
1.3 试验方法
1.3.1 色谱条件 Waters DELTA-PAK C18色谱柱，柱长150 mm，内径3.9 mm，颗粒大小5 μm；检测波长为254 nm。根据本试验高效液相色谱仪的性能特点，选择乙腈 -0.015 mol/L NH4H2PO4（体积比85 ∶ 15）作为流动相；流速为1.5 mL/min，进样量10 μL，柱温25 ℃；以保留时间定性，待液相色谱稳定后进样分析，以峰面积定量。
1.3.2 样品制备 称取新鲜小白菜、番茄样品各4.00 g，迅速剪碎后加入少量3%偏磷酸研磨制成匀浆，用3%偏磷酸定容至100 mL棕色容量瓶中，过滤，再吸取一部分滤液过 0.45 μm 微孔滤膜，然后按“1.3.1”节色谱条件进行HPLC测定，所得数值为还原型维生素C含量。脱氢型维生素C含量=维生素C总量-还原型维生素C含量，前提是将样品中脱氢型维生素C还原为还原型维生素C。因此，另吸取 0.5 mL 滤液，加入1.00 mL 1%二硫苏糖醇溶液（DTT），反应还原 0.5 h 后，过0.45 μm 滤膜进样，同样按“1.3.1”节色谱条件进行测定，所测数值为样品溶液中的总维生素C量。
1.3.3 线性关系分析 准确称取50 mg维生素C，用1.5%偏磷酸溶液定容至100 mL棕色容量瓶中，得到500 mg/L维生素C标准储备液；将其逐级稀释得到50、10 mg/L标准溶液，过0.45 μm滤膜，调整进样量，稀释得到1、5、10、20、30、50、100、200、300、400、500 mg/L系列浓度对应的峰面积，以峰面积的积分值对进样浓度（mg/L）进行直线回归。 1.3.4 精密度试验 取所制得样品4个，重复进样5次，测定维生素C含量的精密度。
1.3.5 回收率试验 采用加标回收法，取2.00 mL匀浆样品，分别加入2.00 mL浓度为50、100、500 mg/L的維生素C标准品，重复进样3次，取3次测定的平均值作为测定结果。将测定结果扣除样品溶液的测定值，从而得到加入标准物质的回收率，其计算公式为：
回收率=（加标试样测定值-试样测定值）/加标量×100%。
1.3.6 最低检测限的计算 以产生3倍仪器噪声水平的进样量为检出限。
2 结果与分析
2.1 维生素C提取剂的选择
考察不同提取剂（3%草酸、3%偏磷酸）对维生素C峰型的影响，结果表明：当选择3%草酸作为本研究蔬菜样品提取剂时，出现维生素C峰尖圆滑不尖锐、基线不平等现象；而以3%偏磷酸作为提取剂能够得到更好的峰形（图1），因此选择3%偏磷酸作为蔬菜样品提取剂。
2.2 流动相的选择
考察乙腈-0.015 mol/L NH4H2PO4不同比例（体积比 50 ∶ 50、75 ∶ 25、85 ∶ 15）对检测时维生素C的峰形、保留时间等出峰情况的影响。结果表明：当选择乙腈-0.015 mol/L NH4H2PO4（体积比85 ∶ 15）作为流动相时，不仅出峰时间提前，峰形也更好，也不存在峰形重叠等问题，因此选择乙腈-0.015 mol/L NH4H2PO4（体积比85 ∶ 15）作为流动相。
2.3 色谱条件的选择
用Waters 2998 PAD紫外检测器检测发现，维生素C在245～255 nm波长下吸光度较高，在254 nm吸光度最大，因此选择254 nm作为检测波长。在超过样品的检测时间（4 min）后的6 min内，没有发现有明显的信号强度，因此确定样品检测时间为4 min。由图2可以看出，所有样品均能实现基线分离，而且峰形能满足测定要求，维生素C的保留时间为0.866～0.929 min，检测限为0.86 μg/L。
2.4 标准工作曲线
以1、5、10、20、30、50、100、200、300、400、500 mg/L系列浓度对应峰面积的积分值对进样浓度（mg/L）进行直线回归。以浓度（x，mg/L）为自变量、峰面积（y）为因变量，方程式：y=167 33x-262 03，r=0.999 6，说明标准曲线在1～500 mg/L范围内线性良好，维生素C标准品的色谱结果见图2，标准曲线见图3。
2.5 蔬菜中维生素C含量的测定
由图4、图5可以看出，经过DTT的还原，总维生素C的峰高高于还原型维生素C。由表1小白菜、番茄中还原型维生素C、总维生素C、氧化型维生素C的检测结果可见，各提取液中维生素C的保留时间在0.898～ 0.995 min。
2.6 精密度试验
对同一小白菜、番茄提取液分别连续进样5次，由表2可见，精密度试验标准差为0.49～3.29，变异系数为0.63%～1.83%，表明该方法重现性较好。
2.7 回收率试验
各取3份2 mL维生素C含量为25.106 mg/kg的小白菜提取液、维生素C含量为18.248 mg/kg的番茄提取液，分别加入2 mL不同浓度的维生素C标准液，测定混合液中维生素C含量，每种混合液测定3次，取其平均值。由表3可见，回收率范围为96.58%～103.59%，平均回收率为99.89%。
3 讨论与结论
维生素C在pH值>7.6以上的溶液中非常不稳定，但是在pH值<4的酸性溶液中较稳定，3%草酸、3%偏磷酸皆满足pH值
磷酸与维生素C的这些特点，本研究采用3%偏磷酸提取番茄、小白菜中的维生素C后，其峰形更为尖锐、基线相对平稳，可见以3%偏磷酸作为提取剂能够得到更好的峰形。但是，由于偏磷酸不稳定，需要现配现用才能保证提取效果。
利用高效液相色谱与二硫苏糖醇还原维生素C相结合，对小白菜、番茄的还原型维生素C、总维生素C含量进行测定。结果表明，新鲜小白菜中含有还原型维生素C含量为 62.297 mg/100 g，总维生素C含量为273.390 mg/100 g；新鲜番茄中还原型维生素C含量为45.888 mg/100 g，总维生素C含量为197.406 mg/100 g。总维生素C、还原型维生素C二者之差为脱氢型维生素C，本研究中小白菜、番茄的脱氢型维生素C含量分别为211.092、151.518 mg/100 g。可以看出，在本研究的小白菜、番茄中，脱氢型维生素C含量在总维生素C含量中占很大的比重，而脱氢型维生素C与还原型维生素C同样具有生理功能，对人体健康的贡献不可忽视。本研究认为，只利用高效液相色谱法测定的还原型维生素C不足以说明蔬菜中维生素C的营养状态，应利用二硫苏糖醇的还原作用，得到的总维生素C含量更能表征蔬菜的营养价值。
本研究标准工作曲线的相关系数r=0.999 6，曲线在1～500 mg/L范围内线性良好，说明曲线的线性关系较好，且测定浓度范围较广，分析中受样品中其他杂质的影响较小。测定小白菜、番茄中维生素C的含量，回收率为96.58%～10359%，说明该方法具有所需试剂少、稳定、操作简便等特点。从本研究还可以看出，精密度试验的相对标准偏差小于2%，说明该方法重复性、再现性都是比较高的；而且从样品色谱图中看出，该方法分析维生素C的含量大约需要3 min，具有灵敏、快速的特点。本研究所用的这个分析方法是可靠的，它适用于维生素C含量范围较大及颜色各异的广泛蔬菜中还原型维生素C、总维生素C含量的测定。
参考文献：
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